(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitron và trồng cây sâm cau (curculigo orchioids gaertn ) trong vườm ươm

Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng TDZ + IBA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau .... Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng TDZ đến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Bình

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Ích Tân và TS Phạm Hương Sơn đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài!

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, bộ môn Canh tác học, khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn!

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Phòng thí nghiệm Phát triển Ứng dụng Y sinh công nghệ cao, Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài!

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Lài đã luôn tận tâm giúp đỡ, hướng đẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài!

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi trong quá trình học tập của mình./

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Bình

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Giới thiệu về cây sâm cau 4

2.1.1 Vị trí phân bố và phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm thực vật học 4

2.1.3 Đặc điểm sinh thái học 6

2.1.4 Thành phần hóa học 7

2.1.5 Giá trị sử dụng 7

2.1.6 Thực trạng khai thác loài Sâm cau của Việt Nam 7

2.2 Một số kết quả nghiên cứu sâm cau trên thế giới và việt nam 8

2.2.1 Tình hình nghiên cứu Sâm cau trên thế giới 8

2.2.2 Tình hình nghiên cứu Sâm cau trong nước 12

2.3 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào 14

2.3.1 Môi trường nuôi cấy 14

2.3.2 Các chất điều hòa sinh trưởng 15

2.3.3 Môi trường vật lý 16

2.3.4 Vật liệu nuôi cấy 17

2.3.5 Điều kiện vô trùng 17

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18

3.1 Địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Thời gian nghiên cứu 18

3.3 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu 18

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.4 Nội dung nghiên cứu 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 20

3.5.1 Phương pháp nhân giống in vitro 20

3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 21

3.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi 25

3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

Phần 4 Kết quả và thảo luận 27

4.1 Nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro cây sâm cau 27

4.1.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy 27

4.1.2 Ảnh hưởng của chất chất kích thích sinh trưởng TDZ đến khả năng tạo vật liệu khởi đầu 30

4.2 Nghiên cứu nhân nhanh chồi cây sâm cau 32

4.2.1 Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng (TDZ + IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sâm cau 33

4.2.2 Ảnh hưởng của phloroglucinol (PG) đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau 35

4.2.3 Ảnh hưởng của AgNO 3 đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau 37

4.2.4 Ảnh hưởng của tảo Spirulina đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau 38

4.3 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh 41

4.3.1 Ảnh hưởng của iba đến tạo cây in vitro hoàn chỉnh 41

4.4 Nghiên cứu kỹ thuật trồng cây sâm cau trong vườn ươm 45

4.4.1 Ảnh hưởng của giá thể khác nhau đến sinh trưởng và phát triển của cây Sâm cau in vitro ngoài vườn ươm 46

4.4.2 Ảnh hưởng một số loại phân bón lá khác nhau đến sinh trưởng và phát triển của cây Sâm cau in vitro ngoài vườn ươm 51

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Kiến nghị 57

Tài liệu tham khảo 59

Phụ lục 63

Phụ lục 1 Thành phần cơ bản của các loại môi trường nuôi cấy 63

LSD 0,05 So sánh theo giá trị khác biệt có ý nghĩa nhỏ nhất ở mức α  0,05

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại cây Sâm sau 4

Bảng 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H 2 O 2 và NaOCl 22

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng H 2 O 2 lên mẫu cấy Sâm cau 27

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl lên mẫu cấy Sâm cau 29

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng TDZ đến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban đầu (sau 4 tuần nuôi cấy) 31

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau (sau 6 tuần nuôi cấy) 34

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của phloroglucinol (PG) đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau (sau 6 tuần nuôi cấy) 36

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của AgNO 3 đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau (sau 6 tuần nuôi cấy) 37

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của tảo Spirulina đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau (sau 6 tuần nuôi cấy) 39

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ và sinh trưởng của chồi Sâm cau in vitro (6 tuần nuôi cấy) 42

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau đến chiều cao cây Sâm cau in vitro ở giai đoạn vườn ươm 47

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau đến số lá cây Sâm cau in vitro ở giai đoạn vườn ươm 49

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau đến sự sinh trưởng phát triển của cây Sâm cau in vitro ở giai đoạn vườn ươm (sau 10 tuần) 50

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của phân bón lá khác nhau đến chiều cao cây Sâm cau in vitro ở giai đoạn vườn ươm 52

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của phân bón lá khác nhau đến số lá cây Sâm cau in vitro ở giai đoạn vườn ươm 54

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của phân bón lá khác nhau đến đến sự sinh trưởng phát triển cây Sâm cau in vitro ở giai đoạn vườn ươm 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Thân rễ cây Sâm cau 5

Hình 2.2 Lá cây Sâm cau 5

Hình 2.3 Hoa Sâm cau 6

Hình 2.4 Quả và hạt Sâm cau 6

Hình 3.1 Mẫu Sâm cau đưa vào nuôi cấy in vitro 18

Hình 3.2 Growmore (N: P: K = 30: 10: 10) 19

Hình 3.3 B1 Thái Lan 19

Hình 3.4 Atonik 1.8 SL 19

Hình 4.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng H 2 O 2 đến tỷ lệ mẫu sống 28

Hình 4.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl đến tỷ lệ mẫu sống 29

Hình 4.3 Mẫu nảy chồi sau 4 tuần nuôi cấy 30

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến số chồi 32

của mẫu cấy ban đầu 32

Hình 4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp nồng độ (TDZ+IBA) đến 34

số chồi Sâm cau 34

Hình 4.6 Ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau 35

Hình 4.7 Ảnh hưởng của AgNO 3 đến số chồi Sâm cau 38

Hình 4.8 Ảnh hưởng của tảo Spirulina đến số chồi Sâm cau 39

Hình 4.9 Kết quả nhân nhanh chồi Sâm cau 41

Hình 4.10 Ảnh hưởng của IBA đến tạo cây in vitro hoàn chỉnh 44

Hình 4.11 Cây in vitro hoàn chỉnh 44

Hình 4.12 Cây Sâm cau đưa ra ngoài vườn ươm 46

Hình 4.13 Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau đến sự tỷ lệ sống 51

của cây Sâm cau in vitro ở giai đoạn vườn ươm 51

Hình 4.14 Sâm cau ở giai đoạn vườn ươm 56

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Bình

Tên luận văn: Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro và trồng cây Sâm cau (Curculigo

orchioides Gaertn.) trong vườn ươm

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro và trồng cây Sâm cau (Curculigo

orchioides Gaertn.) trong vườn ươm nhằm cung cấp giống Sâm cau phục vụ phát triển

ngoài sản xuất

Phương pháp nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro cây Sâm cau

- Nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Sâm cau

- Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh

- Nghiên cứu kỹ thuật trồng cây Sâm cau trong vườn ươm

Vật liệu nghiên cứu bao gồm:

Cây Sâm cau được thu thập ở Sơn La

Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại

Phương pháp bố trí thí nghiệm trong vườn ươm: Các thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với 3 lần nhắc lại

