(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu sự lưu hành của fowl adenovirus (fadv) ở gà nuôi tại hà nội và vùng phụ cận

Trong số các bệnh gây suy giảm miễn dịch cho đàn gà phải kể đến như Gumboro infectious bursal disease, IBD, Marek’s, Leukosis, bệnh thiếu máu truyền nhiễm chicken infectious anemia, CIA

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ HÀ THU

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH

CỦA FOWL ADENOVIRUS (FAdV) Ở GÀ NUÔI

TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hà Thu

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn vi sinh - truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo Đội Kiểm Dịch Động Vật Lưu Động – Chi Cục Thú Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hà Thu

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1

Phần 2 Tổng quan tài liệu 2

2.1 Giới thiệu chung về fowl adenovirus (adenovirus ở gia cầm) 2

2.1.1 Hình thái, cấu trúc 3

2.1.2 Cơ chế sinh bệnh 3

2.1.3 Đường truyền lây 4

2.1.4 Sức đề kháng 4

2.1.5 Chẩn đoán 4

2.2 Hiểu biết về bệnh do fadv gây ra ở gà 5

2.2.1 Adenovirus nhóm I (conventional adenovirus) 5

2.2.2 Adenovirus nhóm II 15

2.2.3 Adenovirus nhóm III: (virus gây hội chứng giảm đẻ ở gà) 20

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23

3.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.2 Nội dung nghiên cứu 23

3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

3.4 Vật liệu nghiên cứu 23

3.5 Phương pháp nghiên cứu 24

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu 24

3.5.2 Phương pháp tách và tinh sạch ADN tổng số 24

3.5.3 Phương pháp tối ưu phản ứng PCR phát hiện FAdV 25

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử 27

3.5.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4 27

Phần 4 Kết quả và thảo luận 29

4.1 Kết quả xác định sự lưu hành fadv ở đàn gà nuôi tại hà nội và vùng phụ cận 29

4.1.1 Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR 29

4.1.2 Tổng hợp tình hình thu thập mẫu phục vụ nghiên cứu 30

4.1.3 Kết quả PCR phát hiện FAdV trong mẫu bệnh phẩm 31

4.2 Kết quả giải trình tự gen hexon của fadv 33

4.2.1 Kết quả phân tích trình tự nucleotide gen hexon của FAdV 33

4.2.2 Kết quả phân tích trình tự amino acid của protein hexon 36

4.3 Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của fadv 38

4.3.1 Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV 38

4.3.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4 40

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

Tài liệu tham khảo 44

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

truyền nhiễm)

– viêm ngoại tâm mạc tích nước)

nước)

MDTC-RP19 Turkey lymphoblastoid B cell line, có nguồn gốc từ khối u

trong bệnh Marek’s (Tế bào dòng)

xuất huyết ở gà tây)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện và giải trình tự gen hexon của FAdV 25

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 26

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ mồi 26

Bảng 3.4 Trình tự hexon gen dùng trong nghiên cứu này 28

Bảng 4.1 Tổng hợp tình hình thu thập mẫu gà theo lứa tuổi 31

Bảng 4.2 Kết quả PCR phát hiện FAdV theo trại được kiểm tra 32

Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra FAdV ở các lứa tuổi gà 32

Bảng 4.4 Kết quả so sánh mức tương đồng nucleotide giữa 7 chủng FAdV 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Minh họa cấu trúc của Fowl adenovirus 3

Hình 2.2 Gan xuất huyết, sưng to, bở, có màu vàng 7

Hình 2.4 Gan xuất huyết điểm 8

Hình 2.5 Đôi khi xuất hiện nốt hoại tử ở gan 8

Hình 2.6 Thận sưng to, nhạt màu, xuất huyết 8

Hình 2.7 Xoang bao tim tích nước 8

Hình 2.8 Đôi khi quan sát được da có màu vàng, tụ máu hoặc xuất huyết thành vệt ở cơ 9

Hình 2.9 Gà chết đột ngột, phân có màu đen 17

Hình 2.10 Ruột non, đặc biệt là tá tràng có màu đỏ sẫm, mạch máu thường có dạng cành 17

Hình 2.11 Ruột non bị xuất huyết, hoại tử 18

Hình 2.12 Lách sưng to, xuất huyết, dễ nát, có điểm hoại tử 18

Hình 2.13 Bệnh tiến triển, lách gà bị teo nhỏ, có màu trắng xám 18

Hình 2.14 Gan sưng to, dễ nát, xuất huyết tập trung thành từng đám 19

Hình 2.15 Đôi khi gan bị hoại tử 19

Hình 2.16 Thận bị sưng to và xuất huyết 19

Hình 2.17 Mất màu vỏ trứng, trứng méo mó, kỳ hình 22

Hình 4.1 Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi của phản ứng PCR 29

Hình 4.2 Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng PCR 30

Hình 4.3 Minh họa kết quả phản ứng PCR phát hiện FAdV 31

Hình 4.4 Gan gà sưng to, xuất huyết 33

Hình 4.5 Lách sưng to 33

Hình 4.6 Kết quả giải trình tự phân đoạn gen hexon của 7 chủng FAdV phân lập 34

Hình 4.7 Trình tự gen hexon của 07 chủng FadV 35

Hình 4.8 Trình tự amino acid proteinhexon của 07 chủng FAdV 37

Hình 4.9 Đặc điểm thay đổi codon ở một số vùng ổn định của gen hexon 38

Hình 4.10 Cây phát sinh chủng loại của FAdV 39

Hình 4.11 Kết quả BLAST tìm kiếm trình tự gen tương đồng 99% với chủng F5 40

Hình 4.12 Đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian của các chủng FAdV4 41

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Hà Thu

Tên luận văn: “Nghiên cứu sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận”

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

- Xác định sự lưu hành của FAdV ở đàn gà thuộc địa bàn nghiên cứu

- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV

Nội dung nghiên cứu

Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, chúng tôi thực hiện các nội dung sau:

- Xác định sự lưu hành FAdV ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận

- Giải trình tự gen mã hóa protein hexon của FadV

- Phân tích một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của FadV

Phương pháp nghiên cứu:

- Phương pháp lấy mẫu

- Phương pháp tách và tinh sạch ADN tổng số

- Phương pháp tối ưu phản ứng PCR phát hiện FadV

- Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV serotype 4 Kết quả chính và kết luận:

- Đã xác định được sự có mặt của FAdV lưu hành ở đàn gà tại các địa bàn nghiên cứu, với tỷ lệ dương tính là 20,97%

- Gà ở lứa tuổi từ 3- 5 tuần dương tính FAdV với tỷ lệ cao nhất theo đàn là 85,71% và theo cá thể là 30,56%

- Các chủng FAdV lưu hành ở Hà Nội và vùng phụ cận tương đối đa dạng về mặt

di truyền

- Chủng FAdV thuộc serotype 4 lưu hành ở miền Bắc Việt Nam sớm nhất vào khoảng năm 2005 và gần gũi về mặt di truyền với nhánh virus lưu hành ở Ấn Độ hơn các nhánh lưu hành ở Trung Quốc

THESIS ABSTRACT

Name of Master student: Nguyen Thi Ha Thu

Thesis title: “Research on the prevalence of Fowl Adenovirus (FAdV) chicken faems

of Hanoi and neiyhborin proninces”

Major: Veterinary Medicine Code: 60.64.01.01

Name of Institute: Vietnam National University of Agriculture

- Sequencing protein hexon gene of FAdV

- Analysis the hexon some of FAdV

Research methodology:

- Sampling method

- Method of total separation and purification of ADN

- PCR for identifying FadV

- Molecular phylogenetic analysis method of FAdV serotype 4

- FAdV strains in Hanoi and surrounding presented high genetic diversity

- Fowl adenovirus serotype 4 (FAdV-4) circulated in northern Vietnam in early

2005, and is genetically closer to the group of virus in India than those in China