Kết quả chính và thảo luận

1 Khử trùng mẫu Sâm cau nuôi cấy thích hợp nhất là sử dụng NaOCl nồng độ 2% trong khoảng thời gian 15 phút, tỷ lệ mẫu sống đạt tới 81,0% Môi trường khởi động tạo vật liệu khởi đầu thích hợp nhất trên môi trường MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar +

200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ, pH 5,5 cho số chồi đạt 3,1 chồi;

số lá/chồi đạt 2,7 lá, chồi sinh trưởng ở mức độ khá sau 4 tuần nuôi cấy

2 Môi trường nhân nhanh chồi thích hợp trên môi trường MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l IBA + 1,0 mg/l AgNO 3 + 50 mg/l tảo Spirulina, pH 5,5 cho tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 80,9%; số chồi đạt

20,8 chồi; số lá/chồi đạt 5,2 lá, chồi mập, cứng, lá xanh bóng sau 6 tuần nuôi cấy

3 Tạo cây hoàn chỉnh in vitro thích hợp nhất trên môi trường MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 0,5 mg/l IBA, pH 5,5 cho cho

tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, chiều cao của cây đạt cao nhất 11,8cm; số lá 7,2 lá; số rễ đạt 10,3 rễ và chiều dài rễ đạt 5,1cm sau 6 tuần nuôi cấy

4 Khả năng sống và phát triển của cây Sâm cau khi đưa từ ống nghiệm nuôi cấy

mô ra vườn ươm phụ thuộc chặt chẽ vào giá thể trồng và loại phân bón

+ Giá thể ra cây thích hợp nhất là giá thể Mùn rừng + Vụn xơ dừa (70:30) cho tỷ lệ cây sống và các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển đạt cao nhất đạt 97,8%; chiều cao của cây đạt 16,4cm; số lá đạt 6,6 lá; số rễ mới xuất hiện là 6,4 rễ; cây khỏe, mập, lá to xanh đậm sau 10 tuần trồng

+ Ở giai đoạn vườn ươm có thể dùng phân bón Growmore Mỹ (30:10:10) phun 1lần/tuần cho cây sinh trưởng phát triển tốt nhất, cây mập khỏe và lá màu xanh bóng Chiều

cao của cây đạt cao nhất 22,6 cm; số lá đạt 11,0 lá và số rễ mới cũng đạt cao nhất 9,7 rễ

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Thi Binh

Thesis title: Research on in vitro propagation and cultivation of Curculigo orchioides

Gaertn in nursery

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

Study on in vitro propagation and cultivation of Curculigo orchioides Gaertn in

nursery to supply seedling for development outside production

Materials and Methods

* Research content

- Research sterilisation creation of starting materials of Curculigo orchioides Gaertn

- Research on rapid multiplication of Curculigo orchioides Gaertn

- Research on production of complete in vitro plants

- Research on techniques of cultivation of Curculigo orchioides Gaertn in nursery

Main findings and conclusions

1 The most sterilisation of Curculigo orchioides Gaertn is NaOCl concentration

2% period 15 minute with the results of 81,0% live percent The most appropriate medium for creation of starting materials was the MS medium supplemented with 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l coconut water + 1 g/l activated charcoal + 1,5 mg/l TDZ with the results of 80,9% of the samples formed shoots; 3,1 shoots/explant and 2,7 leaves/plantlet after 4 weeks of culture

2 The most appropriate medium for multiplication of shoots was the MS medium supplemented with 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l coconut water + 1 g/l

activated charcoal + 1,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l IBA + 1,0 mg/l AgNO 3 + 50 mg/l

Spirulina, pH 5,5 with the results of 20,8 shoots/explant and 5,2 leaves/plantlet after 6

weeks of culture

3 Root formation of shoots carried out on the MS medium supplemented with 30 g/1 sucrose + 5.5 g/1 agar + 200 ml/l coconut water + 1 g/l activated charcoal + 0,5 mg/l

IBA gave the best result with the results: rooting rate of shoots in vitro was 100%,

healthy plantlets 11,8 cm, 7,2 leaves/plantlet, 10,3 roots/plantlet, root length 5,1 cm after

6 weeks of culture

4 The survival and growth of Curculigo orchioides Gaertn after being taken from

culture tubes to the nursery:

+ In nursery, a mixture of humus + coconut fiber powder (70:30 ratio) was regarded

as the best subtrate due to the high survival rate of plantlets (97,8%) and healthy plantlets 16,4 cm high with 6,6 leaves and 6,4 new roots/a plantlet) at 10 weeks after planting + Growmore leaf foliar fertilizer (30:10:10) has the best effect on growth and

development of Curculigo orchioides Gaertn in the nursery The highest height of trees is

22,6 cm; reached 11,0 leaves and 9,7 new roots, fat trees, well - developed leaves and roots

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Hiện nay, khoa học kỹ thuật hiện đại phát triển rất nhanh, việc ứng dụng khoa học kỹ thuật vào ngành y dược đã tạo ra một hệ thống thuốc tân dược (hay còn được gọi là thuốc tây) rất phong phú và đa dạng Song với những tác dụng phụ không mong muốn của thuốc tây mang lại, con người lại có xu hướng quay

về với những sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên Chính vì vậy, những dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên vẫn luôn giữ nguyên được ý nghĩa và tầm quan trọng của nó trong xã hội hiện đại ngày nay Trong đó, thân rễ cây Sâm cau

là một trong số những dược liệu quý từ thiên nhiên

Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thuộc họ Sâm cau (Hypoxidaceae)

là cây thuốc quý trong y học cổ truyền Việt Nam và các nước châu Á khác Trên thế giới, Sâm cau phân bố ở Australia, Trung Quốc, Nhật Bản, Malaysia, Pakistan, Philippines và Sri Lanka Ở Việt Nam, chúng phân bố chủ yếu ở Lai Châu, Tuyên Quang, Cao Bằng, Sơn La, Hòa Bình, Nghệ An, Đắc Lắk và Kon Tum Sâm cau có tác dụng chữa vô sinh, nam giới tinh lạnh, liệt dương, tê thấp, đau lưng, viêm thận mãn tính, viêm khớp, suy nhược cơ thể, loét dạ dày tá tràng, vàng da, tiêu chảy, huyết áp cao (Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, 2006) Ở Trung Quốc, thân rễ Sâm cau được tán thành bột, sắc nước làm thuốc

bổ, trị suy nhược cơ thể, đau lưng, viêm khớp và viêm thận mạn tính Ở Ấn Độ, Nepal và Philippines thân rễ Sâm cau dùng làm thuốc lợi tiểu, tăng cường chức năng tình dục, chữa bệnh ngoài da, loét dạ dày tá tràng, trĩ, lậu…; Sâm cau còn là thành phần chính trong bài thuốc cổ truyền điều trị sỏi tiết niệu của Ấn Độ Ở Papua New Guinea, thân rễ và lá Sâm cau được hơ nóng cho mềm rồi chà xát trên cơ thể để tránh thụ thai Theo Y học cổ truyền Việt Nam, Sâm cau có vị cay, tính ấm, có tác dụng trợ dương, trừ hàn, cường dương, mạnh gân xương Đồng bào các dân tộc thường sử dụng thân rễ cây Sâm cau như một loại thuốc bổ - có thể dùng riêng hoặc kết hợp cùng với các vị thuốc khác - để điều trị các bệnh như: liệt dương, đau lưng, viêm khớp, viêm thận, vàng da, vô sinh…

Do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên cây Sâm cau bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên kiệt quệ Mặt khác, vùng phân bố của Sâm cau bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này rơi

vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, phần II - Thực vật, 2007 và hạng mục IUCN, 2012 Trong tự nhiên, Sâm cau được nhân

tái sinh bằng hạt hoặc mầm Để cải thiện hệ số nhân giống cây C orchioides, một

số tác giả đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Nagesh,

2008; Adiyecha and Jasrai, 2012; Võ Châu Tuấn và cs., 2011); tuy nhiên kết quả

mà các tác giả thu được chưa thực sự khả quan

Hiện nay, do việc nhân giống in vitro cây Sâm cau đang gặp rất nhiều

vướng mắc như: tỷ lệ phần trăm mẫu nhiễm khuẩn cao và quá trình mẫu oxy hóa phenolic lớn, sự nảy chồi trong nuôi cấy rất chậm…Việc nghiên cứu nuôi trồng

cây Sâm cau ở giai đoạn ex vitro, trên thế giới và Việt Nam vẫn còn hạn chế Để đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống C orchioides có chất lượng tốt, cần có

những biện pháp kỹ thuật để khắc phục những vấn đề vướng mắc trong quá trình

nhân giống in vitro và trồng cây C.orchioides sau ống nghiệm

Với những vấn đề bức thiết trên, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật

nhân giống in vitro và trồng cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) trong vườn ươm” nhằm góp phần bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý hiếm của

Việt Nam

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định môi trường thích hợp tạo vật liệu khởi đầu, nhân nhanh chồi trong

ống nghiệm và lựa chọn giá thể phù hợp cho cây Sâm cau (Curculigo

orchioides Gaertn.) sinh trưởng tốt ở giai đoạn vườn ươm nhằm cung cấp giống

Sâm cau phục vụ phát triển ngoài sản xuất

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu thập từ vùng

Sơn La và đưa vào nuôi cấy mô tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật của Phòng thí nghiệm Phát triển ứng dụng Y sinh công nghệ cao, Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

* Ý nghĩa khoa học:

- Cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc xây dựng quy trình nhân giống cây Sâm cau

- Góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt diệt

- Góp phần phát triển nguồn cây dược liệu có tiềm năng cho ngành dược liệu

* Ý nghĩa thực tiễn:

- Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) là nguồn gen quý hiếm của Việt

Nam đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng, nhân giống và trồng Sâm cau là biện pháp bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm này

- Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn sạch bệnh, giá cả phù hợp, đáp ứng nhu cầu của thị trường, tạo nguồn nguyên liệu quý giá cho ngành dược

- Góp phần từng bước giúp người dân ở vùng núi cao xóa đói giảm nghèo

và đây cũng là một trong những biện pháp tốt để bảo vệ rừng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM CAU

2.1.1 Vị trí phân bố và phân loại

2.1.1.1 Vị trí phân bố

Sâm cau phân bố ở những vùng núi cao 1600m, phía Nam và Tây Nam Trung Quốc, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Lào, Myanma, Pakistan, Papua New Guinea, Philippines, Thái Lan, Việt Nam Ở Việt Nam cây mọc trên các đồi cỏ, nơi ẩm mát, ở một số địa phương như Lai Châu, Tuyên Quang, Cao Bằng, Sơn La, Hòa Bình, Nghệ An, Đắc Lắk và Kon Tum…(Nguyễn Bích Ngọc

và cs., 2015)

2.1.1.2 Phân loại

Sâm cau thuộc chi Curculigo Gaertn Trước đây, chi Curculigo Gaertn

cũng được xếp vào họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) nhưng hiện giờ được tách ra thành họ Sâm cau (Hypoxidaceae)

Dựa trên hệ thống phân loại của A L Takhtajan năm 1987 về nhóm thực vật có hoa và các nhóm thực vật bậc cao có mạch khác, chỉnh lý một phần theo

hệ thống năm 1996 của A L Takhtajan, cây Sâm cau được phân loại như sau:

Bảng 2.1 Phân loại cây Sâm sau

dạng giống thân rễ, bên trong có màu kem; vị nhầy và hơi đắng

Hình 2.1 Thân rễ cây Sâm cau

Nguồn Internet

2.1.2.2 Lá

Lá mọc thành túm từ thân rễ xếp nếp và có gân như lá cau, dài 15 - 45 cm, rộng 2,5 - 3,0 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng nhau, gân song

song, bẹ lá to và dài; cuống lá dài khoảng 10 cm

Hình 2.2 Lá cây Sâm cau

Hình 2.3 Hoa Sâm cau

2.1.3 Đặc điểm sinh thái học

Sâm cau là loài cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc trên

những nơi đất tương đối màu mỡ trong thung lũng, chân núi đá vôi hoặc ven nương rẫy Cây sinh trưởng tốt trong mùa mưa ẩm, phần thân rễ chính dạng củ, cắm sâu xuống đất; ra hoa quả hàng năm; khi quả già, tự mở để hạt phát tán ra xung quanh

2.1.4 Thành phần hóa học

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của sâm cau, các hợp chất được công bố bao gồm: phenolic glycoside; một số hợp chất lignin; các hợp chất aliphatic hydroxyl ketones; các saponin thuộc nhóm cycloartan và nhóm ursan; flavones; alkaloid Bên cạnh đó cây còn chứa các thành phần khác: steroids, đường tự do như glucose, manose, xylose, mucilage, hemicelluloses, polysaccharide và glucoronic acid

Ngoài những hợp chất kể trên, một lượng lớn các acid béo được phân lập

từ dịch chiết dầu của rễ loài C.orchioides gồm: palmitic, oleic, linoleic,

arachidic và behenic acid Có 3 hợp chất steroids tìm được từ thân rễ

C.orchioides là: sitosterol, stigmasterol, yuccagenin và một hợp chất lignin

2.1.6 Thực trạng khai thác loài Sâm cau của Việt Nam

Hiện nay Sâm cau không chỉ được tiêu thụ trong nước mà còn được thương lái người Trung Quốc thu gom và xuất khẩu tiểu ngạch Giá của các cây Sâm cau này được thu gom bán trên thị trường thường từ 300 - 500.000đồng/kg củ tươi

Do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên cây Sâm cau bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt Mặt khác, vùng phân bố của Sâm cau bị khai thác triệt để khiến loài cây này rơi vào tình trạng gần như mất dần trong tự nhiên và được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, 2007

và hạng mục (IUCN, 2012)

2.2 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SÂM CAU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.2.1 Tình hình nghiên cứu Sâm cau trên thế giới