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Năm 2014 tổng đàn gia cầm cả nước đạt 328,1 triệu con Ước tính tổng số gia cầm của cả nước năm 2016 đạt 341,5 triệu con, tăng 4,3% so với năm 2015; hiện nay tăng khoảng 3,2-3,8% so với cùng kỳ năm 2016 Ngành chăn nuôi gia cầm trong những năm gần đây không ngừng phát triển, tuy vậy còn gặp không ít khó khăn Các trang trại chăn nuôi gia cầm với quy mô vừa và lớn mặc dù đã hình thành tại một số vùng sinh thái, song chiếm tỷ lệ chưa cao, thị trường tiêu thụ sản phẩm chăn nuôi gia cầm còn khó khăn, cơ sở hạ tầng và dịch vụ chăn nuôi nhìn chung còn thấp kém, hầu hết chưa đảm bảo quy trình kỹ thuật Hiện nay ngành chăn nuôi gà đang phải đối mặt với tình hình dịch bệnh diễn biến rất phức tạp, trong đó có nhiều bệnh mới nổi, gây thiệt hại kinh tế Đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh gây ức chế miễn dịch khiến cho sức đề kháng của gà giảm, rất

dễ mắc các bệnh kế phát Trong số các bệnh gây suy giảm miễn dịch cho đàn gà phải kể đến như Gumboro (infectious bursal disease, IBD), Marek’s, Leukosis, bệnh thiếu máu truyền nhiễm (chicken infectious anemia, CIA) và bệnh do adenovirus gây ra…

Trong các nguyên nhân kể trên, theo hiểu biết của chúng tôi, tại Việt Nam chưa có công bố nào về nghiên cứu sự lưu hành của FAdV ở đàn gà và bệnh do virus này gây ra Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu đề tài Nghiên cứu sự lưu hành của Fowl Adenovirus (FAdV) ở gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận nhằm làm sáng tỏ vấn đề trên

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định sự lưu hành của FAdV ở đàn gà thuộc địa bàn nghiên cứu

- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của FadV

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

- Là nghiên cứu đầu tiên về sự lưu hành FAdV ở đàn gà nuôi tại địa bàn nghiên cứu;

- Kết quả nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học phân tử của FAdV là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về FAdV cũng như các virus gây ức chế miễn dịch ở gà

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ FOWL ADENOVIRUS (adenovirus ở gia cầm) Adenovirus là một tác nhân gây bệnh chủ yếu ở gà Hầu hết các chủng thuộc họ virus này đều có khả năng nhân lên trong cơ thể gà khỏe mạnh, có thể không gây bệnh, và rất có thể trở thành tác nhân gây bệnh nếu có các yếu tố đồng nhiễm hoặc yếu tố stress khiến cho sức đề kháng của cơ thể gà giảm Tuy nhiên, một số loài Adenovirus như virus gây bệnh xuất huyết ruột ở gà tây, virus gây bệnh viêm phế quản chim cút và virus gây hội chứng giảm đẻ là tác nhân gây bệnh tiên phát

Loài Adenovirus phân lập được ở gà vào năm 1949 khi gây nhiễm phôi gà

sử dụng bệnh phẩm của bò mắc bệnh u da Chủng Adenovirus được Olson lần đầu tiên phân lập được từ chim cút mắc bệnh đường hô hấp

Fowl adenovirus (FAdV) được xếp vào giống Aviadenovirus và họ Adenoviridae Adenovirus ở gà (avian adenovirus) được chia thành 3 nhóm là nhóm I, II và III Nhóm adenovirus I được chia nhỏ thành 5 loài và 12 serotype dựa vào phản ứng cắt men giới hạn và phản ứng trung hòa chéo; cụ thể là loài A (serotype 1), loài B (serotype 5), loài C (serotype 4 và 10), loài D (serotype 2, 3,

9 và 11) và loài E (serotype 6, 7, 8a và 8b)

Nhóm I, hay là một adenovirus thường, mang một kháng nguyên nhóm chung khác với nhóm kháng nguyên của adenovirus động vật có vú Các virus này nhân lên rất nhanh trong môi trường tế bào của gà và đã phân lập được từ gà,

gà tây, ngỗng, vịt, chim cút, bồ câu, đà điểu và một số loài gia cầm khác FAdV

có thể chia thành ít nhất 12 serotype, không chỉ gây bệnh cho gà mà còn gây bệnh cho nhiều loài khác Gà tây, ngỗng và vịt bị nhiễm bởi adenovirus không có khả năng nhân lên hoặc nhân lên kém trên môi trường tế bào gà mà cần loại tế bào đồng chủng Đã có ít nhất 3 serotype phân lập được từ gà tây, và chúng chỉ phát triển trên môi trường tế bào gà tây; ngoài ra có 3 serotype khác phân lập từ ngỗng; 01 serotype phân lập từ ngan

Nhóm II, bao gồm virus gây bệnh viêm ruột xuất huyết ở gà tây (turkey heamorrahgic enteritis – THE), virus gây bệnh lách đá hoa (marble spleen disease – MSD) và virus gây chứng to lách ở gà (group II splenormegaly of chicken) Các virus này mang kháng nguyên chung khác với adenovirus của động vật có vú và adenovirus gà nhóm I

Nhóm III gồm virus gây chứng giảm đẻ ở gà (egg drop syndrome – EDS) phân bố rộng rãi ở đàn thủy cầm nhưng có khả năng gây bệnh dễ dàng cho gà, gà mắc bệnh đẻ ra trứng có vỏ không bình thường

Hiện nay họ Adenoviridae được chia thành 2 giống gồm Mastadenovirus (gồm các chủng gây bệnh ở động vật có vú, bao gồm cả người) và Adenovirus Giống thứ 3 được đề xuất trong phân loại là Atadenovirus bao gồm adenovirus gây bệnh ở bò (bovine adenovirus 5, 6, 7 và 8); adenovirus gây bệnh ở cừu (ovine adenovirus chủng 287) Hiện nay vị trí phân loại của virus gây bệnh ở gà (THE/MSD) vẫn chưa rõ ràng

2.1.1 Hình thái, cấu trúc

FAdV là những virus hình cầu, không có vỏ bọc bên ngoài, nhân là ADN sợi đôi với đường kính dao dộng từ 70 đến 90 nm Hạt virus bao gồm 252 capsomer sắp xếp theo 12 bề mặt hình tam giác với 6 capsomer theo chiều dài mép Adenovirus nhân lên trong nhân tế bào, hình thành thể bao hàm ái kiềm

Hình 2.1 Minh họa cấu trúc của Fowl adenovirus 2.1.2 Cơ chế sinh bệnh

Fowl adenovirus có mặt ở cả gia cầm khỏe và gia cầm ốm (Adair and Fitzgerald, 2008) Mặc dù hiện tượng suy giảm miễn dịch được coi là nguyên nhân dẫn đến gà mắc hội chứng viêm gan thể bao hàm (Inclusion body hepatitis – IBH), các vụ dịch vẫn xảy ra mà không tìm được tác nhân gây suy giảm miễn dịch Các yếu tố liên quan đến cơ chế sinh bệnh của Aviadenovirus hiện nay vẫn chưa rõ ràng, nhiều nghiên cứu thử nghiệm cho biết nhiều loài adenovirus đòi hỏi sự có mặt của một số mầm bệnh khác mới gây nên bệnh

Ngưởi ta đã chứng minh được rằng sự có mặt của virus Gumboro, virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà khiến cho khả năng gây bệnh của adenovirus tăng lên, trong khi đó nếu có mặt của parvovirus sẽ làm giảm sự phát triển, khả năng gây bệnh cũng như khả năng phát bệnh ung thư của virus này trên môi trường tế bào (McFerran, 1981)

2.1.3 Đường truyền lây

Adenovirus có thể lây truyền dọc (Saif et al., 2008) hoặc truyền ngang (Akhtar, 1994) Virus này thường hoạt động trở lại trong giai đoạn gà đẻ với tỷ lệ