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá cho đến nay 80% dân số trên thế giới dựa vào nền y học cổ truyền để đáp ứng cho nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ban đầu, trong đó chủ yếu là thuốc từ cây cỏ Sự quan tâm về các hệ thống y học

cổ truyền và đặc biệt là các loại thuốc dược thảo, thực tế là đã ngày càng gia tăng tại các nước phát triển và đang phát triển trong hơn hai thập kỷ qua Các thị trường dược thảo quốc gia và toàn cầu đã và đang tăng trưởng nhanh chóng, và hiện đang mang lại rất nhiều lợi nhuận kinh tế

Năm 2011 - 2012 thị trường dược thảo toàn cầu trị giá 80 tỷ $, tại Ấn Độ ngành dược thảo hiện có giá khoảng 16.000 Rs crores Tại Mỹ, thị trường thuốc dược thảo đạt 4,4 tỷ $ với mức tăng trưởng dự kiến gần 4% trong năm 2005, tăng lên đến 4,6 tỷ $ trong năm 2006, 7,9 tỷ $ trong năm 2013 và dự kiến sẽ tăng trong tương lai Thị trường dược thảo toàn cầu ước tính sẽ đạt tới 107 tỷ $ vào cuối năm 2017 Và theo dự báo đến năm 2050, tổng thị trường thuốc dược thảo toàn cầu sẽ tăng lên 5 nghìn tỷ $ (Dagral, 2013)

Hiện nay, thuốc cổ truyền dần trở thành một đề tài quan trọng mang tính toàn cầu Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường

và các yếu tố khác Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này

Việc sử dụng nhiều C.orchioides đã được ghi nhận trong nền y học cổ

truyền của nhiều nước Các bộ phận của cây khác nhau như: gốc, rễ và lá đều có nhiều giá trị dược liệu Thân rễ cũng như rễ củ của cây đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở Ấn Độ, Pakistan và Trung Quốc dùng để điều trị các vấn

đề sức khỏe khác nhau, bao gồm vàng da, hen suyễn, Ngoài ra, loại thảo dược

này đã được coi là một nguồn dùng để thay thế thuốc tăng lực và ngăn ngừa loãng xương

Thân rễ dùng điều trị đái tháo đường Rễ của cây dùng để điều trị đau cơ và

khớp C.orchioides được coi là loại thuốc phục hồi sức khỏe, trẻ hóa và kích thích tình dục Lá của C.orchioides được dùng chống bệnh ung thư (Agrawal, 1997)

Trong những năm gần đây, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu

tìm các biện pháp nhân giống trong chi Curculigo quý hiếm

Nagesh, (2008) đã tái sinh hiệu quả cây C.orchioides thông qua phôi soma

Mô sẹo phôi được gây ra từ thân rễ và tỷ lệ phôi tối đa (62%) đạt được trên môi trường MS chứa 0,5 - 3,0 mg /l 2,4 - D và 0,5 mg/l BAP Cấy chuyển mô sẹo sang môi trường MS + 1 - 4 mg/l BAP dẫn đến phát sinh phôi soma ở tỷ lệ cao với trung bình là 23 ± 0,8 phôi soma/gram Sau khi chuyển sang môi trường 1/2MS phôi soma được chuyển thành cây con hoàn chỉnh đạt 90% Các cây con được trồng vào đất có tỷ lệ sống đạt 65 - 70%

Malviya et al (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2, 2 - dimethyl hydrazide và 2 - chloroethyl trimethyl - amoni clorua (CCC) để tạo chồi non từ mô lá của C.orchioides Môi

trường MS có chứa 1 mg/l IBA và 0,1 mg/l morphactin đã được thử nghiệm để tạo chồi non

ở kẻ lá

Swati Patel et al (2011) tái sinh phôi soma từ cấy lá C.orchioides Gaertn

trên môi trường MS có chứa 8 - 15μM BA Cây con tái sinh đã được chuyển sang trồng trên hỗn hợp đất: cát: phân (1: 1: 1) cho cây sinh trưởng và phát triển tốt

Adiyecha and Jasrai, (2012) đã sử dụng lá C.orchioides được nuôi cấy trên

môi trường 1/2MS (amoni nitrat 0,825 gm/l, kali nitrat 0,9 gm/l) và 0,44 µM BA

Shende et al (2012) đã nhân giống in vitro cây C.orchioides Nuôi cấy thân

rễ khi kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGRs) khác nhau đã tạo được nhiều mô sẹo và tỷ lệ cũng được tái tạo khá cao Thân rễ cây Sâm cau tái sinh tốt trên môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/l BAP và 0,50 mg/l KN Đối với mô sẹo, sự kết hợp của 1,5mg/l BAP + 0,25 mg/l IAA được tìm thấy phù hợp hơn khi kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau được thử nghiệm trong nghiên cứu này Tỷ lệ phần trăm ra rễ khỏe mạnh đạt được trên môi trường

MS có bổ sung 0,25 mg/l NAA và 0,50 mg/l IAA Cây con in vitro được chuyển

ra trồng trong chậu có chứa một hỗn hợp của cát, đất và phân theo tỷ lệ 1: 1: 1

Adiyecha et al (2013) đã nghiên cứu tái tạo tế bào trực tiếp và gián tiếp

Sâm cau bằng phép nhân sinh khối Chồi nhân được nuôi cấy từ mô lá thông qua

sự tạo tế bào trực tiếp trong môi trường Murashige and Skoog (MS) chứa ½ nồng độ muối nitơ và 0,44 µM BA Gần 10 chồi được tạo ra từ mỗi mẫu mô lá (dài 1cm) Mặt khác, môi trường MS với nồng độ toàn phần muối nitơ và 2,22 µM BA, kích thích hình thành mô sẹo và tạo ra 8 chồi từ mỗi mẫu lá (dài 1cm)

Nahid Babaei et al (2014) đã nghiên cứu tái sinh loài Sâm cau (Curculigo

latifolia) từ đỉnh chồi thời gian ra chồi nhanh nhất và số chồi đạt cao nhất trên

môi trường MS có bổ sung thidiazuron (0,5 mg/l) với indole - 3 - butyric acid (0,25 mg/l) sau 14 tuần nuôi cấy Tỷ lệ chồi ra rễ và rễ dài nhất trên môi trường

có bổ sung 0,25 mg/l IBA

Dutta Gupta and Sahoo, (2015) sử dụng đèn LED để theo dõi sự biến đổi quá trình oxy hóa trong giai đoạn nảy chồi in vitro của Sâm cau, sự thay đổi

trong quá trình oxy hóa gây ra bởi sự rối loạn trạng thái ổn định của các gốc tự

do có oxy (ROS), kết quả chiếu xạ dưới ánh sáng của các bước sóng cụ thể được tạo ra bởi các đi-ốt phát sáng (LED) có khả năng điều chỉnh khả năng tái sinh chồi của Sâm cau Những thay đổi trong phản ứng oxy hóa gây ra bởi đèn LED được nghiên cứu, khi sử dụng ánh sáng đỏ (630 nm), ánh sáng xanh (470 nm) và

sự kết hợp của chúng (1:1) làm nguồn ánh sáng, kết quả được ước tính bằng sự thay đổi của phản ứng của hàm lượng hydro peroxide (H2O2) nội tại, mức độ lipid peroxid hóa và hoạt động của các enzym chống oxy hóa trong quá trình tái sinh chồi Sau 28 ngày chiếu sáng, dưới ánh sáng đèn LED màu xanh (BL) cho thấy sự thay đổi đáng kể (p<0,05) về số lượng trung bình giữa chồi mầm trên những mô cấy đáp ứng so với các công thức khác bao gồm cả đối chứng (ánh sáng huỳnh quang, 40 W, 300 - 700 nm) Công thức chiếu ánh sáng LED màu đỏ

có khả năng ức chế sự tái sinh chồi Một ảnh hưởng bất lợi của bức xạ ánh sáng LED đến sự tái sinh chồi và những thay đổi đồng thời các mức ROS và các enzyme hoạt động chống oxy hóa đã được thu thập