đẻ cao nhất do tác động bởi các yếu tố stress hoặc khi lượng hormone sinh dục rất cao ở thời điểm đó, dẫn đến tăng nguy cơ truyền bệnh cho đời sau Những con

gà mái mang virus sẽ có thể làm lây cho con con trong 3-6 tuần; tuy nhiên không

có bằng chứng cho thấy khả năng truyền dọc ở những con có miễn dịch (Philippe

et al., 2007) Theo đường truyền ngang, virus có thể lây qua phân, dịch nhớt khí quản, dịch mũi, nước tiểu, tinh dịch (Adair and Fitzgerald, 2008) Lây qua không khí cũng có thể xảy ra giữa các trại khi dọn dẹp chuồng sau mỗi lứa nuôi gà Thời gian nung bệnh của virus dao động từ 24 đến 48 giờ

2.1.4 Sức đề kháng

Adenovirus không bị tiêu diệt bởi các chất làm tan mỡ (như ether và chloroform), NaOH, trypsin, phenol 2% hoặc cồn 50% (Adair and Fitzgerald, 2008) Virus tồn tại ở pH dao động từ 3 đến 9 và chỉ bị bất hoạt bởi formaldehyde 1‰ Chất ức chế NAD (IuDR và BuDR) ngăn cản sự nhân lên của adenovirus Virus có khả năng chịu được nhiệt độ khác nhau dao động từ 56 đến

700C trong 30 phút, trong đó adenovirus ở gia cầm dường như chịu nhiệt tốt hơn

so với adenovirus ở động vật có vú Trong xác gia cầm chết, virus có thể tồn tại

và gây bệnh trong vòng 20 ngày

2.1.5 Chẩn đoán

Để chẩn đoán có thể phân lập virus, sử dụng phản ứng PCR, phản ứng huyết thanh học như miễn dịch huỳnh quang, phản ứng ELISA, phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch

Phản ứng PCR là một trong các phương pháp được lựa chọn để xác định sự

có mặt của FAdV trong khi đó các phản ứng huyết thanh học không có giá trị trong chẩn đoán do kháng thể lưu hành phổ biến trong đàn Phản ứng trung hòa virus hoặc phản ứng khuếch tán kép được sử dụng phổ biến để phân biệt các nhóm (subgroup) và serotype của FAdV (McFerran et al., 1972; Kefford et al., 1980)

Môi trường tế bào phù hợp để phân lập virus là tế bào thận gà hoặc gan phôi gà, trong đó môi trường tế bào gan phôi gà thường được lựa chọn do virus mẫn cảm hơn (Adair and Fitzgerald, 2008) Khi tiêm cho phôi gà để phân lập virus, đường tiêm là màng nhung niệu phù hợp hơn khi tiêm vào xoang niệu mô (Kawamura and Horiuchi, 1964)

2.2 HIỂU BIẾT VỀ BỆNH DO FAdV GÂY RA Ở GÀ

2.2.1 Adenovirus nhóm I (conventional adenovirus)

Adenovirus phân bố rộng rãi ở đàn gà, có thể phân lập được từ gia cầm khỏe hoặc gia cầm bệnh Ngoài ra chúng còn phân lập từ gà tây, ngỗng, vịt, bồ câu, chim vẹt đuôi dài ở Úc, vịt trời và có những bằng chứng cho thấy virus lưu hành ở mòng biển, con cú, diều hâu

Đường truyền dọc là đường truyền lây rất quan trọng Gà con nở ra từ những quả trứng bị nhiễm bệnh có thể thải virus qua phân ngay từ khi mới nở nhưng phần lớn sẽ thải virus từ tuần tuổi thứ 2-4; hiện tượng tái kích hoạt bài thải virus tiềm ẩn chỉ xảy ra khi hàm lượng kháng thể thụ động giảm xuống Những đàn gà broiler có nguồn gốc khác nhau sẽ có nguy cơ hình thành chủng virus mới cũng như hiện tượng đồng nhiễm nhiều chủng virus Tốc độ lây lan của virus theo đường này dẫn đến kết quả lượng virus bài thải cao nhất từ tuần 4-6 Trong một nghiên cứu thực hiện với đàn gà hậu bị thấy lượng virus bài thải lớn nhất trong thời gian giữa tuần thứ 5-9 nhưng có đến 70% gà vẫn thải virus đến tuần 14 Kết quả của một nghiên cứu khác cho biết virus bài thải nhiều đến tuần 14, có 8 serotype phân lập được từ

7 trại và gia cầm có thể bài thải virus suốt cả đời Sau giai đoạn bài thải, virus sẽ ở dạng tiềm ẩn, có thể do kháng thể sản sinh Khi miễn dịch của cơ thể giảm, sau 8-

12 tuần, virus thoát ra và lại bài thải Kháng thể dịch thể không đóng vai trò ngăn cản sự bài thải virus do đó thấy gia cầm trưởng thành vẫn thải virus mặc dù hàm lượng kháng thể trung hòa với một số serotype rất cao; nhưng có thể ngăn không cho nhiễm serotype khác Adenovirus thường phân lập được từ đàn gà đẻ khi tỷ lệ

đẻ cao nhất, khiến cho virus có thể truyền dọc qua trứng cho con con

Ngoài truyền dọc qua trứng, đường truyền ngang cũng quan trọng Virus được thải qua phân với số lượng rất lớn, ngoài ra virus còn nhân lên với số lượng lớn ở dịch mũi, khí quản, màng kết và thận nên có thể thải qua chất bài xuất, bài tiết của con vật.Virus còn được thải qua tinh dịch, là đường truyền lây rất nguy hiểm Hiện tượng thải virus qua phân thay đổi từ con non đến con trưởng thành, trong đó thời gian thải lượng lớn virusở con non kéo dài hơn con trưởng thành

Virus có thể truyền lây giữa các đàn qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp qua người, dụng cụ chăn nuôi, phương tiện vận chuyển, khay ấp trứng… Lây qua không khí cũng có thể xảy ra

Bệnh lây lan nhanh trong đàn, và thường do có sự kích hoạt của virus tiềm ẩn vì khi gây nhiễm đàn gà sạch bệnh với số lượng nhỏ virus, tốc độ lây truyền sẽ rất chậm Ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

Adenovirus nhóm I thường không gây bệnh cho động vật có vú nên không ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng

Virus phân bố rộng rãi và độc lực của của chúng rất khác nhau Nhiều trường hợp nhiễm bệnh ở thể ẩn, có thể do độc lực của virus thấp hoặc có thể gà

bị nhiễm virus khi vẫn còn kháng thể thụ động Tuy nhiên, vì hiện tượng nhiễm adenovirus tiềm ẩn thường xảy ra trong giai đoạn gà 2-3 tuần tuổi và gà đẻ khi tỷ

lệ đẻ cao nhất, adenovirus thường liên quan đến bệnh đường hô hấp, bệnh đường tiêu hóa, hiện tượng giảm đẻ, ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa thức ăn và viêm khớp ở gà Trong hầu hết các trường hợp, adenovirus đóng vai trò là mầm bệnh cộng phát hoặc kế phát mà ít khi là nguyên nhân nguyên phát Hiện nay người cho cho rằng adenovirus là một tác nhân quan trọng gây bệnh ở gà như sau: 2.2.1.1 Bệnh viêm gan thể bao hàm

Ở gà broiler, FAdV4 là nguyên nhân gây nên bệnh viêm gan thể bao hàm (Inclusion body hepatitis – IBH), hội chứng xoang bao tim tích nước (hydropericardium syndrome – HPS), bệnh sói mòn dạ dày (gizzard erosion) và viêm sưng dây chằng, viêm khớp (tenosynovitis) (Saif et al., 2008)

Bệnh viêm gan thể bao hàm ở gà được mô tả lần đầu tiên tại Mỹ vào năm

1963 (Helmboldt and Frazier, 1963) Từ đó đến nay, bệnh được ghi nhận ở nhiều nơi trên thế giới như Canada, Anh, Úc, Italia, Pháp và Ailen (Howell et al., 1970)

và hiện nay ngày càng có dấu hiệu cho thấy bệnh đang tiếp tục gia tăng (McFerran and Smyth, 2000) Bệnh ảnh hưởng đến gà broiler từ 3 - 7 tuần tuổi (Winterfield et al., 1973), mặc dù gà nhỏ 7 ngày tuổi (Barr and Scott, 1988) hoặc gà lớn 20 tuần tuổi (Jones and Goergiou, 1984) cũng có thể bị mắc Một số đàn gà giống cũng có thể bị mắc bệnh trong giai đoạn quá độ từ giai đoạn gà dò

Triệu chứng đầu tiên có thể quan sát được khi bị bệnhlà gà bị xù lông, gập đầu

về phía trước và chết đột ngột (Macpherson et al., 1974; McFerran et al., 1976; Hess, 2000; Adair and Fitzgerald, 2008) Những con còn lại có thể không có triệu

chứng hoặc giảm khả năng tăng trọng (Saif et al., 2008) Tỷ lệ ốm do IBH thường thấp (Howell, 1970, Macpherson et al., 1974, McFerran et al., 1976); tỷ lệ chết thường khoảng từ 5-10% nhưng đôi khi có thể lên đến 30% (Barr and Scott, 1988) Khi mổ khám, gan gà bị nhạt màu, sưng to và xuất huyết (Pattison et al., 2008) Hiện tượng thiếu máu, hoàng đản da và mỡ ở tổ chức dưới da, xuất huyết các khí quan cũng được mô tả Kiểm tra bệnh tích vi thể thấy viêm gan và viêm tụy với sự thâm nhiễm của thể bao hàm có nhân bạch cầu ái toan trong tế bào gan

và tụy (Pattison et al., 2008)

Nhiều vụ dịch IBH đã được ghi nhận tại Úc (Barr and Scott, 1988), New Zealand (Christensen and Saifuddin, 1989) và Canada (Ojkic et al., 2008) Tại

Úc, tỷ lệ chết lên đến 30% ở gà dưới 3 tuần tuổi Tại New Zealand các vụ dịch xảy ra phần lớn liên quan đến FAdV-08, mặc dù cũng phân lập được FAdV-01

và FAdV-12 Tuy nhiên ở các hai quốc gia này khi dịch xảy ra đều có liên quan đến FAdV loài C (Barr and Scott, 1988; Christensen and Saifuddin, 1989) Trong khi đó tại Canada, FAdV-02, FAdV-08 và FAdV-11 được xác định là nguyên nhân gây nên các vụ dịch IBH (Ojkic et al., 2008)

Hình 2.2 Gan xuất huyết, sưng to, bở, có màu vàng

Hình 2.3 Các điểm xuất huyết dày và thành vệt ở gan

Hình 2.4 Gan xuất huyết điểm

Hình 2.5 Đôi khi xuất hiện nốt

hoại tử ở gan

Hình 2.6 Thận sưng to, nhạt màu, xuất huyết

Hình 2.7 Xoang bao tim tích nước

Hình 2.8 Đôi khi quan sát được da có màu vàng, tụ máu hoặc xuất

huyết thành vệt ở cơ Các yếu tố nguy cơ gây bệnh viêm gan thể bao hàm

Hiện tượng suy giảm miễn dịch do nhiễm virus Gumboro (IBDV) được coi

là nguyên nhân khiến cho FAdV có khả năng gây bệnh viêm gan thể bao hàm (Rosenberger et al., 1975; Fadly et al., 2008) Phân tích dữ liệu thu thập được từ các ổ dịch IBH năm 2007 xảy ra ở một số trang trại gà broiler ở vùng Missisippi (Mĩ) cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa IBH và IBDV nhưng không thấy sự liên hệ giữa IBH và CAV (Sentíes-Cué et al., 2010) Tuy nhiên, IBH được ghi nhận ở vùng bắc Ailen và Newzealand trước khi bệnh Gumboro xuất hiện ở những nước này (Christensen and Saifuddin, 1989); tại đây các ca bệnh IBH được ghi nhận xảy ra ở những con gà không mang IBDV (Reece et al., 1986) Tại miền Tây Canada, một nghiên cứu được thực hiện để kiểm tra liệu có mối liên quan giữa gì IBH và sự nhiễm IBDV và CAV hay không; đồng thời xác định serotype adenovirus nào có liên quan đến IBH (Gomis et al., 2006) Mẫu huyết thanh được thu thập từ 17 giống gà broiler và gà con của chúng lấy trong giai đoạn ấp nở và giết thịt Trong khi nuôi, tỷ lệ chết hàng ngày được ghi chép với tất cả 31 đàn broiler có nguồn gốc từ các đàn giống kể trên Bệnh IBH được chẩn đoán bằng cách mổ khám gà chết với bệnh tích đại thể đặc trưng là gan bị hoại tử Mẫu bệnh phẩm là gan gà chết nghi do IBH được lấy để xác định sự có mặt của CAV và IBDV bằng phản ứng ELISA Trong số 31 đàn kiểm tra, không tìm thấy mối liên hệ nào giữa IBH với sự có mặt của hai virus này Các serotype FAdV-07, FAdV-08a, FAdV-08b và FAdV-11 đã phân lập được từ đàn gà bệnh Kết quả của nghiên cứu này cho thấy tại miền Tây Canada, IBH là bệnh tiên phát

và bệnh xảy ra không phụ thuộc hoặc liên quan đến sự có mặt của một số virus gây suy giảm miễn dịch

Tại một đảo phía Nam của Newzealand, một vụ dịch IBH được mô tả xảy

ra ở 1 đàn gà broiler trong thời gian 3 tháng từ tháng 6 năm 1987 (Christensen and Saifuddin, 1989) Kết quả nghiên cứu cho biết có mối liên hệ chặt chẽ giữa nguy cơ bùng phát IBH ở đàn gà broiler với sức đề kháng của gà bố mẹ trong giai đoạn đẻ trứng; nhưng không có mối liên hệ gì giữa IBH với sự có mặt của CAV và virus gây bệnh Marek’s Nghiên cứu này cũng kết luận IBH là bệnh tiên phát ở gà vì IBDV – một tác nhân được coi là yếu tố kích hoạt sự bùng phát IBH không lưu hành tại Newzealand tại thời điểm đó

Trong một nghiên cứu khácthực hiện để xác định ảnh hưởng của hiện tượng suy giảm miễn dịch do IBDV với sự xuất hiện IBH, chủng FAdV-02 và FAdV-

12 đã phân lập được từ gan gà trống 6 tuần tuổi (Reece et al., 1986) Nghiên cứu một lần nữa khẳng định IBH có thể xảy ra mà không cần sự có mặt của virus gây suy giảm miễn dịch như IBDV; nguy cơ được xác định là do yếu tố môi trường như chim sẻ, bồ câu, công nhân

Tại Chile, có nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc tính của ba chủng FAdV phân lập từ năm 1996-1997 từ các ổ dịch IBH/HPS bằng phương pháp trung hòa virus và phương pháp cắt men giới hạn (Toro et al., 1999) Nghiên cứu này có tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho gà với chủng FAdV 341 Kết quả cho thấy chủng virus này có thể gây bệnh IBH/HPS ở gà với sự có mặt của các yếu tố gây suy giảm miễn dịch khác

Tại Ontario, 86 ổ dịch IBH đã xuất hiện từ tháng 1/1969 – 7/1971 (Pettit and Carlson, 1972) Nghiên cứu cho thấy không có mối liên hệ nào giữa IBH và giống gà cũng như quá trình ấp nở, dinh dưỡng, công tác quản lý đàn và thuốc sử dụng Tuy nhiên, bệnh xảy ra theo mùa vào mùa xuân Một nghiên cứu tương tự được tiến hành tại Alberta để điều tra sự xuất hiện của bệnh ở gà broiler 12 tuần tuổi bị chết đột ngột với bệnh tích gan hoại tử trong thời gian từ năm 1968 đến