Nagesh and Shanthamma, (2016) nghiên cứu sự nảy mầm của phôi Sâm

cau được bao bọc bằng môi trường natri alginat Phôi mô sẹo được tạo ra trên môi trường cơ bản Murashige and Skoog (1962) (MS) có chứa 0,5 - 3 mg/1 của 2,

4 - dichlorophenoxyacetic acid (2, 4 - D) và 0,5 mg/1 N6 - benzylaminopurine (BAP) từ những mẫu phôi thân rễ Chuyển phôi mô sẹo tới môi trường MS với 1

- 4 mg/1 BAP dẫn đến sự hình thành phôi soma ở tỷ lệ cao với mức trung bình

23 ± 0,8 phôi soma trên mỗi gam phôi mô sẹo trong môi trường MS với BAP (1 mg/l) Hơn nữa, sự nảy mầm của các phôi Soma Sâm cau được môi trường natri alginat bao bọc đã được thử nghiệm trên môi trường ½ nồng độ cơ bản Murashige and Skoog (MS) được bổ sung thêm nước dừa (10% v/v) Tần suất tái sinh từ các phôi soma được môi trường bao bọc bị ảnh hưởng đáng kể bởi nồng

độ của natri alginate và thời gian tiếp xúc với canxi clorua Phôi soma được môi trường cơ bản MS bao bọc với 2,5% natri alginate hòa tan trong dung dịch muối được ghi nhận sự nảy mầm cao hơn đáng kể so với các công thức khác Thời gian ủ tương đối ngắn với dung dịch canxi clorua cung cấp cho môi trường bao bọc đồng nhất của phôi soma đã cho tỷ lệ phần trăm nảy mầm cao nhất (80%)

Rajasekharan et al (2016), sử dụng rễ củ và đỉnh sinh trưởng của chồi làm vật liệu nuôi cấy Sau đó lá và rễ được hình thành in vitro sẽ được sử dụng làm

mẫu cấy trong môi trường MS được bổ sung 8,87 µM BA nhằm tái sinh chồi Giai đoạn hình thành mô sẹo được bỏ qua để duy trì mẫu nuôi cấy gốc và thúc đẩy sự tái sinh trực tiếp Quá trình hình thành rễ đồng thời cũng thành công trong

điều kiện nuôi cấy mô cần thiết với tỷ lệ sống sót 100% Việc bảo tồn in vitro

được hoàn thành ở 100C và các bình cấy có thể được duy trì trong thời gian tối thiểu là 1 năm mà không cần cấy chuyển

Samaneh Zokae et al (2016) sử dụng đỉnh sinh trưởng và các phần mô cấy

từ đốt thân và mô sẹo của cây Sâm cau từ lá, đốt và các mô cấy để nuôi cấy Ở nồng độ BAP (1 mg/l) cho thấy hiểu quả tốt nhất (90 và 80%) từ cả hai mẫu mô cấy Tương tự, mô sẹo cho phản ứng tốt nhất được quan sát thấy trên môi trường

MS bổ sung 2,4 - D + KIN (1 + 1 mg/l) tạo nhiều mô sẹo nhất

Sudha Sahay and Vincent, (2017) để giảm chi phí nhân giống Sâm cau tác giả sử dụng phương pháp nuôi cấy trong bình lỏng lắc thông qua sự hình thành trực tiếp từ các chồi nách lá của mẫu mô lá Các đoạn lá (dài 1 cm) được nuôi cấy trong môi trường MS lỏng, không bổ sung chất kích thích tăng trưởng Khoảng 95% các mẫu cấy đã hình thành các chồi nách lá là 5 chồi/1 đoạn lá trong thời gian nuôi cấy 6 tuần Tổng số lượng chồi nách lá tạo ra là 250 chồi nách/lít môi trường MS lỏng Trong thời gian nuôi cấy, từ tuần thứ 3 trở đi, môi trường cấy các đoạn lá đã được quan sát thấy màu sẫm, do sự bài tiết các hợp chất phenol từ các đầu cắt của các đoạn lá, đã làm ức chế sự phát triển của các chồi nách lá Vì vậy, 6 tuần/lần môi trường lỏng đã được thay đổi để đảm bảo cho sự phát triển liên tục của chồi Sự nảy

mầm của các chồi là 100% trên môi trường thạch MS (môi trường tĩnh) khi được bổ sung với các hormon tăng trưởng BAP: KIN: NAA (với tỷ lệ 1,0: 0,1: 1,0 mg/l) Các đoạn rễ củ cũng phát triển nhiều rễ khi được cấy vào môi trường MS lỏng, mà không bổ sung hormon tăng trưởng

2.2.2 Tình hình nghiên cứu Sâm cau trong nước

Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) là cây thuốc quý Trên thế giới đã

có rất nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu nhân giống và phân tích các thành phần hóa học của cây Sâm cau Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về cây Sâm cau

Võ Châu Tuấn và cs (2011) đã nghiên cứu tái sinh chồi đỉnh Sâm cau

(Curculigo orchioides Gaertn.) trên môi trường MS bổ sung 4,0 mg/l BA Đỉnh

sinh trưởng (dài khoảng 1 cm) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung Kn,

BA, Kn + BA, hoặc IBA + BA cho cảm ứng nhân nhanh chồi Số chồi đạt lớn nhất trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l IBA + 2,5 mg/l BA (với 17,90 chồi/mẫu cấy) Chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung IBA hoặc IBA +

BA, hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,75 mg/l IBA và 0,75

mg/l NAA với tỉ lệ 1:1 (đạt 64 rễ/mẫu) Cây in vitro đưa ra nhà lưới, 86% cây

sống và thích nghi với điều kiện tự nhiên

Nguyễn Thị Cúc và cs (2014) khảo sát ảnh hưởng của ba nhóm hợp chất hữu cơ khác nhau: (i) nhóm chuối, khoai tây, nước dừa; (ii) nhóm peptone,

triptone, bột nấm men và (iii) nhóm tảo Spirulina lên quá trình sinh trưởng và phát triển của lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) in vitro Kết quả cho thấy,

cả ba nhóm hợp chất hữu cơ đều có tác dụng làm gia tăng số lượng chồi, đặc biệt

tảo Spirulina không những kích thích quá trình tạo chồi mà còn làm gia tăng tỷ lệ sống của mẫu cấy lan hài hồng in vitro Trong nhóm chuối, khoai tây và nước

dừa thì chuối có tác động mạnh nhất lên quá trình tạo chồi và số chồi đạt cao nhất