1969 (Howell et al., 1970) Kết quả cũng cho biết không có mối liên hệ nào giữa bệnh với giống gà, quá trình ấp nở, nguồn thức an; tuy nhiên với sự có mặt đồng thời của virus gây bệnh Marek’s, bệnh viêm ruột và nhiễm trùng huyết là các nguy cơ khiến cho bệnh xảy ra Khi gà broiler mắc kế phát E.coli sẽ có nguy cơ cao xảy ra bệnh IBH (Wells et al., 1977)

Tại phía nam Ontario, tỷ lệ chết của gà mắc IBH được xác định ở đàn gà bố

mẹ 10-14 ngày tuổi (Philippe et al., 2007) Mặc dù nguồn gốc của adenovirus

không thể xác định được nhưng người ta nghi ngờ có thể virus xâm nhập vào đàn

gà trong quá trình chăn nuôi thông qua thức ăn, chất độn chuồng, quần áo, giày của người chăn nuôi hoặc do tiếp xúc với các đàn gà khác Mặc dù chuồng gà đã được sát trùng trước khi thả gà nhưng có thể adenovirus do đề kháng được với các chất sát trùng nên vẫn tồn tại trong chuồng và gây bệnh

2.2.1.2 Hội chứng viêm bao tim tích nước

Năm 1987, một hội chứng mới với tên gọi viêm bao tim tích nước (hydropericardium syndrome – HPS) hay còn gọi là bệnh Angara được phát hiện tại Pakistan (Shane and Jaffery, 1997), sau đó được ghi nhận tại Ấn Độ, Kuwait, Iraq, Mexico, Miền Nam và Trung Mĩ, Nhật và Nga Tại vùng Nam và Trung Mĩ, bệnh sau đó được chẩn đoán là IBH (Shane, 1996) Hội chứng này và hội chứng viêm gan thể bao hàm chỉ khác nhau ở tỷ lệ chết và tỷ lệ có bệnh tích xoang bao tim tích nước cao hơn rất nhiều

Bệnh thường xảy ra ở gà hướng thịt từ tuần tuổi thứ 3-6, tỷ lệ chết dao động

từ 20-80% Khi xảy ra ở gà giống và gà đẻ, tỷ lệ chết thấp hơn Đặc trưng của bệnh là xoang bao tim tích nhiều nước trong (có thể lên đến 10ml), phổi bị phù thũng, gan sưng to, thận sưng to và nhạt màu Kiểm tra bệnh tích vi thể thấy gan

bị hoại tử, thâm nhiễm tế bào đơn nhân và thể bao hàm ái kiềm

Nguyên nhân gây bệnh được xác định là FAdV4 hoặc 8, ngoài ra còn có thêm vai trò của một số yếu tố khác Ngoài loài gà thì bồ câu cũng có thể mắc bệnh tương tự (Naeem and Akram, 1995)

2.2.1.3 Bệnh ở gà tây

Adenovirus được phân lập từ một số ổ dịch gà tây mắc bệnh đường hô hấp, đường tiêu hóa và hiện tượng giảm đẻ hoặc IBH; tuy nhiên không thể gây bệnh thực nghiệm được

2.2.1.5 Bệnh ở gà Nhật (guinea fowl)

Hiện tượng viêm tụy và hoại tử tuyến tụy với sự thâm nhiễm thể bao hàm ái toan có liên quan đến nhiễm adenovirus ở gà Nhật Bệnh viêm tụy và bệnh tích đường hô hấp có thể quan sát được khi gây bệnh bằng phương pháp nhỏ mũi cho

gà từ lúc 1 ngày tuổi Ngoài ra còn quan sát thấy bệnh tích xuất huyết, thâm nhiễm thể bao hàm do adenvirus ở lách của gà bệnh (Massi et al., 1995)

2.2.1.6 Bệnh ở đà điểu

Adenovirus được xác định có liên quan đến một số bệnh ở đà điểu như tiêu chảy, viêm tuyến tụy, chết, tỷ lệ ấp nở thấp Bằng thực nghiệm sử dụng chủng adenovirus phân lập từ đà điểu khi gây bệnh thực nghiệm cho gà Nhật đã gây viêm tụy (Capua et al., 1994; Gough et al., 1997) Một nghiên cứu khác khi gây bệnh thực nghiệm cho đà điểu con 3 ngày tuổi đã khiến cho toàn bộ đà điểu này

bị chết (Raines et al., 1997)

2.2.1.7 Bệnh viêm phế quản ở chim cút

Viêm phế quản ở chim cút là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, có khả năng lây lan nhanh ở chim cút (bobwhite quail, Colinus virginianus) từ 1-3 tuần tuổi,

tỷ lệ mắc lên đến 100% và tỷ lệ chết 50% Kháng thể kháng virus có thể được tìm thấy ở chim trưởng thành và chim hoang dã

Nguyên nhân gây bệnh là một FAdV nhóm I khác so với virus gây bệnh ở

gà Hiện nay không có thông tin chứng tỏ chủng F1 ở chim cút có ở dạng tiềm tàng và có khả năng truyền dọc giống như chủng gây bệnh ở gà hay không Khi gây bệnh thực nghiệm chủng adenovirus của chim cút cho gà và gà tây kết quả gà chỉ biểu hiện triệu chứng nhẹ

Bệnh tích đại thể bệnh viêm phế quản chim cút gồm chảy nhiều nước mắt nước mũi, viêm khí quản có nhiều dịch, đôi khi xuất huyết khí quản và viêm túi khí Bệnh tích vi thể gồm viêm hoại tử khí quản, viêm phế quản tăng sinh và hoại

tử, viêm phổi hoại tử; thâm nhiễm thể bao hàm đơn nhân trung tính ở tế bào biểu

mô khí quản Ngoài ra còn hiện tượng có nhiều điểm hoại tử gan, lách, túi fabricius dẫn đến hiện tượng hoại tử, teo các cơ quan này (Reed and Jack, 1997) 2.2.1.8 Một số bệnh khác ở chim cút

Hai trường hợp viêm não thể bao hàm do adenovirus được ghi nhận ở chim cút bobwhite quail (Colinus virginianus) (Goodwin, 1993) Ở loài chim coturnix quail, bệnh viêm dạ dày ruột thể bao hàm do adenovirus cũng được ghi nhận, bệnh tích đặc biệt nặng ở manh tràng (Tsai et al., 1998)

2.2.1.9 Chẩn đoán Adenovirus nhóm I

Phân lập virus

Bệnh phẩm lấy là phân hoặc chất chứa kết tràng Nếu một cơ quan nào đó

có bệnh tích rõ ràng, ví dụ gan trong bệnh IBH, khí quản trong bệnh viêm phế quản truyền nhiễm thì cần lấy bổ sung làm bẹnh phẩm chẩm đoán Virus thường tồn tại ở túi Fabricius, nước mắt, nước mũi, dịch hầu họng, khí quản, phổi và thận Nghiền với nước sinh lý thành huyễn dịch bệnh phẩm 10%, bổ sung kháng sinh (1.000UI penicillin và 1.000 µg streptomycin/ml) rồi gây nhiễm cho môi trường tế bào hoặc môi trường nuôi cấy vi khuẩn Huyễn dịch virus này có thể bảo quản ở nhiệt độ 40C hoặc ≤-200C cho đến khi sử dụng Môi trường tế bào được lựa chọn để phân lập adenovirus ở gà là tế bào thận gà và tế bào gan phôi gà, trong khi đó môi trường tế bào xơ phôi gà ít mẫn cảm hơn Với một số loài khác, ví dụ virus gây bệnh cho gà tây chỉ mẫn cảm trên tế bào đồng chủng, ví dụ tế bào thận gà tây Vì vậy tốt nhất để phân lập adenovirus loài nào thì sử dụng tế bào của loài đó; tuy nhiên vấn đề khó khăn là không thể kiếm được loài gia cầm sạch bệnh phù hợp Sau khi nuôi cấy virus, tế bào được theo dõi ít nhất trong 14 ngày, thường phải trải qua 1 lần cấy chuyển mù Trong quá trình nuôi cấy thường phân lập được cùng một lúc nhiều serotype adenovirus khác nhau, hoặc adenovirus và reovirus Để thuần khiết được chủng virus phân lập cần phải sử dụng phương pháp (plaque purification) hoặc phương pháp trung hòa virus

Nếu có mặt adenovirus, quan sát thấy nhiều tế bào hình tròn bong tróc ra khỏi thành chai nuôi cấy Thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu để loại trừ tạp nhiễm virus thuộc họ orthomyxoviridae và paramyxoviridae do adenovirus nhóm I và II không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà; tuy nhiên phương pháp tốt nhất để khẳng định sự có mặt của adenovirus là sử dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang, định serotype bằng kháng thể đặc hiệu

Phương pháp nuôi cấy trên môi trường tế bào thường độ nhạy không cao, trừ trường hợp virus type 1 và 5 Đường tiêm virus là vào xoang niệu mô hoặc túi lòng đỏ

Một số phương pháp chẩn đoán hiện đại như PCR thường bị hạn chế vì hiện tượng tiềm ẩn khiến cho kết quả dương tính khó kết luận được bệnh xảy ra tại thời điểm điều tra hay nhiễm sớm hơn Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa khi

để xác định genotype để kết luận virus có tính gây bệnh hoặc không

Phương pháp huyết thanh học

Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch được sử dụng rộng rãi Ưu điểm chính của phương pháp này là rẻ tiền, dễ thực hiện; nhược điểm là độ nhạy kém Phương pháp thường được sử dụng để đánh giá đàn gà sạch bệnh; kết quả dương tính đáng tin cậy khi gà đồng thời nhiễm nhiều serotype virus

Phản ứng ELISA, phản ứng trung hòa virus cũng là một trong các phương pháp để đánh giá đàn gà sạch bệnh; tuy nhiên giá thành cao

2.1.1.10 Phòng chống bệnh Adenovirus nhóm I

Do sự phân bố rộng khắp của adenovirus nhóm I nên rất khó khống chế bệnh, một số chủng lại có khả năng truyền lây từ chim hoang dã sang chim nuôi Trước kia iệc nghiên cứu sản xuất vacxin phòng bệnh không được quan tâm nhưng từ khi xuất hiện các ổ dịch IBH và HPS nhiều nghiên cứu để sản xuất vacxin phòng bệnh đã được thực hiện thành công gồm vacxin nhược độc và vacxin vô hoạt (Shane and Jaffery, 1997; Roy and Manickam, 1999)

Việc vận chuyển gia cầm và trứng gia cầm từ vùng nhiễm chủng virus có độc lực cao có liên quan đến dịch IBH và HPS đến vùng không có bệnh thường

bị hạn chế Tuy nhiên, hiện nay việc kiểm tra còn nhiều khó khăn, một số chủng (ví dụ type 8) có thể liên quan đến chủng virus mới gây bệnh IBH nhưng lại phân lập được cả ở gia cầm khỏe mạnh Vì vậy, để chứng minh được gà con, hoặc trứng sạch bệnh cần kiểm tra đàn bố mẹ phải âm tính với chủng virus mới hoặc không có triệu chứng của IBH

Bệnh do adenovirus ở gà có thể được phòng bằng cách vệ sinh chuồng trại

và dụng cụ chăn nuôi, thực hiện tốt an toàn sinh học, đảm bảo thông thoáng cũng như chế độ ánh sáng chuồng nuôi (Balamurugan and Kataria, 2004; Hafez, 2011) Vì bệnh có khả năng truyền dọc nên để loại bỏ hoàn toàn adenovirus ra khỏi đàn cần phải lựa chọn đàn gà bố mẹ sạch bệnh (Saif et al., 2008) Việc sử dụng vacxin đồng chủng được vô hoạt bằng formalin chế từ gan gà bị bệnh đã được thử nghiệm thành công để phòng HPStại Pakistan (Afzal and Ahmad, 1990; Roy and Manickam, 1999), Mexico và Ấn Độ (Pattison et al., 2008) Tại Canada, việc xác định genotype của FAdV để lựa chọn chủng làm giống nghiên cứu tạo vacxin đã được tiến hành (Gomis et al., 2006) Từ tháng 1 năm 2010, toàn bộ đàn

gà bố mẹ tại Ontario đã được sử dụng vacxin nhị giá (chế từ chủng FAdV-08 và FAdV-11) giúp hạn chế nguy cơ truyền dọc của virus gây bệnh cho con

Kháng thể thụ động giúp bảo hộ con con không bị mắc IBH (Xie et al., 1999) Nghiên cứu xác định mức độ bảo hộ của kháng thể thụ động do đàn gà bố

mẹ được sử dụng vacxin (FAdV-08/11) và gà không sử dụng được thực hiện bằng cách công cường độc với các chủng virus FAdV-08/11 và/hoặc chủng Stanford khi gà được 1 và 7 ngày tuổi (Alvarado et al., 2007) Kết quả cho thấy nếu gà bố mẹ được sử dụng vacxin FAdV-08/11 vào giai đoạn từ 30 đến 50 tuần

sẽ bảo hộ được gà con không bị mắc bệnh khi công cường độc Tuy nhiên, hàm lượng kháng thể thụ động ở đàn gà broiler không sử dụng vacxin lại cao hơn, có thể là do gà bố mẹ này lại tiếp tục nhiễm adenovirus tự nhiên và truyền kháng thể thụ động ở mức cao cho gà con (Alvarado et al., 2007)

Trong một nghiên cứu khác, các nhà khoa học kiểm tra giả thuyết khả năng bảo hộ của gà con với IBH và HPS liệu có thể thu được bằng cách tiêm nhắc lại vacxin phòng FAdV-04 và CIAV cho gà bố mẹ hay không (Toro et al., 2002) Kết quả cho thấy trong những trường hợp CAVđược coi là tác nhân gây suy giảm miễn dịch khiến cho FAdV gây bệnh thì con con hoàn toàn được bảo hộ khi gà

bố mẹ được tiêm vacxin phòng bệnh do CAV gây ra hoặc vacxin phòng cả FAdV

và CAV Trong trường hợp cả 2 virus cùng xuất hiện đồng thời, gà bố mẹ chỉ cần tiêm vacxin FAdV hoặc FAdV và CIAV

2.2.2 Adenovirus nhóm II

Nhóm II có 3 thành viên gồm virus gây viêm ruột xuất huyết ở gà tây (turkey haemorrhagic enteritis virus – THEV), virus gây bệnh lách đá hoa (marble spleen disease virus– MSDV) và virus gây chứng to lách ở gà (adenovirus group II splenormegaly virus) Các virus này mang kháng nguyên chung khác với adenovirus của động vật có vú và adenovirus gà nhóm I

Virus bị bất hoạt trong vòng 1 giờ ở 650C, bị tiêu diệt sau 1 giờ ở 700C, độc lực của virus rất đa dạng, từ chủng có độc lực rất cao đến không có độc lực Môi trường tế bào thường được sử dụng để nuôi cấy virus là tế bào dòng MDTC-RP19 (turkey lymphoblastoid B cell line, có nguồn gốc từ khối u trong bệnh Marek’s), trong khi đó virus không nhân lên trên tế bào thận gà tây hoặc gan phôi gà (Nazerian and Fadly, 1982; Van den Hurk, 1985)