ở nồng độ 20 g/l với 3,8 chồi/mẫu cấy Đối với nhóm peptone, triptone và bột nấm men, bột nấm men có tác động mạnh nhất lên quá trình tạo chồi và số chồi đạt cao nhất (3,9 chồi/mẫu cấy) ở nồng độ 1 g/l bột nấm men Tỷ lệ sống của

chồi đạt 100% khi bổ sung bột tảo Spirulina và số chồi đạt cao nhất là 4,0

chồi/mẫu cấy ở nồng độ 50 mg/l

Năm 2016, Trung tâm ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

Tp Hồ Chí Minh đã nghiên cứu nhân giống Sâm cau tái sinh chồi từ mẫu lá

Pham Thanh et al (2018) nhân giống Sâm cau bằng phương pháp giâm

hom thân rễ (đầu thân rễ, giữa thân rễ và đoạn cuối thân rễ) đến khả năng tạo chồi và rễ của cây Sâm cau, kết quả cho thấy khả năng tạo chồi và rễ cao nhất là giâm hom đoạn cuối thân rễ

Trương Thị Bích Phượng và cs (2018) nghiên cứu tạo chồi in vitro cây

Sâm cau từ đoạn thân Đoạn thân (khoảng 2,0 cm) của cây Sâm cau được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 15-18 phút, kết quả khử trùng với thời gian 16 phút có hiệu quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 69,08% Bổ sung 3,5 mg/l BAP vào môi trường MS, thích hợp cho sự tái sinh chồi từ đoạn thân tự nhiên với

tỉ lệ mẫu tái sinh là 96,46% và số chồi/mẫu cao nhất đạt 2,65 Môi trường MS bổ sung riêng lẻ 1,5 mg/l BAP; 1,5 mg/l KIN và 1,5 mg/l TDZ thích hợp cho sự tái

sinh chồi từ mẫu lá cây sâm cau in vitro, với tỉ lệ mẫu tái sinh chồi lần lượt là 96,68%; 92,88% và 85,76% Tiến hành nhân chồi từ chồi đỉnh in vitro trên môi

trường riêng lẻ BAP và KIN Sau 6 tuần nuôi cấy, môi trường MS bổ sung 3,0

mg/l BAP thích hợp nhất cho sự nhân chồi từ đỉnh chồi cây sâm cau in vitro có nguồn gốc từ đoạn thân tự nhiên với 7,44 chồi/mẫu và có nguồn gốc từ mẫu lá in

vitro với 10,13 chồi/mẫu

Nguyễn Thị Lài và cs (2018) nhân giống in vitro cây Sâm cau (Curculigo

orchioides Gaertn.) từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, kết quả cho thấy trên môi

trường MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l IBA + 1,0 mg/l AgNO3 + 50 mg/l tảo Spirulina là

thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro, với số chồi 20,8 chồi/mẫu và 5,2

lá/cây, sau 6 tuần nuôi cấy Tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất, chất lượng bộ rễ tốt nhất trong môi trường MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 0,5 mg/l IBA Hỗn hợp đất mùn + vụn xơ dừa (tỷ lệ 70:30) được xác định là giá thể phù hợp nhất cho sinh trưởng của cây con trong vườn ươm, sau 10 tuần nuôi trồng, tỷ lệ sống đạt 98%, chiều cao cây đạt 16,6 cm, 6,9 lá/cây

và 6,3 rễ mới/cây

Tóm lại, Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) là cây thuốc quý trong y

học cổ truyền Việt Nam và các nước Châu Á khác, có giá trị y học và thương mại cao và có tiềm năng phát triển ở Việt Nam cũng như trên thế giới Hiện nay loài Sâm cau đã bị suy giảm nghiêm trọng, đang bị đe dọa do bị khai thác để bán làm thuốc và do nạn chặt phá rừng hủy hoại nơi cư trú của cây Hầu hết các nghiên

cứu trên thế giới chỉ đề cập về nhân giống in vitro và thành phần hóa sinh của

Sâm cau Tuy nhiên kết quả nhân giống in vitro mà các tác giả thu được chưa

thực sự khả quan Để đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống Sâm cau có chất lượng tốt, cần thiết có những biện pháp kỹ thuật để nhân giống và phát triển loài dược liệu có giá trị này của Việt Nam

2.3 CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá trình này có thể chia thành các nhân tố sau:

2.3.1 Môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được

xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy Môi trường nuôi cấy được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng

trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Cho đến nay, đã có

nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS, VW, RE, N6…) tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau:

+ Nguồn các bon: Trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang

hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô Nguồn các bon ở đây là các loại đường khoảng 20 - 30 mg/l có tác dụng giúp mô

tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài ra

nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Người ta thường sử dụng

2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994)

+ Nguồn Nitơ: Tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát

triển mô Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4 + và NO3- Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4 +

Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp

sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất

+ Các nguyên tố đa lượng: Là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S,

Mg, Ca…cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy Nhìn chung, các nguyên tố này được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm

Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau có thể lựa chọn sử dụng Nói chung, môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi trường giàu kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn

+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, Bo, Zn,…là các nguyên tố rất quan

trọng do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây

+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được vitamin,

nhưng không đủ cho nhu cầu Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô

và giai đoạn nuôi cấy Các vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l

+ Bột tảo Spirulina có chứa các nhóm chất cần thiết cho sự sinh trưởng và

phát triển của cây như các vitamin, các amino acid, các chất khoáng đa lượng, vi

lượng (Dal et al., 2014) Bổ sung bột tảo Spirulina ở nồng độ 50 mg/l có tác động hiệu quả đến tỷ lệ sống của chồi và số chồi đạt của lan Paphiopedilum

delenatii (Nguyễn Thị Cúc và cs., 2014)

2.3.2 Các chất điều hòa sinh trưởng

Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic axít Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy

+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid),…

trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ

+ Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân

chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan Hợp chất thường sử dụng là: Thidiazuron (TDZ) Trong nuôi cấy mô để kích thích sự

nhân nhanh người ta thường sử dụng Cytokinin với nồng độ 10-6 - 10-4 M (Lê Văn Chi, 1992)

Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trường Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6

Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường

độ thấp gây nên sự tạo chồi Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của

mô sẹo Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux

+ Nhiệt độ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô Theo kết quả nghiên cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200C/150C hoặc 200C/180C tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn Ở nhiệt

độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn Còn ở nhiệt độ cao lại tạo nhiều

tế bào không có tổ chức Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ 25 - 300C và ban đêm từ 17 - 200C

+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% để đảm bảo sự phát sinh phát triển bình thường của cây nuôi cấy mô

2.3.4 Vật liệu nuôi cấy

Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình

nhân giống in vitro Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có

tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công Thực tế cho thấy các loài

tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tượng tầng… sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995)