2.2.2.1 Bệnh thường gặp

Bệnh viêm ruột xuất huyết ở gà tây

Virus gây bệnh viêm ruột xuất huyết ở gà tây phân bố rộng khắp trên toàn thế giới Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự lưu hành với tỷ lệ lớn kháng thể

kháng THEV ở gà tây nuôi nhưng lại không ghi nhận trường hợp nào bị nhiễm ở gà tây hoang dã Gà Nhật, chim cút và vẹt cũng có thể là vật chủ tự nhiên của bệnh Bệnh thường xảy ra ở gà tây từ 6-11 tuần tuổi, mặc dù cũng có trường hợp bệnh xảy ra ở lứa tuổi gà 2,5 tuần Gà dưới 13 ngày tuổi có khả năng đề kháng tự nhiên với bệnh, mặc dù không có kháng thể thụ động do mẹ truyền sang, có thể

do cơ quan đích tấn công của virus chưa phát triển hoàn thiện

Bệnh lây qua đường tiêu hóa, virus có mặt trong phân vài tuần và bài thải virus nhiều nhất khi hàm lượng kháng thể giảm xuống Virus có sức đề kháng cao và có thể lây lan dễ dàng từ trại này sang trại khác do sự di chuyển của con người; hoặc khi vệ sinh chuồng trại lứa trước mắc bệnh không đạt yêu cầu Không có bằng chứng cho thấy bệnh lây qua trứng

Trong cơ thể, virus nhân lên trước tiên ở tế bào lympho của đường tiêu hóa

và túi Fabricius Bằng phương pháp gây nhiễm người ta đã xác định được sự có mặt của virus ngay 1 ngày sau gây bệnh, đạt cao nhất 4-7 ngày và có thể kéo dài đến ngày 15 Trong túi Fabricius, virus được tìm thấy trong khoảng 2-7 ngày sau khi gây nhiễm; ở tương bào, virus được phát hiện ở ngày thứ 2 sau khi gây nhiễm; ở bạch cầu, virus được phát hiện từ ngày 3-18 Lách là cơ quan chính nhân lên của virus, được phát hiện có virus sau 2 ngày gây nhiễm, đạt đỉnh cao sau 6 ngày và kép dài đến ngày 18 (Nagaraja and Hussain, 1996) Hiện tượng apoptosis xuất hiện ở gần nửa số tế bào có thẩm quyền miễn dịch M+ ở ngày thứ 3; mặc dù cơ chế sinh bệnh của THEV chưa rõ ràng nhưng đây có thể là một trong các cơ chế gây suy giảm miễn dịch của virus (Suresh and Sharma, 1996) Bằng thực nghiệm khi gây nhiễm bằng đường miệng, thời gian nung bệnhđược xác định dao động từ 5-6 ngày Các ổ dịch tự nhiên thì gần như 100% gia cầm bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết dao động từ 10-15%, đôi khi lên đến 60% Bệnh thường xảy ra đột ngột, chim có hiện tượng ủ rũ, ỉa chảy lẫn máu và chết đột ngột Con vật chết có thể chỉ trong vòng 24 giờ sau khi xuất hiện triệu chứng của bệnh hoặc sẽ qua khỏi; triệu chứng kéo dài từ 6-10 ngày Với các chủng độc lực thấp hơn thì ít thiệt hại hơn, nhưng các chủng đều gây hiện tượng suy giảm miễn dịch; khiến cho mầm bệnh kế phát như paramyxovirus type II, Chlamydia, Staphylococcus và E.coli có cơ hội gây bệnh

Tại một cơ sở chuyên sản xuất giống tại miền Bắc Ailen có điều kiện vệ sinh rất đạt yêu cầu, gà tây bố mẹ không bị mắc bệnh cho đến khi bắt đầu đẻ, gà

có triệu chứng lâm sàng giống như hội chứng giảm đẻ khiến cho vỏ trứng nhạt

màu, vỏ mỏng hoặc không có vỏ đá vôi, huyết thanh chuyển dương với THEV,

gà bố mẹ gần như vẫn khỏe mạnh bình thường

Gà chết do THEV thường nhợt nhạt do mất máu Gà chết đột ngột thường xác chết vẫn béo, thức ăn tích lại trong diều, ruột non căng phồng, niêm mạc ruột

bị tụ huyết, chứa đầy thức ăn có lẫn máu, đôi khi có đám hoại tử Bệnh tích thường tập trung ở phần đầu của ruột non Nếu gà bệnh không chết, khi mổ khám thấy lách thường sưng to, bở, dễ nát và có điểm hoại tử; trong khi đó ở gia cầm chết vì bệnh lách thường bị teo, hiện tượng hoại tử khó quan sát hơn

Khi gây bệnh thực nghiệm, từ ngày thứ 3 quan sát được hiện tượng tăng sinh miền tủy trắng của lách, đến ngày thứ 5-6 hình thành nhiều hang bất thường,

có thâm nhiễm tế bào lympho B và thể bao hàm Sau đó miền tủy trắng dần dần

bị hoại tử (bắt đầu từ ngày 4-5), dần dần (ngày thứ 6-7) miền tủy trắng được thay thế hoàn toàn bởi các tương bào chỉ có ở miền tủy đỏ Các cơ quan lympho khác như tuyến ức và túi Fabricius cũng bị teo ở ngày thứ 3 đến khoảng ngày thứ 9 (Nagaraja and Hussain, 1996)

Một số hình ảnh minh họa cho bệnh viêm ruột xuất huyết ở gà tây (nguồn: www.poultrysite.com 2011)

Hình 2.9 Gà chết đột ngột, phân có màu đen

Hình 2.10 Ruột non, đặc biệt là tá tràng có màu đỏ sẫm,

mạch máu thường có dạng cành

Hình 2.11 Ruột non bị xuất huyết, hoại tử

Hình 2.12 Lách sưng to, xuất huyết, dễ nát, có điểm hoại tử

Hình 2.13 Bệnh tiến triển, lách gà bị teo nhỏ, có màu trắng xám

Hình 2.14 Gan sưng to, dễ nát, xuất huyết tập trung thành từng đám

và xuất huyết Bệnh lách đá hoa (marble spleen disease)

Bệnh lách đá hoa (marble spleen disease – MSD) thường gặp ở chim trĩ (gà lôi) từ 3-8 tháng tuổi, tỷ lệ mắc có thể lên đến 100%; tỷ lệ chết dao động từ 2-20% Triệu chứng quan sát được gồm gà ủ rũ, yếu ớt, chảy nước mũi, khó thở và chết Virus tồn tại ở lách, gan, phổi, tủy xương, thận nhưng không có ở ruột

Lách của gà chết vì bệnh bị sưng to, có dạng đốm hoặc đá hoa; phổi bị tụ huyết và phù thũng (là nguyên nhân gây chết gà) Đôi khi quan sát được hiện tượng lách gà hoại tử và hình thành nhiều thể bao hàm ở trong nhân

Chứng to lách ở gà (adenovirus group II splenormegaly)

Virus gây chứng to lách ở gà cũng lưu hành rộng rãi nhưng không gây thiệt hại về kinh tế với tỷ lệ chết khoảng 8-9% ở gà trưởng thành

Đặc trưng của bệnh là gây chứng to lách ở gà broiler khi được giết mổ và chứng to lách kèm theo thủy thũng phổi ở gà trưởng thành

2.2.2.2 Chẩn đoán THEV

Bệnh phẩm thường lấy là lách để phân lập virus, ngoài ra có thể lấy phân

Sử dụng môi trường tế bào MSTC-RP19 để phân lập virus, hoặc gây nhiễm (uống hoặc tiêm tĩnh mạch) cho gà tây 5-10 tuần tuổi âm tính với kháng thể kháng THEV Gà gây bệnh thường chết sau 5-6 ngày; những con gà nào gây nhiễm không chết sau 6 ngày thì lách sẽ bị sưng rất to

Phản ứng huyết thanh học thường được sử dụng để chẩn đoán là kết tủa khuếch tán trên thạch, miễn dịch huỳnh quang hoặc ELISA Hiện nay kĩ thuật PCR đang được phát triển rộng rãi để chẩn đoán bệnh