2.3.5 Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của quá trình

nuôi cấy in vitro Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi cấy

hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn

sau sẽ bị ngừng lại Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm

bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng, bàn nuôi cấy vô trùng

Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh

Các thiết bị như: nồi hấp, tủ sấy, buồng, bàn cấy vô trùng đều phải đảm bảo vô trùng để mẫu được sạch, tinh khiết trước khi vào nuôi cấy

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được tiến hành tại Phòng thí nghiệm phát triển Ứng dụng Y sinh công nghệ cao, Viện Ứng dụng Công nghệ, Thanh Xuân Bắc, Thanh Xuân,

Hà Nội

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Từ tháng 1/2018 - tháng 7/2019

3.3 ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) được thu thập ở Sơn La

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu Sâm cau:Cây Sâm cau được thu thập ở Sơn La

Hình 3.1 Mẫu Sâm cau đưa vào nuôi cấy in vitro

- Môi trường nuôi cấy:

+ Môi trường nuôi cấy: Murashige & Skoog (MS) được coi như là một môi trường cơ bản, được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật MS được phát

minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio Murashige và Skoog Folke K vào năm

1962 trong quá trình tìm kiếm của Murashige cho một loại hormone mới

+ Các chất kích thích sinh trưởng được sử dụng trong thí nghiệm là: IBA

(Indole - 3 - butyric acid), TDZ (thidiazuron) Ngoài ra trong môi trường nuôi cấy còn bổ sung phloroglucinol (PG), AgNO3 và các phụ gia khác như tảo Spirulina,

đường, nước dừa, than hoạt tính

IBA là hormone thuộc nhóm Auxin Trong nuôi cấy mô thực vật IBA và các Auxin khác được sử dụng để bắt đầu sự hình thành rễ trong ống nghiệm trong một quy trình gọi là vi nhân giống Xuất xứ: Đức

TDZ có hoạt tính giống như Cytokinin, đẩy nhanh tiến trình trưởng thành, được cấp bằng sáng chế vào đầu những năm 1980 bởi công ty Đức Schering AG Xuất xứ: Đức

Hình 3.3 B1 Thái Lan Hình 3.4 Atonik 1.8 SL

+ Growmore (N: P: K = 30: 10: 10) có nguồn gốc từ Mỹ, nhập khẩu từ Công ty TNHH Tư vấn - Thương mại Mai Huy Thành phần: N: 30%; P2O5: 10%; K2O: 10%; Cu: 0,05%; Fe: 0,10%; Mn: 0,05%; Mo: 0,0005%; Zn: 0,05%, giúp cây đẻ nhánh

khoẻ, ra lá tốt

+ B1 Thái Lan: nhập khẩu từ Công ty TNHH Tư vấn - Thương mại Mai

Huy; Thành phần: P2O5: 2,0%; Fe: 0,10%; Fe - EDTA: 0,10%; B1: 0,10 %; α NAA: 0,04%, giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt

+ Atonik 1.8 SL: được đăng kí bởi Ashi chemical MFG Co., Ltd, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển cho cây

- Chất khử trùng nấm, bệnh:

Daconil 75WP: có nguồn gốc từ Nhật Bản, đóng gói và phân phối bởi công

ty TNHH Việt Thắng; Hoạt chất Chlorothalonil: 75%; là thuốc trừ bệnh chống nấm diệt khuẩn, phổ tác dụng rộng

- Trang thiết bị:

+ Buồng cấy vô trùng (Bioiogical safety Cabinets); Nồi hấp khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy Nhật Bản; Cân điện tử của Đức; Máy đo pH; Tủ sấy…

+ Bình tam giác có kích thước từ 250ml - 500ml, pipet loại 1ml, dụng cụ nuôi cấy, phễu lọc, đũa thủy tinh…

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro cây

Sâm cau;

- Nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Sâm cau;

- Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh;

- Nghiên cứu kỹ thuật trồng cây Sâm cau trong vườn ươm

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp nhân giống in vitro

Các chất kích thích sinh trưởng được sử dụng trong thí nghiệm nuôi cấy và nhân nhanh là:

- IBA (Indole - 3 - butyric acid), TDZ (thidiazuron) nồng độ dao động từ 0 - 2 mg/l tùy theo mục đích thí nghiệm

- Các chất khác như AgNO3, phloroglucinol (PG) và chất phụ gia như: tảo

Spirulina, đường, nước dừa, than hoạt tính

* Phương pháp lấy mẫu, khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu:

Chọn các chồi non được tách ra từ cây mẹ khỏe mạnh, không bị sâu bệnh,

rửa sạch bằng nước xà phòng và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 2 - 3 lần Tiếp theo khử trùng mẫu bằng oxy già (15% H2O2), hypochlorite - Na (2% NaOCl) rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng, sau đó cắt lấy đỉnh sinh trưởng và cấy trên các môi trường thí nghiệm: Murashige & Skoog bổ sung 30 g/1 sucrose, 5,5 g/1 agar, 200 ml/l nước dừa, 1g/l than hoạt tính, pH 5,5 và bổ sung chất kích thích sinh trưởng TDZ ở các nồng độ khác nhau Những chồi non tái sinh

từ các đỉnh sinh trưởng được dùng làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo

* Phương pháp nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh:

Các chồi non tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng được cấy trên môi trường cơ bản MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt

tính, bổ sung TDZ, IBA, phloroglucinol (PG), AgNO3, tảo Spirulina…để khảo

sát khả năng nhân nhanh chồi

Các chồi Sâm cau in vitro có 2 - 3 lá, chồi chưa có rễ, chồi khỏe mạnh được

tách ra và cấy sang môi trường ra rễ MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa, pH 5,5 có bổ sung IBA để khảo sát khả năng hình thành rễ

+ Điều kiện nuôi cấy: Cường độ ánh sáng: 2400 - 3000 lux, nhiệt độ phòng

nuôi: 18 - 250C, số giờ chiếu sáng: 16 giờ/ngày

* Phương pháp đưa cây ra vườn ươm:

Các cây sau khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn chiều cao khoảng 5 - 6 cm, có khoảng 3 - 4 lá, 5 - 7 rễ để bình cây ra ngoài vườn ươm 5 ngày Các cây sau khi đưa ra khỏi ống nghiệm được rửa sạch agar, rải đều trên khay sạch để trong 1 giờ, rồi trồng vào chậu nhựa với kích thước chậu (12 x 18cm) trên các giá thể và phân bón khác nhau, cây được trồng vào vụ Xuân

(15/2) để khảo sát khả năng sinh trưởng của cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm

+ Các thí nghiệm ngoài vườn ươm: Được đặt trong nhà lưới của Phòng thí

nghiệm Ứng dụng Y sinh công nghệ cao, Viện Ứng dụng Công nghệ

3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.5.2.1 Nghiên cứu khử trùng và tạo vật liệu khởi đầu

tỷ lệ sống vô trùng của mẫu cấy

Bảng 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H 2 O 2 và NaOCl

Thời gian và nồng độ xử

lý (NaOCl)

CT2 15% H 2 O 2 + 10 phút CT2 2% NaOCl + 10 phút CT3 15% H 2 O 2 + 15 phút CT3 2% NaOCl + 15 phút CT4 15% H 2 O 2 + 20 phút CT4 2% NaOCl + 20 phút CT5 15% H 2 O 2 + 25 phút CT5 2% NaOCl + 25 phút

Thí nghiệm gồm 5 công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất chất kích thích sinh trưởng TDZ đến khả năng tạo vật liệu khởi đầu

CT1 (Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa +

3.5.2.2 Nghiên cứu nhân nhanh chồi

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng (TDZ + IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi

CT1 (Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa +

1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ, pH 5,5)

CT2: Nền + 0,25 mg/l IBA

CT3: Nền + 0,5 mg/l IBA

CT4: Nền + 0,75 mg/l IBA

CT5: Nền + 1,0 mg/l IBA

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc

lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của phloroglucinol (PG) đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau

CT1(Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa + 1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l IBA, pH 5,5)

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc

lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng tảo Spirulina đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm cau

CT1(Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa +

1 g/l than hoạt tính + 1,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l IBA + 1 mg/l AgNO3, pH 5,5)

CT2: Nền + 50 mg/l tảo Spirulina

CT3: Nền + 100 mg/l tảo Spirulina

CT4: Nền + 150 mg/l tảo Spirulina

CT5: Nền + 200 mg/l tảo Spirulina

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc

lại, mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 7 chồi, theo dõi sau 6 tuần nuôi cấy

3.5.2.3 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của IBA đến tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Khi các chồi có khoảng 2 - 3 lá thì chuyển sang giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh CT1 (Đ/C): Nền (MS + 30 g/1 sucrose + 5,5 g/1 agar + 200 ml/l nước dừa +

3.5.2.4 Nghiên cứu đưa cây Sâm cau in vitro ra vườn ươm

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của giá thể khác nhau đến sinh trưởng và phát triển của cây in vitro ngoài vườn ươm

Thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với 3 lần nhắc lại Mỗi công thức thí nghiệm 30 cây, 6 chậu/công thức, mỗi tuần theo dõi 1 lần, thời gian theo dõi 10 tuần Các cây con khi trồng được tưới nước 1 - 2 lần/ngày tùy theo điều kiện thời tiết

Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng một số loại phân bón qua lá đến sinh trưởng và phát triển của cây in vitro ngoài vườn ươm

Thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) với 3 lần nhắc lại Mỗi công thức thí nghiệm 30 cây, 6 chậu/công thức, mỗi tuần theo dõi 1 lần, thời gian theo dõi 8 tuần sau trồng

3.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi

* Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro:

- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu đưa vào x 100%

- Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống/Tổng số mẫu đưa vào x 100%

- Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Tổng số mẫu tạo chồi/Tổng số mẫu đưa vào x 100%

- Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ/Tổng số chồi theo dõi x 100%

- Chiều cao cây (cm) = Tổng chiều cao các cây/Tổng số cây theo dõi

- Số lá/chồi (lá) = Tổng số lá thu được/Tổng số chồi

- Số rễ/cây (rễ) = Tổng số rễ thu được/Tổng số chồi

- Số chồi/mẫu (chồi) = Tổng số chồi thu được/Tổng số chồi theo dõi

* Các chỉ tiêu theo dõi trong vườn ươm:

- Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống/Tổng số cây đưa ra trồng ngoài vườn ươm x 100%

- Chiều cao cây (cm) = Tổng chiều cao của các cây theo dõi/Tổng số cây theo dõi Chiều cao cây được đo từ mặt chậu đến đỉnh sinh trưởng của cây

- Số lá TB/cây (lá) = Tổng số lá của các cây trong thí nghiệm/Tổng số cây thí nghiệm

3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phương pháp thống kê sinh học để phân tích các số liệu thí nghiệm trên chương trình EXCEL và IRRISTAT 5.0

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 NGHIÊN CỨU KHỬ TRÙNG TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO NUÔI

CẤY IN VITRO CÂY SÂM CAU

Phương pháp nhân giống in vitro sử dụng đỉnh sinh trưởng làm vật liệu

khởi đầu có ưu điểm cây con vẫn giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ, hệ số nhân giống cao hơn so với các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống Tuy nhiên, do chồi được lấy ngoài tự nhiên nên cần phải khử trùng đảm bảo cho mẫu đưa vào nuôi cấy sạch, có khả năng phát sinh hình thái

Đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy từ ngoài vào điều kiện nuôi cấy vô

trùng in vitro Vì vậy, đối với tất cả các loài cây trồng khác nhau, việc lựa chọn

loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp có ý nghĩa đối với thành

công của quá trình nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đạt được các yêu cầu sau:

Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại, phân hóa và sinh trưởng tốt.

4.1.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy

Các mẫu nuôi cấy được đưa vào khử trùng bằng H2O2, NaOCl là nhóm chất

ít gây độc hại cho cơ thể con người Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả được trình bày

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu sống (%)

Khi thời gian khử trùng tăng từ 5 phút đến 25 phút tỷ lệ mẫu nhiễm giảm, nhưng số mẫu chết tăng do thời gian khử trùng lâu Tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao nhất là sau 15 phút (41,9%), tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất là sau 5 phút (83,8%) Khi tăng thời gian khử trùng lên 25 phút thì tỷ lệ mẫu chết tăng lên 56,2%, bên cạnh

đó khi tăng thời gian khử trùng cho thấy ảnh hưởng yếu đến tỷ lệ mẫu sống Tỷ

lệ mẫu sống rất thấp, chỉ đạt từ 12,4 - 41,9% Như vậy, tạo vật liệu khởi đầu khử trùng từ chồi bên và chồi đỉnh của cây Sâm cau là tương đối khó, mẫu có tỷ lệ nhiễm cao

Hình 4.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng H 2 O 2 đến tỷ lệ mẫu sống

Từ kết quả trên có nhận xét H2O2 là chất khử trùng bề mặt yếu đối với mẫu

cây Sâm cau đưa vào nuôi cấy in vitro, chính vì vậy chúng tôi tiếp tục thử

nghiệm với loại chất khử trùng khác NaOCl Kết quả được trình bày ở bảng 4.2 Qua bảng 4.2 và hình 4.2 cho thấy: Khi sử dụng chất khử trùng NaOCl với nồng độ như nhau (2%) trong thời gian khử trùng khác nhau thì sự ảnh hưởng lên các mẫu cấy Sâm cau là khác nhau, cụ thể:

Khi thời gian xử lý tăng từ 5 đến 15 phút, tỷ lệ mẫu sống tăng theo chiều thuận, sau đó giảm nhẹ ở ngưỡng 20 phút và khi tăng thời gian khử trùng lên 25 phút, tỷ lệ mẫu sống giảm xuống rõ rệt (81,0 - 52,4%) Sau 4 tuần theo dõi, tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất (81,0%) ở nồng độ 2% NaOCl (15 phút)

Tỷ lệ mẫu chết có xu hướng tăng rất nhanh theo chiều thuận khi thời gian