2.2.2.3 Phòng bệnh THEV

Vacxin được sử dụng phổ biến để phòng bệnh Hiện nay vacxin nhược độc sản xuất trên môi trường tế bào được đánh giá là có hiệu quả phòng bệnh, tuy nhiên lại là nguy cơ gây suy giảm miễn dịch Khắc phục nhược điểm trên, một loại vacxin nhị giá kết hợp để phòng bệnh đậu đã được nghiên cứu để phòng bệnh

2.2.3 Adenovirus nhóm III: (virus gây hội chứng giảm đẻ ở gà)

Hội chứng giảm đẻ (Egg Drop Syndrome - EDS) (hay còn được gọi là EDS’76) lần đầu tiên được mô tả ở đàn gà đẻ tại Hà Lan vào năm 1976 do một loại virus thuộc nhóm Adenovirus subgroup III gây bệnh ở gà, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu (McFerran et al., 1978) Virus này không có mối liên hệ nào về mặt huyết thanh học với các virus thuộc subgroup I và II Đặc trưng của bệnh là gây hiện tượng gà đẻ trứng không có vỏ hoặc vỏ mỏng hơn so với gà bình thường 2.2.3.1 Căn bệnh

Virus gây hội chứng giảm đẻ ở gà (egg drop syndrome virus – EDSV) mang đầy đủ đặc tính của FAdV, chỉ khác là virus này có khả năng gây ngưng

kết hồng cầu gà, gà tây, ngỗng, vịt, bồ câu, công; không ngưng kết với hồng cầu của động vật có vú; có một phần kháng nguyên giống với F1 adenovirus (McFerran et al., 1978) Hiện tại chỉ phát hiện được 1 serotype duy nhất gây bệnh, nhưng có đến 3 genotype đã được xác định

Virus nhân lên tốt khi nuôi cấy trên tế bào xơ phôi vịt, gan phôi vịt hoặc thận vịt

2.2.3.2 Dịch tễ học

Sau khi xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường hô hấp hoặc tiêu hóa, virus nhân lên cục bộ sau đó xâm nhập vào máu Virus thường nhân lên ở ống dẫn trứng, cơ quan sinh dục Nếu phôi gà bị nhiễm hoặc con con bị nhiễm trước khi thành thục, virus tồn tại ở dạng tiềm ẩn và chờ đợi để gây bệnh Virus có thể tồn tại đến 3 tuần ở trứng, là bằng chứng cho thấy bệnh có thể truyền dọc Virus thải ra ngoài qua phân, sống ở ống dẫn trứng mà không sống ở đường tiêu hóa như các adenovirus khác

Gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, mọi nòi giống Có bằng chứng cho thấy giống

gà đẻ trứng trắng có hiện tượng giảm đẻ nhiều hơn so với giống gà đẻ trứng màu nâu Một số loài thủy cầm, chim cút cũng có thể mắc bệnh

2.2.3.3 Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng đầu tiên quan sát được là mất màu vỏ trứng, sau đó vỏ trứng

bị mỏng, bề mặt nhám, vỏ mềm hoặc không có vỏ đá vôi; một số ổ dịch còn thấy trứng bị nhỏ lại Nếu loại bỏ những trứng bệnh thì tỷ lệ ấp nở thường không bị ảnh hưởng

Nhiều quả trứng bệnh có lòng trắng trứng loãng nhiều nước

Nếu gà đẻ bị mắc virus sớm (tiềm ẩn) khiến cho tỷ lệ đẻ giảm 40%, xuất hiện khi đàn gà bắt đầu đẻ 50% đến khi tỷ lệ đẻ cao nhất Nếu gà bị nhiễm muộn hơn vào giai đoạn đẻ trứng, triệu chứng lâm sàng có thể thay đổi do sự lây lan bệnh chậm, đặc biệt đối với gà nuôi lồng; tỷ lệ đẻ thường kém mà không có sự giảm rõ rệt

Gà bệnh thường vẫn khỏe mạnh, một số ít có biểu hiện kém ăn, mệt mỏi, tiêu chảy phân lỏng, có lẫn nhiều dịch nhày từ ống dẫn trứng đổ ra

Hình 2.17 Mất màu vỏ trứng, trứng méo mó, kỳ hình

2.2.3.4 Chẩn đoán EDS

Mẫu bệnh phẩm được lấy để chẩn đoán bệnh đóng vai trò rất quan trọng Nếu gà bị bệnh do mẹ truyền sang, không có kháng thể sẽ mắc vào giai đoạn thành thục; do đó để khẳng định đàn gà âm tính không được lấy mẫu trước 32 tuần tuổi Trong trường hợp gà không có triệu chứng, việc lựa chọn đúng gà có virus là một vấn đề Nếu gà nuôi theo chuồng thì việc lấy mẫu đơn giản hơn do chỉ cần chọn những chuồng mà sản lượng trứng có vấn đề; tiến hành lấy mẫu toàn bộ gà trong chuồng và chọn ra được những con có kháng thể và mang virus

Ổ nhớp của gà bệnh là cơ quan được lấy để làm tiêu bản vi thể, làm phản ứng hóa mô miễn dịch hoặc để phân lập virus

2.2.3.5 Phòng bệnh EDS

Do bệnh có thể truyền dọc nên đàn gà giống bố mẹ cần đảm bảo sạch bệnh Hiện nay sử dụng vacxin để phòng bệnh đã giúp hạn chế sự lây lan và thiệt hại do bệnh gây ra.Vacxin vô hoạt bổ trợ dầu được dùng cho gà đẻ từ 14-16 tuần tuổi

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Fowl Adenovirus (FAdV) lưu hành ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, chúng tôi thực hiện các nội dung sau:

- Xác định sự lưu hành FAdV ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận;

- Giải trình tự gen mã hóa protein hexon (gen hexon) của FadV;

- Phân tích một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của FadV

3.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Thí nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh vật- Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian thực hiện từ tháng 12/2015 đến 5/2017

3.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Mẫu được thu thập ở một số đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận

- Gà bệnh ở các lứa tuổi được thu thập ở các địa phương tiến hành nghiên cứu

- Cặp mồi đặc hiệu dùng để phát hiện và giải trình tự FadV

- Kít PCR (Maxime PCR PreMix i-Taq, iNtRON, Hàn Quốc)

- Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số gồm:

(i) dung dịch ly giải mẫu có chứa 27% sucrose, 15 mM trisodium citrate, 0,15 M NaCl, 1 mM ethylene diaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulphate, 200 µg/ml proteinase K

(ii) phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1)

(iii) isopropyl

(iv) cồn 70%

(v) dung dịch đệm TE (pH=8)

- Hóa chất dùng phân tích sản phẩm PCR gồm:

(i) agarose (Agarose EP Master, Biosesang, Hàn Quốc)

(ii) RedSafe Nucleic Acid Staining Solution (20,000x)

(iii) 100bp DNA ladder (GeneDirex)

+ Bộ dụng cụ lấy mẫu, ống lấy mẫu

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu được lấy ngẫu nhiên từ đàn gà bệnh: bệnh phẩm của gà có thể biểu hiện triệu chứng lâm sàng như ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn, kém ăn, kém vận động, khó thở, ỉa chảy Tiến hành mổ khám lấy bệnh phẩm gồm gan, lách, ruột, tuyến

ức, tuyến harder, túi fabricius, tủy xương Đồng nhất mẫu và bảo quản ở -200C cho đến khi xét nghiệm

3.5.2 Phương pháp tách và tinh sạch ADN tổng số

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tách, tinh sạch ADN tổng số theo các bước như sau:

(1) Ly giải mẫu ;

- 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K ;

- Ủ ở 56oC/90 phút hoặc 37oC/12giờ

(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1)

- Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải;

- Vortex hỗn hợp;

- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC