(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vaccin

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lê Thu Hương Tên luận văn: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus Viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ĐỘC VÀ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM VACCIN

Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Đình Thâu

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, các kết quả nghiên cứu, các số liệu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất cứ một công trình khoa học nào cũng như chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Thu Hương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn

bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Trịnh Đình Thâu, trưởng Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Ban giám đốc, Ban quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn TS Tạ Hoàng Long, giám đốc Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương I, tập thể lãnh đạo, các cán bộ công nhân viên chức trong trung tâm, đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài

Tôi cũng xin phép được gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn

bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày … tháng ….năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Thu Hương

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis extract x

Phần 1 Mở đầu 1

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan vịt 3

2.1.1 Lịch sử và phân bố bệnh 3

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới 5

2.1.3 Tình hình bệnh Viêm gan vịt ở Việt Nam 8

2.2 Virus viêm gan vịt 9

2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt 9

2.2.2 Cấu trúc hệ gen Picornavirus 9

2.2.3 Quá trình nhân lên của virus 11

2.2.4 Đặc tính nuôi cấy 13

2.2.5 Đáp ứng miễn dịch 15

2.2.6 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt type I (DHV-1) 16

2.2.7 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt 21

2.2.8 Chẩn đoán 21

2.2.9 Vắc xin và chế phẩm sinh học phòng bệnh 22

Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 25

3.1 Vật liệu nghiên cứu 25

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất nghiên cứu 25

3.1.3 Thiết bị, máy móc 26

3.1.4 Địa điểm nghiên cứu 27

3.2 Nội dung nghiên cứu 27

3.2.1 Xác định đặc tính sinh học của giống virus Viêm gan vịt cường độc 27

3.2.2 Ứng dụng chủng virus Viêm gan vịt cường độc để kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống 27

3.3.2 Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của giống 28

3.3.3 Phương pháp thu nhận bảo quản mẫu, tiếp truyền virus giống 28

3.3.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp 28

3.3.5 Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm 29

3.3.6 Phương pháp giải trình tự gen của virus 30

3.3.7 Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Theo TCVN 8685-2:2011 32

3.3.8 Xử lý số liệu trong nghiên cứu 33

Phần 4 Kết quả và thảo luận 34

4.1 Kết quả xác định đặc tính sinh học; giải mã gen đặc trưng, xây dựng dữ liệu sinh học của giống virus viêm gan vịt cường độc 34

4.1.1 Kết quả xác định đặc tính sinh học của virus Viêm gan vịt cường độc 34

4.1.2 Kết quả giải mã gen đặc trưng, xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống Viêm gan vịt cường độc 39

4.2 Ứng dụng giống virus viêm gan vịt cường độc trong công tác kiểm nghiệm 45

4.2.1 Kết quả kiểm tra cảm quan 47

4.2.2 Kết quả kiểm tra thuần khiết 47

4.2.3 Kiểm tra tính an toàn của vắc xin (Theo TCVN 8685-2:2011) 48

4.2.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp công cường độc 48

Phần 5 Kết luận và đề nghị 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

Tài liệu tham khảo 52

Phụ lục 55

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

EID50 50 percent Embryo Infectious Dose

ELD 50 50 percent Embryo Lethal Dose

PCR Polymerase Chain Reaction

RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các chủng viêm gan vịt của Việt Nam và thế giới cung cấp chỉ thị gen

để phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 20

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra vô trùng giống virus Viêm gan vịt cường độc 35

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra thuần khiết giống virus Viêm gan vịt cường độc 36

Bảng 4.3 Kết quả xác định LD 50 của virus Viêm gan vịt cường độc ở 2 đợt thí nghiệm 37

Bảng 4.4 Danh sách các mồi dùng cho phản ứng PCR/RT-PCR trong nghiên cứu virus Viêm gan vịt 40

Bảng 4.5 Trật tự sắp xếp nucleotide và amino acid trong hệ gen virus Viêm gan vịt cường độc 45

Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 47

Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 48

Bảng 4.8 Kết quả công cường độc bằng virus Viêm gan vịt cường độc 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Vịt chết thời điểm 48 giờ giống virus Viêm gan vịt cường độc và hình

ảnh Gan xuất huyết hoại tử 38 Hình 4.2 Sơ đồ bố trí mồi thực hiện PCR và quá trình giải mã hệ gen virus viêm

gan vịt cường độc thuộc DHAV-3 39 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR/PCR nhân gen kháng nguyên VP1 40 Hình 4.4 Điện di kiểm tra kết quả cắt ADN plasmid tái tổ hợp bằng enzyme

giới hạn EcoRI 41 Hình 4.5 Trình bày chuỗi gen VP1 chủng virus viêm gan vịt cường độc 42 Hình 4.6 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng viêm gan vịt cường độc -

DN2 của Việt Nam và thế giới (thuộc DHAV-3) dựa trên cơ sở phân tích chuỗi gen VP1 về thành phần nucleotide bằng chương trình MEGA4.0 43 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR hệ gen virus viêm gan vịt cường độc 44

Hình 4.8 Vịt ở lô gây miễn dịch (dấu đầu xanh) khoẻ mạnh và vịt lô đối chứng chết 49

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Lê Thu Hương

Tên luận văn: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus Viêm

gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin”

Nội dung nghiên cứu

- Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc thông qua các bước cấy truyền, gây nhiễm trên tế bào, xác định độc lực, xác định đặc tính ổn định, tính kháng nguyên của giống; Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống Giải mã toàn bộ hệ gen của chủng virus cường độc đang lưu giữ

- Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt bằng phương pháp công cường độc với chủng cường độc viêm gan vịt

Phương pháp

- Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp

- Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm

- Phương pháp giải trình tự gen của virus: tách chiết ARN tổng số; Phương pháp RT- PCR

- Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Kiểm tra độ thuần khiết; an toàn; hiệu lực

- Xử lý số liệu trong nghiên cứu

Kết quả chính và kết luận

- Giống virus Viêm gan vịt không bị tạp với các vi khuẩn hay gặp Về độ tinh khiết giống không lẫn Mycoplasma và Salmonella

- Xác định liều gây chết 50% vịt (LD50): 10 6,31

- Giải mã gen kháng nguyên VP1 của chủng viêm gan vịt cường độc có độ dài là

720 bp và được xác định thuộc genotype III (DHAV-3) Truy cập Ngân hàng gen sử

dụng chuỗi nucleotide mới thu nhận cho thấy chủng virus phân tích thuộc virus viêm gan vịt nhóm A (duck hepatitis A), genotype III (DHAV-3)

- Đã giải mã toàn bộ hệ gen thu được chuỗi ADN của toàn bộ hệ gen virus viêm gan vịt cường độc gồm 7777 nucleotide Dựa vào trật tự các gen trong hệ gen của các chủng virus viêm gan vịt đã công bố, xác định được trật tự sắp xếp của các gen trong hệ gen của chủng virus viêm gan vịt cường độc

- Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy: Vị trí phân loại của chủng virus cường độc: Group IV:ss RNA positive-strand viruses; Order: Nidovirales; Family: Picornaviridae; Genus: Avihepatovirus; (Genotype: DHAV-3)

- Ứng dụng thành công giống cường độc Viêm gan vịt trong kiểm nghiệm vắc xin Qua kết quả này đã chứng tỏ giống cường độc Viêm gan vịt sau thời gian tăng cường và lưu giữ vẫn giữ được đặc tính sinh vật học, đặc tính kháng nguyên, tính độc của giống

THESIS EXTRACT

Author: Le Thu Huong

Thesis title: "Study of some biological characteristics, molecular biology of virulent

Duck Hepatitis Virus and use the virulent Duck Hepatitis Virus in quality control of the vaccine"

University: Vietnam National University of Agriculture

Research purposes

Determine some of biological characteristics of virulent duck hepatitis virus (DHV) Determine genes characteristic of virulent DHV Use the virulent Duck Hepatitis Virus in control the vaccine

Research content

- Determine the biological characteristics of virulent DHV including the cultures, the ability to infect cells, virulence, stability, antigenicity of the strain; Genome decoding features built molecular biological data Decoding the genome of the virulent DHV is stored

- Quality control of duck hepatitis vaccine, inactivated by virulent strains of duck hepatitis virus

Method

- Method of culture of chicken embryo fibroblasts a layer

- Method of determining the 50% lethal dose

- Methods of gene sequencing of the virus: the total RNA extraction; PCR method

RT Methods of testing vaccines: purity; safe; effect

- Data processing research

Main results and conclusions

- Duck hepatitis virus strain is not contaminated with common bacteria Mycoplasma and Salmonella are not appearing

- Determination of the lethal dose 50% duck (LD 50 ): 106.31

- Decoding of the VP1 gene virulent duck hepatitis is 720 bp in length and

belong to genotype III (DHAV-3) Access the gene bank using the new nucleotide sequence obtained showed the analysis of duck hepatitis virus A (duck hepatitis A), genotype III (DHAV-3)

- Decoded the DNA sequence obtained by whole virulent duck hepatitis virus consists of 7777 nucleotides Follow the duck hepatitis virus was published,

we have arranged to determine the order of genes in the genome of the virulent duck hepatitis virus

- Results of research on molecular biology shows: Position classification of virulent strains: Group IV: positive-strand RNA viruses ss; Order: Nidovirales; Family: Picornaviridae; Genus: Avihepatovirus; (Genotype: DHAV-3)

- Successful application of the virulent DHV in quality control of the Duck Hepatitis vaccines, Inactivated Through this result proved the virulent DHV after enhancing still retains biological characteristics, antigenic properties, virulence of strain

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TWI được thành lập năm 1984 theo quyết định số 58 NN-TCCB/QĐ ngày 28 tháng 3 năm 1984 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp nay là Bộ Nông nghiệp và PTNT Ngoài nhiệm vụ kiểm nghiệm thuốc và nguyên liệu làm thuốc, các chế phẩm sinh học thú y, Trung tâm là nơi lưu giữ giống vi sinh vật thú y để phục vụ cho kiểm nghiệm, chẩn đoán cũng như chế tạo vắc xin và các chế phẩm sinh học cho ngành thú y trong cả nước và được nhập từ nước ngoài

Hiện nay, Trung tâm lưu trữ và bảo tồn 48 chủng giống vi sinh vật thú y Phần lớn các giống vi sinh vật thú y này có xuất xứ từ Trung Quốc, một số khác

do cán bộ thú y mang từ nước ngoài về theo con đường không chính thức (hoặc chính thức) và một số do Viện Thú y, Trung tâm Chẩn đoán thú y quốc gia cung cấp

Do sự eo hẹp về kinh phí, hàng năm Trung tâm chỉ có thể bảo tồn giống vi sinh vật bằng các phương pháp truyền thống rồi đông khô, lưu giữ Gần như tất

cả các giống vi sinh vật hiện có chưa được giám định đầy đủ về kháng nguyên tính, độc lực, tính ổn định và cấu trúc gen một cách có hệ thống Những năm gần đây, do sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học phân tử Các chủng

vi sinh vật được lưu giữ tại Trung tâm đã và đang được tiêu chuẩn hoá, dần dần tiệm cận với chuẩn hoá của quốc tế

Trước đây, nhưng nghiên cứu virus viêm gan vịt chỉ dừng ở mức độ lâm sàng, bệnh tích, chẩn đoán virus học và sản xuất vắc xin truyền thống để phòng chống (OIE, 2008) Tuy nhiên, trong vòng 5 năm nay, virus viêm gan vịt được nghiên cứu sâu sắc ở mức độ sinh học phân tử gen và hệ gen, đặc biệt về ứng dụng sinh học phân tử trong giám định, nghiên cứu hệ gen, phân loại và tìm hiểu quan hệ sinh học trong họ Picornaviridae Theo quan điểm phân loại hiện nay, virus viêm gan vịt trên thế giới gồm ba genotype khác nhau: Genotype I (DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3)

Tại Việt Nam, chủng virus viêm gan vịt đang lưu giữ từ trước tới nay mới chỉ xác định được virus gây bệnh viêm gan vịt thuộc genotype I (DHAV-1) Việc xác định chủng virus thuộc genotype I như đã công bố hay đã biến đổi hoặc có những khác biệt so với các chủng trên thế giới?

Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus Viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin" Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc Giải

mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống Ứng dụng chủng cường độc trong kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt

Nội dung nghiên cứu:

1 Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc (gồm các bước cấy truyền, khả năng gây nhiễm trên tế bào, độc lực, tính ổn định, tính kháng nguyên của giống); Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống Giải mã toàn bộ hệ gen của chủng virus cường độc đang lưu giữ

2 Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt bằng phương pháp công cường độc bằng chủng cường độc viêm gan vịt

Những đóng góp mới của luận văn:

Là nghiên cứu về sinh học phân tử và giải mã hệ gen virus đầy đủ và chi tiết nhất của chủng virus cường độc viêm gan vịt thuộc nguồn gen quốc gia

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM GAN VỊT

2.1.1 Lịch sử và phân bố bệnh

Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DVH) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con 1- 6 tuần tuổi, mẫn cảm nhất là vịt con dưới 3 tuần tuổi Bệnh lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao, có khi lên đến 95 – 100% toàn đàn Cách đây hơn chục năm, virus viêm gan vịt được xếp vào chi Enterovirus trong họ Picornaviridae và việc xếp loại được dựa mối quan hệ về huyết thanh học, bao gồm 3 serotype khác nhau là DHV-1, DHV-2 và DHV-3 Trong đó, phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt serotype 1 (DHV-1) (Fabricant,

Levine, 1957 ; Levine et al., 1950; Asplin, 1965; 1970 ; Toth, 1969; Haider,

Calnek, 1979) Virus viêm gan vịt serotype 2 và serotype 3 mới được tìm thấy ở Anh và Mỹ, gây tỷ lệ chết không đáng kể (Woolcock, 2003) Virus viêm gan vịt serotype 1 còn được gọi chung là virus viêm gan vịt

Ngày nay, nhờ công nghệ sinh học phân tử, đã xác định virus gây bệnh viêm gan vịt trên thế giới gồm có 3 genotype khác nhau, bao gồm genotype I (DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3) Phổ biến nhất là virus viêm gan vịt genotype I bao gồm khoảng 60 chủng đã được phân lập từ năm 1950 đến nay, virus viêm gan vịt genotype II chỉ gồm có 2 chủng mới phân lập ở Đài Loan và virus viêm gan vịt genotype III gồm 15 chủng vừa phân lập ở Trung Quốc và Hàn Quốc

Bệnh có biểu hiện đặc trưng: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao và chết

ở trạng thái đặc biệt đầu ngoẹo về một bên, 2 chân duỗi thẳng Mổ khám thấy gan sưng to, xuất huyết lốm đốm trên gan, có điểm hoại tử

Bệnh viêm gan do virus ở vịt (Duck Hepatitis Virus) được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1945 tại Mỹ trên đàn vịt con một tuần tuổi (Levine, Hofstad, 1945), nhưng chưa phân lập được mầm bệnh Mùa xuân năm 1949, Levine và Fabricant theo dõi một bệnh tương tự trên đàn vịt Bắc Kinh trắng tại Long Island (Mỹ) và có tới 70 trại vịt lớn mắc bệnh gây thiệt hại nặng nề Ban đầu ở những trại mắc bệnh nặng tỷ lệ chết lên tới 95%, thời điểm cuối ổ dịch ở một số trại còn sót lại khi vịt mắc bệnh tỷ lệ chết giảm dần chỉ còn 15% Tổng số vịt chết trong ổ dịch lên tới 75.000 con (Levine và Fabricant, 1950)

Năm 1953, bệnh xảy ra trên các ñàn vịt xảy ra ở các vùng khác của nước

Mỹ Sau đó bệnh cũng được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới: Anh, Canada, Niderland, Ai Cập và Tây Ban Nha, ở Bỉ Ở Liên Xô cũ bệnh được xác định trên lãnh thổ Ucraina và nước cộng hoà Nga Ở Mỹ, Canada, Anh bệnh viêm gan vịt con thuộc bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải đăng ký như bệnh Newcastle (Nguyễn Xuân Bình, 1995)

Năm 1956, bệnh tiếp tục được phát hiện ở bang Massachuset, Illinois và Michigan; sau đó bệnh xảy ra trên khắp cả nước Mỹ

Năm 1965, ở Norfolk (Anh) hiện tượng bệnh viêm gan vịt vẫn xảy ra trên những đàn vịt con đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc viêm gan vịt serotype 1 Năm 1969, ở đảo Long (Mỹ), bệnh viêm gan vịt đã xảy ra trên đàn vịt con

đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc typ I (Toth, 1969) Bệnh xảy ra nhẹ hơn so với bệnh viêm gan vịt của virus typ I, tỉ lệ chết của vịt con hiếm khi vượt quá 30% Haider và Calnek đã đặt tên virus này là virus viêm gan vịt typ III và cho đến nay virus viêm gan vịt typ III mới chỉ được công bố ở Mỹ (Haider và Calnek, 1979)

Ở Trung Quốc, virus viêm gan vịt lần đầu tiên được phân lập và xác nhận năm 1982 (Guo, Pan, 1984) Theo các báo cáo gần đây nhất, bệnh viêm gan vịt xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, trong đó có cả Trung Quốc và Triều Tiên (OIE, 2003)

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới

Có nhiều phương pháp được áp dụng trong nghiên cứu xác định virus viêm gan vịt (Toth, 1969; Rispens, 1969), đặc biệt là sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu (hemagglutination test, HA), phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch và phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay – ELISA) Gần đây, khoa học ngày càng phát triển với nhiều phương pháp mới hiện đại hơn, chính xác hơn trong nghiên cứu sâu về sinh học phân tử virus Viêm gan vịt Phổ biến hơn cả là phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) và PCR cho phép xác định chính xác virus gây bệnh cũng như nghiên cứu sâu về sinh học phân tử của virus

Đến nay, bệnh Viêm gan vịt do virus serotype 1 (còn được gọi là virus Viêm gan vịt) đã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam

2.1.2.1 Đường xâm nhập và cách lây lan

Virus Viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao (100%) Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá, hô hấp hoặc qua vết thương (Levine, Fabricant, 1950) Đường lây nhiễm qua không khí của bệnh Viêm gan vịt giống với bệnh dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà con; có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau đó ít ngày

Bệnh Viêm gan vịt không lây truyền qua đường trứng, vịt con nở ra từ trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt (Asplin, 1958) Ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất ra ngoài theo phân trong 8 tuần Các loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức

cơ học, đây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa (Asplin, 1961) Chuột cống nâu có thể là vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt type I Ở loại động vật này virus được thu nhận vào cơ thể, tồn tại 35 ngày, sau ñó ñược bài tiết ra bênh ngoài trong khoảng thời gian 18 – 22 ngày sau khi nhiễm Trong huyết thanh của chuột có kháng thể và kháng thể tồn tại 12 – 24 ngày

Priz, 1973 đã gây bệnh cho vịt con bằng đường gây nhiễm qua không khí Trong các trường hợp này, virus xâm nhập vào cơ thể qua thanh quản và đường

hô hấp trên (Priz, 1973) Có thể gây bệnh cho vịt bằng cách cho uống (Asplin, 1958) Virus viêm gan vịt type II xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá và

đường lỗ huyệt Ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất theo phân ít nhất 1 tuần sau khi nhiễm bệnh

2.1.2.3 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau 1-2 giờ mắc bệnh, gây chứng xanh tím niêm mạc, rối loạn vận động, co giật, vịt chỉ ngồi, sau đó nằm la liệt, nghiêng sườn và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, đầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngoẹo sang bên sườn, vịt con chết ở tư thế này

Vịt chết do nhiễm virus viêm gan vịt có bệnh tích chủ yếu tập trung ở gan (Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ Trong một số trường hợp gan bị nhũn có hình thái như gelatin Bề mặt gan loang lổ do có nhiều điểm xuất huyết, xuất huyết lan rộng không có ranh giới, kích thước và hình dạng to nhỏ khác nhau Xuất huyết trên bề mặt gan không phải có ở tất cả vịt chết do bệnh viêm gan virus (Nguyễn Đức Lưu, Vũ Như Quán, 2002; Nguyễn Văn Cảm và cs., 2001)

Thời kỳ nung bệnh từ 1-5 ngày, đôi khi kéo dài 8 ngày thậm chí 13 ngày Thời gian nung bệnh phụ thuộc vào độc lực của virus, liều lượng tiêm và phương

pháp gây bệnh cũng như tình trạng cơ thể

2.1.2.4 Bệnh tích

* Bệnh tích đại thể

Bệnh tích chủ yếu tập trung ở gan Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ Trong một số trường hợp gan bị nhũn có hình thái như gelatin Bề

mặt loang lổ do có nhiều xuất huyết, kích thước và hình dạng khác nhau Xuất huyết lan rộng không có ranh giới Sự xuất huyết gan không phải có ở tất cả vịt chết do bệnh viêm gan virus Sự xuất huyết ở gan rõ rệt nhất khi nhỏ bệnh phẩm vào niêm mạc mũi Khi tiêm vào phúc mạc, các cơ quan khác ít bị tổn thương và càng ít hơn khi gây ra bệnh qua ñường miệng Trong gan có thể gặp các ổ hoại tử

do bệnh viêm gan bị biến chứng sang bệnh phó thương hàn Lách có thể sưng, thận tụ máu (Nguyễn Thát, 1975)

* Bệnh tích vi thể

Những biến đổi vi thể trong viêm gan virus ở vịt con chủ yếu thấy ở gan

và đại não Trong gan có những đám tế bào bị hoại tử, viêm tăng sinh ống mật và xung quanh mạch, lúc đầu là những bạch cầu hạt sau đó là tế bào lympho và các tương bào Ở một nửa số vịt con thấy các bệnh tích viêm tăng sinh quanh mạch

và viêm tăng sinh mô thần kinh đệm Sự tổn thương của tế

bào gan ở vịt con mắc bệnh viêm gan virus giống những tổn thương như ở viêm gan của người Bệnh tích trong não vịt chết do viêm gan giống viêm não thể

thanh dịch (Fabricant et al., 1957)

Phôi vịt 10 – 14 ngày tuổi ñược tiêm virus viêm gan vịt type I vào xoang niệu mô, phôi chết trong khoảng 24 – 72 giờ sau khi tiêm và có biểu hiện xuất huyết dưới da, gan xuất huyết có nhiều điểm hoại tử

* Bệnh tích siêu vi thể

Lấy gan làm tiêu bản siêu vi thể kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử Kết quả là sau 1 giờ có hiện tượng vỡ glycogen trong tế bào gan và quan sát thấy những hạt có ñường kính 100 - 300nm, các tế bào hoại tử sau 12 giờ nhiễm Các hạt virus được tìm thấy sau 1 giờ và 18 đến 24 giờ gây bệnh (Adamiker, 1969) Sau khi gây nhiễm virus vào tế bào lách thì tế bào lách bị biến đổi sau 6 giờ, bị hoại tử sau 24 giờ, thoái hóa nhân, tương bào, không tìm thấy tiểu thể virus, có những biến đổi nhẹ trong cơ

Không tìm thấy thể bao hàm trong tế bào gan vịt bệnh, đây là điểm khác đối với bệnh dịch tả vịt Vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt type II bệnh tích vi thể đặc trưng ở gan: các tế bào gan bị hoại tử lan tràn, tế bào ống dẫn mật tăng sinh trên một phạm vi rộng

2.1.3 Tình hình bệnh Viêm gan vịt ở Việt Nam

Tại Việt Nam, năm 1978 đã ghi nhận có bệnh Viêm gan vịt, nhưng chưa phân lập được virus tại thời điểm đó (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1987) Năm 1979 - 1983, bệnh xảy ra ở nhiều địa phương làm chết nhiều vịt con (Lê Thanh Hoà và cs, 1984) Năm 1985, Trần Minh Châu và cộng sự đã phân lập được một chủng virus Viêm gan vịt cường độc ở một trại vịt ở Phú Xuyên - Hà Sơn Bình cũ Qua nuôi cấy trên phôi gà, chủng virus này yếu đi, không gây bệnh cho vịt con mà tạo được đề kháng cho vịt con

Qua điều tra cho biết từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2001 khi điều tra 20 ổ dịch tại các địa phương: Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang kết luận đó chính là bệnh viêm gan vịt do virus với tỷ lệ nhiễm trong đàn lên tới 100%, lứa tuổi mắc bệnh từ 1 - 21 ngày tuổi, tỷ lệ chết từ 48,57 - 90% (Nguyễn Văn Cảm và cs 2001) Theo một số nghiên cứu đã công bố, bệnh Viêm gan vịt cho đến nay vẫn xảy ra ở nước ta, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Văn Cảm và cs 2001) Đặc biệt, gần đây nhiều giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta chưa thích ứng được với điều kiện môi trường nên bệnh viêm gan vịt càng xảy ra nhiều hơn, nhất là ở các địa phương là Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long gây tổn thất rất lớn (Nguyễn Hữu Vũ

và cs., 2001; Nguyễn Đức Lưu và cs., 2002)

Từ cuối năm 2003, đầu năm 2004, khi bệnh cúm gia cầm bùng phát, gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi gia cầm cũng như ảnh hưởng đến sức khỏe con người khiến bệnh viêm gan vịt cũng như một số bệnh khác của gia cầm

ít được quan tâm chú ý nhiều như trước Tuy nhiên, trên thực tế bệnh viêm gan vịt vẫn tồn tại và có nhiều biến đổi phức tạp Trong những năm gần đây, đặc biệt

là từ năm 2006 - 2007 đến nay, trên thế giới đặc biệt đi sâu nghiên cứu về sinh học phân tử virus viêm gan vịt và đã đồng loạt đưa ra nhiều công bố khẳng định

sự biến đổi mạnh mẽ và khác nhau trong quần thể và hệ gen của virus, đến mức tạo ra một chi mới và các genotype mới trong họ Picornaviridae Tuy nhiên, các loại vắc xin phòng bệnh viêm gan vịt cho đến nay đều thuộc một loại genotype (DHAV-1) Do đó, việc sản xuất vắc xin từ chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype mới là rất cần thiết

Trong các năm gần đây, các công trình nghiên cứu về virus viêm gan vịt ở Việt Nam không có nhiều và các nghiên cứu này chỉ đi sâu vào nghiên cứu bệnh

tích đại thể, vi thể của virus gây bệnh, các đặc tính sinh học của virus nhược độc (Trần Thị Lan Hương, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007) và một số nghiên cứu về sinh học phân tử, giải mã hệ gen

2.2 VIRUS VIÊM GAN VỊT

2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt

Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck hepatitis virus - DHV) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con Bệnh lây lan nhanh và gây tỷ lệ chết rất cao, virus gây bệnh viêm gan vịt là một loại ARN virus thuộc họ Picornaviridae,

có 3 type virus gây bệnh khác nhau, bao gồm type I (DHV-1), type II (DHV-2)

và type III (DHV-3), phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt type I (Fabricant and Levine, 2002) Đây là một Picornavirus nên có hình thái giống với hình thái chung Là loại virus có kích thước nhỏ, khoảng 20 - 30nm, không có vỏ bọc ngoài, có 32 capxome, hệ gen chứa axit ribonucleic (ARN), sợi đơn dương, có độ dài khoảng 7.690 nucleotide, ở đầu cuối 3’có thêm đuôi poly (A) dài khoảng 18 nucleotide Hiện nay, họ Picornaviridae gồm có 23 loại virus và được nhóm vào

9 chi, đó là Enterovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Kobuvirus và Teschovirus (Stanway và cs, 2005) Ngoài ra, đã có giả thuyết nên nhóm 3 loại virus là Porcine Enterovirus 8 (PEV-8), Simianvirus2 (SV-2) và Duck Picornavirus (DPV) để xếp chung vào một chi

mới và dự kiến đặt tên nhóm là “Sapelovirus” (Krumbholz et al., 2002)

2.2.2 Cấu trúc hệ gen Picornavirus

Trong họ Picornaviridae, tất cả virus đều bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’ mà thay vào đó là là một protein nhỏ (khoảng 23 amino acid) gọi là VPg (virion protein genome-link) VPg này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ thông qua một gốc tyrosine Ở cả hai đầu của hệ gen picornavirus đều có vùng không dịch mã (UTR) Vùng 5’UTR dài hơn, có độ dài khoảng 600 – 1200 bp, trong khi vùng 3’UTR có độ dài chỉ từ 50 – 100 bp Vùng 5’UTR có vai trò quan trọng đối với quá trình sao mã và vùng 3’UTR có vai trò trong quá trình tổng hợp sợi âm Tuy nhiên đầu 5’ cũng có thể có vai trò trong việc làm tăng cường độc lực của virus (http://en.wikipedia.org/wiki/Picornavirus.com) Trong hệ gen của picorna-virus

có một vùng nucleotide làm điểm khởi đầu để ribosome dịch mã, gọi là IRES – Internal Ribosome Entry Site, đó là một cấu trúc di truyền hoạt động phức tạp dạng cis với cấu trúc bổ sung thứ cấp khởi động cho quá trình dịch mã không phụ

thuộc điểm mũ của hệ gen virus Nằm giữa hai vùng 5’, 3’ là một khung đọc mở lớn, mã hoá cho một chuỗi polypeptide chung, có chiều dài khoảng 2100 – 2400 amino acid chứa các protein cấu trúc và protein không cấu trúc Giống như mRNA ở tế bào nhân chuẩn, đầu cuối 3’ của virus có gắn thêm đuôi poly A, dài khoảng 18 nucleotide

Hình 2.1 Hình ảnh Poliovirus, RNA virus thuộc họ Picornaviridae

Nguồn: http://pathmicro.med.sc.edu Trong chuỗi polypeptide, phần protein đầu tiên là protein dẫn, ký hiệu là L (Leader protein), tiếp theo là 4 loại protein cấu trúc bao gồm VP4 (1A), VP2 (1B), VP3 (1C) và VP1 (1D) Đoạn cuối cùng gồm 7 protein không cấu trúc là protein 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D Tuy nhiên, ở giữa các chi khác nhau thì trật tự này sẽ có sự thay đổi nhỏ Chuỗi polypeptid chung của picornavirus thường bị phân giải bởi một, hai hoặc ba trong số ba enzyme protease là 3Cpro, 2Apro và Lpro thành 10, 11 hoặc 12 chuỗi polypeptide (thành 10 chuỗi polypeptide đối với Kobuvirus và Parechovirus, hoặc thành 12 chuỗi polypeptide

đối với Aphthovirus, Cardiovirus, Erbovirus, Tescho virus - Krumbholz et al.,

2002) Số lượng chuỗi protein được tạo thành phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố như sự có mặt hay vắng mặt protein L; số lượng protein 2A và sự phân cắt hay không phân cắt VP0 thành VP4 và VP2 Phần lớn ở các virus trong họ Picornaviridae, VP0 là một protein được myristyl hoá, tức là được gắn thêm acid béo bão hòa gồm 14 cacbon tại vị trí Glycine theo quy lụât (GxxxS/T) thông qua mối liên kết amid, từ đó VP0 có thể tự phân tách thành protein VP4 và VP2 Hầu hết những virus trong họ Picornaviridae đều có một protein 2A, riêng

Ljunganvirus có thể có 2 loại protein 2A (Jonhansson et al., 2003)

Hình 2.2: Cấu trúc không gian của picorrnavirus

Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm ngay trên bề mặt vỏ kháng nguyên; còn protein VP4 lặn sâu vào bên trong (Nguồn: Swiss Institute of Bioinformatics, 2008)

2.2.3 Quá trình nhân lên của virus

Virus nhân lên trong tế bào chất Đầu tiên, virus gắn vào thụ thể nằm trên màng sinh chất của tế bào chủ, sau đó theo cơ chế nhập bào và tiến hành quá trình “cởi áo” virus trong endosome hoặc lysosome

Sau khi được giải phóng khỏi capsid, RNA hệ gen của virus được dịch

mã, sản suất các protein của virus; tiếp theo đó, các phức hợp sao chép của virus được tập hợp; RNA virus được nhân lên và hệ gen RNA mới sau tổng hợp sẽ được bao gói tạo thành các thế hệ virus con cháu (Barton, Flanegan, 1995; Molla

et al., 1991)

Trước tiên, RNA ngay lập tức khởi động quá trình dịch mã ở vị trí gần đầu 5’ để tạo thành một polyprotein – tiền thân của các protein chức năng của virus Polyprotein này ban đầu được phân cắt thành 3 protein tiền chất là P1, P2 và P3 Tiếp theo đó, mỗi protein lại tiếp tục tiến hành phân cắt để tạo ra các sản phẩm protein đặc hiệu có chức năng

- P1 được cắt ra tạo thành VP0, VP1 và VP3 Đó là các protein capsid

- P2 được cắt ra tạo thành 2A, P2B – là các kháng nguyên của vật chủ và 2C tham gia vào quá trình tổng hợp RNA

- P3 tiến hành tự cắt thành 3A, 3B (VPg), 3C (một protease dùng để phân cắt hầu hết các protein) và 3D (RNA polymerase làm nhiệm vụ kéo dài chuỗi RNA mới tổng hợp trên khuôn RNA)

Để lắp ráp, trước hết virus phân cắt P1 tạo thành một đơn phân gốc (protome) 5S chưa hoàn thiện chứa VP0, VP1 và VP3 Các protome này sẽ liên kết với genome RNA để tạo thành tiền virion (provirion) Trong quá trình hoàn thiện, phần lớn hoặc tất cả các phân tử VP0 đều bị phân cắt tạo thành VP2 và VP4 Sau lắp ráp, virion trưởng thành thoát ra khỏi tế bào nhờ sự tan bào (cell lysis) Một số picornavirus, ví dụ virus viêm gan A (Hepatitis A Virus, HAV) có thể gây nhiễm nhưng không gây ra sự tan bào

Đồng thời với quá trình dịch mã để tổng hợp các protein, RNA của hệ gen virus cũng được nhân lên để tạo thành vật liệu di truyền cho các hạt virus mới Các virus thuộc nhóm picornavirus đều có chung một cơ chế sao chép, tuy nhiên, chỉ có Poliovirus – một virus gây bệnh bại liệt trên người, là được nghiên cứu kỹ nhất cho đến nay

Hệ gen RNA của picornavirus là các RNA thông tin, chúng có chức năng như là các khuôn mẫu cho quá trình sao chép RNA của virus Các RNA sợi dương – hệ gen của picornavirus nhân lên thông qua các RNA sợi âm trung gian được tổng hợp ngay bên trong các phức hợp sao chép gắn trên màng lipid trong bào tương của các tế bào nhân thật của vật chủ Điều đặc biệt là trong quá trình nhân lên của các picornavirus, có sự bất đối xứng giữa số lượng RNA sợi âm trung gian và RNA sợi dương – hệ gen của virus được tổng hợp trong các phức hợp sao chép của virus Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy, có rất nhiều yếu tố liên quan đến quá trình sao chép RNA, trong đó, đặc biệt đã phát hiện các phân đoạn RNA hoạt hóa có cấu trúc không gian dạng cis, gọi tắt là cis-RNA hoạt hóa (CREs – cis active RNA elements), nằm trong hệ gen của các picornavirus Sự góp mặt của các tiểu phần cis-RNA hoạt hóa tham gia vào sự ổn định của các RNA thông tin cũng như quá trình dịch mã RNA thông tin của virus Các trình tự cis-RNA (CREs) này tương tác mạnh mẽ với các protein sao chép của virus, gián tiếp tác động lên sự sao chép RNA của virus (Steil, Barton, 2009) Có 4 loại CREs, mà một trong số đó có vai trò trong việc chuyển hoá VPg

thành VPgpUpUOH (dạng uridyl hoá của VPg) (Richards et al., 2006) Hai loại

protein này có vai trò vô cùng quan trọng, làm mồi cho quá trình sao chép RNA Trong đó, VPg khởi động cho quá trình tổng hợp RNA sợi âm, và VPgpUpUOH khởi động cho quá trình tổng hợp RNA sợi dương Sự tổng hợp bất đối xứng giữa số lượng RNA sợi âm và RNA sợi dương trong quá trình nhân lên của virus,

là do sự quyết định về số lượng bản sao RNA của các mồi VPg và VPgUpUOH

Mỗi RNA sợi dương của virus đều được sao chép thành một RNA sợi âm bổ sung và sau đó RNA sợi âm được sao chép thành 40 đến 70 phân tử RNA sợi dương thế hệ con cháu Một phân tử VPg có một liên kết đồng hóa trị gắn với

đầu tận 5’ của mỗi phân tử RNA cả sợi dương và sợi âm (Pettersson et al., 1978)

Bên cạnh đó, có hàng trăm phân tử VPgpUpUOH được tích hợp với mỗi phân tử

RNA sợi âm trung gian (Lyons et al., 2001) Do đó, mỗi phức hợp sao chép RNA

của màng tế bào có sự tích lũy nhiều bản sao tiền VPg trước khi bắt đầu quá trình sao chép (Novak, Kirkegaard, 1991)

Cuối cùng, các RNA sợi dương – hệ gen virus được kết hợp với các protein và bao gói thành các hạt virus mới, phá vỡ tế bào (tan bào), thoát ra ngoài tiếp tục xâm nhiễm trên các tế bào thích ứng của vật chủ, khởi động một chu trình mới, giúp cho virus tồn tại và gây ra bệnh lí trên vật chủ của chúng

2.2.4 Đặc tính nuôi cấy

Virus viêm gan vịt là loại kí sinh nội bào tuyệt đối (Nguyễn Đường, 1990) Để gây bệnh, cần sử dụng huyễn dịch các cơ quan của vịt con chết do bệnh viêm gan vịt (gan, phổi, thận…) đã được xử lí bằng kháng sinh Có thể cấy chuyển virus viêm gan vịt trên động vật cảm thụ, trên phôi trứng và trên môi trường tế bào

2.2.4.1 Nuôi cấy trên phôi trứng

Virus viêm gan vịt có thể phát triển được trên cả phôi gà và phôi vịt Để gây bệnh, người ta dùng huyễn dịch các cơ quan của vịt con đã chết do bệnh viêm gan vịt (gan, phổi, thận…) đã được xử lý bằng kháng sinh rồi gây bệnh chủ yếu vào màng nhung niệu Tiêm bệnh phẩm vào màng nhung niệu, vào túi noãn hoàng cũng có hiệu quả như tiêm vào niệu nang (Reuss U, 1959)

- Trên phôi vịt:

Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi,

24 - 72 giờ sau khi gây nhiễm phôi chết với bệnh tích: phôi còi cọc, xuất huyết dưới da đặc biệt ở vùng đầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu đỏ hoặc hơi vàng, có thể có điểm hoại tử Ở những phôi chết muộn nước xoang niệu mô có

mà xanh nhạt, bệnh tích rõ hơn Ở phôi vịt bị nhiễm virus viêm gan thường thấy nước ối có màu xanh và gan bị xanh - đen, những bệnh tích này ít thấy ở phôi gà (Nguyễn Đức Lưu và cs, 2001)

2.2.4.2 Nuôi cấy trên môi trường tổ chức tế bào

Năm 1963, Fitzgerald đã sử dụng tế bào thận của phôi vịt để nuôi cấy virus và ông đã chứng minh rằng virus có thể phát triển và gây huỷ hoại tế bào sau 8 lần cấy truyền Các tác giả cho rằng virus viêm gan vịt phát triển theo mô hình đường cong trên môi trường tế bào thận phôi vịt Với virus cấy truyền lần thứ 25 trên tế bào thận phôi vịt không còn khả năng gây huỷ hoại tế bào trên tế bào thận phôi gà Năm 1968, Maiboroda và Kontrimacachus đã nuôi cấy và quan sát được sự phá hủy tế bào thận ở phôi ngỗng Năm 1972, Maiboroda và cộng sự đã theo dõi sự phát triển của virus viêm gan vịt trên tế bào thận phôi vịt một lớp với kỹ thuật kháng thể huỳnh quang thấy virus gây biến đổi bệnh tích

tế bào, hàm lượng virus cao nhất sau 2 ngày (Maiboroda, 1972) Kurilenco và Strelnikov cũng đưa ra kết quả tương tự ở tế bào thận lợn con (Woolcock and Fabricant, 1997)

2.2.4.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ

Virus viêm gan vịt chỉ có thể phát triển tốt trên vịt con dưới 7 ngày tuổi Sau 2 - 4 ngày nung bệnh, vịt có biểu hiện đặc trưng: con vật mệt mỏi nghiêm trọng, nằm một chỗ, đầu ngoẹo ra đằng sau hay về một bên, co giật toàn thân rồi chết Khi mổ khám quan sát bệnh tích đặc trưng ở gan thấy: gan sưng nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ, trên mặt gan có những điểm xuất huyết, đôi khi có những điểm hoại tử màu trắng xen kẽ

Quan sát những biến đổi vi thể trên gan thấy tổ chức gan bị viêm tụ máu, tăng sinh ống mật, các mạch máu bị sưng, các tế bào gan bị tích mỡ Một số

trường hợp trong nguyên sinh tế bào gan xuất hiện những thể bao hàm Ngoài ra lách có thể hơi sưng

2.2.4.4 Đặc tính kháng nguyên

Theo Asplin (1965), tính kháng nguyên của virus luôn thay đổi Virus viêm gan vịt không làm ngưng kết hồng cầu gà, vịt, thỏ, cừu nên đã cho phép phân biệt với virus Newcastle Huyết thanh của vịt nhiễm virus khỏi bệnh có khả năng trung hòa virus viêm gan vịt

2.2.5 Đáp ứng miễn dịch

Quá trình đáp ứng miễn dịch là kết quả của sự hợp tác giữa đại thực bào với các loại quần thể lympho bào Khi một tác nhân xâm nhập vào cơ thể, tự cơ thể sẽ bảo vệ mình bằng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu như: Da, niêm mạc, dịch tiết của các tuyến, đặc biệt là vai trò của tế bào làm nhiệm vụ thực bào Sau

đó cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với sự hoạt động của các cơ quan tế bào có thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể đặc hiệu để loại trừ kháng nguyên

2.2.5.1 Miễn dịch thụ động

Ngay từ lúc mới sinh, cơ thể chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu Trạng thái miễn dịch chỉ có được sau khi cơ thể vịt mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể đặc hiệu cho con non qua lòng đỏ trứng

Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch thụ động của vịt con được nhận từ mẹ

đã được nghiên cứu rất nhiều Việc tiêm nhắc lại vắc xin cho vịt mẹ sẽ tạo được kháng thể thụ động tốt cho vịt con Theo khuyến cáo của OIE (2014), nên tiêm vắc xin nhược độc viêm gan vịt type I cho vịt mẹ trước khi đẻ 12, 8 và 4 tuần để

tạo miễn dịch thụ động cho vịt con trong suốt chu kỳ đẻ trứng

2.2.5.2 Miễn dịch chủ động

Là loại miễn dịch thu được khi con vật bị mắc bệnh nhưng có đủ sức chống lại bệnh và khỏi bệnh hoặc là miễn dịch mà vịt có được sau khi tiêm vắc xin Những vịt sống sót sau khi mắc bệnh đều có miễn dịch chắc chắn với virus của type gây bệnh

Tạo miễn dịch chủ động cho đàn vịt bằng cách sử dụng các loại vắc xin nhược độc và vắc xin vô hoạt Vắc xin sau khi vào cơ thể sẽ đi đến các cơ quan

miễn dịch như hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc hiệu

Theo Gough et al 1981, việc sử dụng vắc xin viêm gan vịt nhược độc

tiêm cho vịt lúc 2 - 3 ngày tuổi và tiêm nhắc lại bằng vắc xin vô hoạt vào thời điểm 22 tuần tuổi sẽ tạo được lượng lớn kháng thể trung hoà Trong huyết thanh của vịt khỏi bệnh có kháng thể trung hoà

Việc kiểm tra đáp ứng miễn dịch được thực hiện bằng nhiều phương pháp:

- Phản ứng trung hoà kiểm tra hàm lượng kháng thể sau khi tiêm vắc xin

- Phản ứng huyết thanh học (sử dụng ELISA) để xác định hiệu giá kháng thể

- Thử thách cường độc (Theo TCVN 8685-2:2011), xác định khả năng bảo

hộ của vắc xin viêm gan vịt đối với vịt được tiêm phòng

2.2.6 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt type I (DHV-1)

Trình tự hệ gen của virus viêm gan vịt type I đã được xác định với sự cấu tạo đặc trưng của một Picornavirus, gồm có những vùng sau:

- Vùng không dịch mã ở đầu 5’ (5’UTR - 5’ Untranslational Region): Là một vùng gen độ dài khoảng 625 nucleotide, không mã hoá nhưng có vai trò quan trọng trong quá trình sao mã, tăng cường độc lực và tạo khung vỏ capsid DHV-1 cũng bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’ mà thay vào đó là một protein nhỏ gọi là VPg (viral protein genome-linked) Ở đầu 5’ của hệ gen DHV-1 có bộ mã khởi đầu để bắt đầu cho quá trình dịch mã, bộ mã này được đặt ở vị trí nucleotid thứ 627 của hệ gen Mặt khác, đầu 5’ hệ gen ARN của DHV-1 chứa vùng gen làm vị trí cho ribosome đi vào gọi là IRES (Internal Ribosome Entry Site) (Racaniello, 2001), được đặt ở trong miền Kozak tối ưu (GxxAUGG), tại

vị trí nucleotide thứ 626 và được bao bọc trong một cấu trúc bậc hai (Ding và Zhang, 2007) IRES được phân thành 4 loại dựa trên cấu trúc sơ cấp và cấu trúc thứ cấp Có một yếu tố hoạt động duy trì ở dạng cis nằm ngay cạnh yếu tố IRES

là motif Yn-Xm-AUG Trong đó, Yn là một vùng giàu pyrimidine, Xm là một đoạn dài 15-25 nucleotide, theo sau là mã khởi đầu AUG Trình tự motif Yn-Xm-AUG ở DHV-1 là AUG-CA-AUG (Tseng và cs, 2007) Tại vùng 5’UTR hệ gen có cấu trúc bậc hai tạo ra cấu trúc vòm khép kín (stem-loop) Những Picornavirus type I không có cấu trúc hình “lá sồi” ở đầu 5’UTR, do vậy, đầu

5’UTR của DHV-1 có thể sở hữu một IRES loại II và cũng duy trì một bản sao thứ hai của cấu trúc tetranucleotid GNRA (RNRA2) (Tseng và Tsai, 2007a; Tseng và cs, 2007)

- Vùng không dịch mã ở đầu cuối 3’ (3’UTR - 3’ Untranslational Region): Vùng này có độ dài khoảng 315 nucleotide, lớn hơn vùng 3’UTR khác của những Picornavirus có nguồn gốc động vật Mặt khác, đầu cuối 3’UTR ở DHV-1 có thể tạo ra năm cấu trúc ARN bậc hai, còn đầu cuối 3’UTR của DPV (Duck Picornavirus) chỉ có thể tạo thành 4 cấu trúc ARN bậc hai Vùng 3’UTR có vai trò trong quá trình nhân lên của những Picornavirus (Rohll và cs, 1995)

- Protein L (Leader Protein): Trong họ Picornaviridae, protein L xuất hiện trong 5 chi virus là Teschovirus, Aphthovirus, Erbovirus, Cadiovirus và Kobuvirus Trong DPV, protein L có chiều dài khoảng 451 axit amin, lớn nhất trong họ Picornaviridae Một số có kích thước khoảng 67 axit amin (ở Encephalomyocarditis virus) đến 219 axit amin (ở Equine Rhinitis B virus) và

sở hữu một motif GxCG có chức năng như enzym protease – trypsin (Tseng và Tsai, 2007b)

- Protein 2A: Protein này có 3 phân đoạn protein là protein 2A1, 2A2 và protein 2A3 Đây là một trong những đặc điểm đặc trưng của DHV-1 (Tseng và Tsai, 2007a)

- Protein cấu trúc của DHV-1: Có 3 vùng protein cấu trúc gồm protein VP0, VP3 và protein VP1 Trong đó, vùng VP1 có tính ổn định cao và có tính sinh miễn dịch, nằm trên bề mặt ngoài cùng của tất cả các Picornavirus, chứa đựng hầu hết những motif mà có chức năng tương tác với thụ thể của tế bào và kháng thể trung hòa đơn dòng Trình tự protein VP1 này là khác nhau trong giữa các chi virus (Tseng và Tsai, 2007b)

Ở virus viêm gan vịt, motif GxCG được định vị tại axit amin thứ 142-145 (GSCG) của protein 3C, còn bộ ba xúc tác thì được đặt tại vị trí H38-D69-C144 trong enzym 3Cpro Một số motif được bảo tồn đặt trong protein 3Cpol là KDELR, PSG, YGDD và FLKR (Krumbholz và cs, 2002) Motif YGDD được đặt ở vị trí axit amin thứ 281-320 trong protein 3Cpro, còn motif KDELR ở vị trí axit amin 150 - 154 và motif FLKR đặt ở vị trí axit amin thứ 365-368 Trong motif PSG, Prolin được thay thế bởi Cystein tại axit amin thứ 280-282

DHV -1

3D 3C 3B 3A 2C 2B 2A3 2A2 2A1 VP1 VP3 VP0

Hình 2.3 Mô tả hệ gen và phân bố các tổ hợp gen mã hoá protein cấu trúc

và không cấu trúc trong chuỗi polypeptide của virus viêm gan vịt

- Protein không cấu trúc: Một số protein không cấu trúc như protein 2C, 3C và 3D, chứa đựng những motif đặc trưng khác hẳn với những motif trong các protein đã biết ở Picornavirus khác, gồm có motif GxxGxGK (S/T) - kéo dài từ axit amin thứ 145 đến 152 và motif DDLxQ - từ axit amin thứ 192 đến 196 trong protein 2C, những motif này có chức năng như enzym helicase Motif GxxGxGK(S/T) cũng xuất hiện trong protein 2A2 (GksGsGKS; axit amin thứ 6-13) Trong motif DDLxQ ở protein 2C, Leucin được thay thế bởi Phenyalanin

Trong hệ gen DHV-1, vùng gen được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là vùng gen mã hoá cho protein VP1 hay còn gọi là protein 1D, dài khoảng 714 nucleotide Vùng VP1 gây ảnh hưởng đáng kể đến sự biến đổi về gen; về đặc điểm hình thái và thích hợp cho quá trình phân tích sự phát sinh loài của virus (Liu và cs, 2008; Wang và cs, 2008) Vùng gen mã hoá protein VP1 được chứng minh là vùng gen kháng nguyên, quyết định đến tính kháng nguyên và tính độc lực của virus viêm gan vịt Những đột biến trong vùng gen VP1 dễ dẫn đến thay đổi thành phần axit amin và đặc tính gây bệnh của virus, từ đó có thể hình thành

ra biến chủng mới Với sự trợ giúp của phương pháp sinh học phân tử, vùng gen

mã hoá cho VP1 được chọn làm đích để phân tích, so sánh, chẩn đoán các chủng virus cường độc viêm gan vịt, để giúp tìm ra những vùng hay thay đổi và những

vùng không thay đổi, tìm hiểu những vùng gen tạo ra các axit amin có vai trò miễn dịch và độc lực, và là đích để khảo sát đặc tính sinh học phân tử của một giống vắc xin hay cường độc gây bệnh Vùng gen VP1 có thể được coi là chỉ thị phân tử có giá trị trong việc đánh giá chủng giống (Kim và cs, 2007; Liu và cs, 2008) Trên cơ sở các dữ liệu cùng với các phương pháp hiện đại, có thể thay đổi vùng gen không mong muốn của virus, để tạo ra loại vắc xin thế hệ mới tốt nhất, tạo điều kiện cho công tác phòng bệnh đạt được kết quả cao

Hiện nay, đã có tài liệu công bố về sinh học phân tử gen và hệ gen của virus gây bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam Những nghiên cứu mới nhất của Viện Công nghệ sinh học là cơ sở thu nhận những dữ liệu gen/hệ gen của virus viêm gan vịt tại nước ta, trước hết là gen kháng nguyên VP1

- Đánh giá đặc tính của một giống virus, trước hết phải xem xét tính thích ứng trên môi trường nuôi cấy, cụ thể trên động vật cảm thụ, trên phôi gia cầm và trên môi trường tế bào tổ chức Không phải giống virus nào cũng thích ứng trên tất cả 3 loại môi trường đó, do vậy, tuỳ mỗi một loại giống mà bố trí môi trường thích hợp để nuôi cấy và khảo sát đặc tính sinh học Đặc tính sinh học trên môi trường nuôi cấy biểu hiện ở khả năng gây bệnh, mức độ gây nhiễm, triệu chứng lầm sàng, bệnh tích đặc trưng, hàm lượng virus, khả năng gây bệnh (độc lực), tính ổn định kháng nguyên, độc lực, miễn dịch Tất cả các biểu hiện này (phenotype) đều do hệ gen quyết định hay nói cách khác, đó chính là biểu hiện genotype của giống

Việc xác định đặc tính giống thông qua khảo sát phenotype và genotype (hệ gen) giúp chúng ta hiểu biết sâu sắc về giống vi sinh vật Trước đây, khi phương pháp sinh học phân tử chưa phát triển, xác định đặc tính giống hầu hết dựa vào biểu hiện của mối tương quan giữa virus và đối tượng cảm nhiễm Ngày nay, khi công nghệ gen đã được ứng dụng rộng rãi, phương tiện và dụng cụ thực hiện dễ dàng, thì việc khảo sát hệ gen bên trong cho phép chúng ta xác định được đặc tính phân tử của giống ngay cả khi chưa cần thực nghiệm

Trong thời gian qua, việc thu thập các chủng viêm gan vịt để nghiên cứu

và xây dựng ngân hàng gen đã được nhiều đơn vị nghiên cứu trong nước quan tâm Các chủng của Việt Nam và thế giới được so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ, đây là nên tảng cho việc thiết lập tạo nguồn gen chuẩn quốc gia (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các chủng viêm gan vịt của Việt Nam và thế giới cung cấp chỉ thị gen để phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ

ST

T Tên chủng

Số đăng ký Ngân hàng gen

Tên nước

Giải mã toàn bộ

hệ gen

Gen sử dụng trong phân tích VP1 2B 3

D

OR

F Các chủng virus viêm gan vịt thuộc DHAV-1

Các chủng virus viêm gan vịt thuộc DHAV-2

Các chủng virus viêm gan vịt thuộc DHAV-3

2.2.7 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt

Virus có sức đề kháng cao với các yếu tố vật lý, hóa học Virus có thể tồn tại trong thức ăn, chất độn chuồng, nước uống 15-40 ngày Ở 370C, chúng vẫn sống sót sau 21 ngày, ở 600C tồn tại được 30 phút Virus thích nghi với nhiệt độ thấp: Ở 40C virus tồn tại được 2 năm, ở âm 140C virus có thể sống được 4 năm,

âm 200C có thể tồn tại được 9 năm

Các chất sát trùng dễ dàng tiêu diệt virus nhanh chóng: NaOH 5% giết chết virus trong vòng 6 giờ, focmol 1% diệt virus ít nhất trong vòng 3 giờ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Virus viêm gan vịt tương đối ổn định ở nhiệt độ dưới 40 - 450C nhưng bị

vô hoạt một cách nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn Các dung dịch muối NaCl, Na2SO4, MgCl2, MgSO4 có thể bảo quản virus chống lại sự tác động của nhiệt độ

ở 500C Virus cũng có thể sống ở pH từ 3 - 9 trong vòng 48 giờ

2.2.8 Chẩn đoán

Chẩn đoán bệnh viêm gan do virus ở vịt con có một số khó khăn vì bệnh xuất hiện đột ngột và chấm dứt nhanh nên bệnh thường bị giải thích sai lầm là do thức ăn và do chuồng trại vệ sinh kém Trong bệnh viêm gan vịt thường quan sát

có vi trùng gây bệnh phó thương hàn và trực khuẩn E.coli và người ta cho nó là nguyên nhân gây chết khi chẩn đoán bệnh viêm gan vịt do virus cần chú ý đến những điểm sau:

+ Bệnh xuất hiện đột ngột và diễn ra cấp tính

+ Chỉ gây tổn thương cho vịt con trước 2 tháng tuổi

+ Gan có nhiều điểm xuất huyết

2.2.8.1 Chẩn đoán phân biệt

Để chẩn đoán phân biệt với các bệnh khác cần dựa vào các đặc điểm: dịch

tễ, triệu chứng, bệnh tích và kiểm tra virus

Bệnh phó thương hàn vịt (Patatyphus aratum): có thể chữa khỏi bằng kháng huyết thanh hoặc kháng sinh Trái lại bệnh viêm gan vịt do virus thì không có kết quả

Bệnh dịch tả vịt: hiện tượng xuất huyết không chỉ thấy ở gan mà còn ở các

tổ chức khác: da, bao tim màng ngực, niêm mạc dạ dày, ruột… bệnh còn xảy ra ở mọi lứa tuổi

Bệnh ngộ độc Aflatoxin: có triệu chứng gần giống với bệnh viêm gan vịt nhưng kiểm tra tổ chức học thấy tế bào gan bị phá huỷ rất nghiêm trọng

2.2.8.2 Chẩn đoán virus học

Đây là phương pháp hữu hiệu nhất, lấy bệnh phẩm là gan, lách, não nghiền thành huyễn dịch 10 - 20% rồi tiêm cho phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi, phôi gà 8 - 10 ngày tuổi hoặc có thể dùng huyễn dịch tiêm cho vịt 1 - 7 ngày tuổi, mỗi bệnh phẩm tiêm từ 6 - 10 vịt, mỗi con 0,2 ml, tiêm dưới da hoặc nhỏ mũi

Sau thời gian nung bệnh ngắn vịt sẽ phát bệnh với triệu chứng, bệnh tích giống như bệnh trong tự nhiên Mổ khám vịt sẽ thấy có điểm xuất huyết đặc trưng ở gan

2.2.8.3 Chẩn đoán huyết thanh học

Trong chẩn đoán huyết thanh học có nhiều phương pháp: phương pháp làm phản ứng trung hoà, phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch Nhưng trong chẩn đoán bệnh viêm gan vịt người ta thường sử dụng phản ứng trung hoà Nguyên tắc của phản ứng trung hoà dựa trên nguyên tắc chung của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, phản ứng trung hoà có thể thực hiện trên phôi gà hoặc phôi vịt hay trên vịt con

Lấy huyết thanh nghi bệnh từ máu của vịt con đã bị bệnh điển hình hoặc

ở những vịt con sống sót sau khi đàn vịt khỏi bệnh 2 tuần Phản ứng thực hiện trên phôi vịt hoặc phôi gà với chủng virus đã được làm thích nghi trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, nếu phản ứng làm trên phôi vịt, thì việc xác định liều ELD50 thường dễ dàng hơn so với phôi gà, nhưng phôi gà có ưu điểm là đảm bảo chắc chắn không có mặt của virus cũng như kháng thể của bệnh tự nhiên

2.2.9 Vắc xin và chế phẩm sinh học phòng bệnh

2.2.9.1 Vắc xin phòng bệnh

Nguyên lý của việc tiêm phòng bằng vacxin là gây ra trong cơ thể sống một đáp ứng chủ động của hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố có khả năng gây bệnh và nhờ đó làm mất khả năng này Biện pháp tiêm phòng bằng vắc xin đã mang lại cho y học, thú y học những thành tựu lớn trong phòng bệnh do virus và

vi khuẩn gây ra

Gần đây, do sự hiểu biết về lý thuyết miễn dịch, sự không ngừng cải tiến trong kỹ thuật chẩn đoán, sự phát triển liên tục của những sản phẩm mới và phương thức sử dụng vacxin mới đã làm cho việc phòng bệnh bằng vắc xin được giải quyết một cách hoàn thiện

Vắc xin phòng bệnh viêm gan vịt có 2 loại: vắc xin nhược độc và vắc xin

vô hoạt

- Vắc xin nhược độc: Virus cường độc dưới tác động của các yếu tố sinh

học: tiêm truyền nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi, thì độc lực của virus giảm đi Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên được dùng để làm vắc xin Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủng virus viêm gan vịt cường độc sau khi đã cấy truyền qua phôi gà không còn khả năng gây bệnh cho vịt con nhưng virus vẫn nhân lên trong tế bào các mô, so với chủng virus viêm gan vịt cường độc thì mức độ nhân lên của virus này là thấp hơn (Hwang, 1965)

Bằng phương pháp giảm độc trên phôi đã tạo ra nhiều chủng virus viêm gan vịt nhược độc Hiện nay, vắc xin viêm gan vịt nhược độc dùng chủ yếu ở Châu

Âu là loại đã được giảm độc sau 53 - 55 lần tiếp truyền qua phôi gà 8 -10 ngày tuổi; ở Mỹ là loại giảm độc sau 84 - 89 lần cấy truyền Vắc xin được bảo quản ở nhiệt độ âm 700C trong vài năm

- Vắc xin vô hoạt: Ngoài vắc xin nhược độc còn có vắc xin vô hoạt Vắc xin

viêm gan vịt vô hoạt được sản xuất từ virus viêm gan vịt bằng cách nuôi cấy virus trên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng BEI (Binary Ethylenimine), dùng bổ trợ dạng nhũ dầu (ES - STA (Lipid Emulsion System - Salmonella typhimurium) và có lympho B phân bào (Woolcok, 1991) Bảo quản

ở 40C trong thời gian 20 tháng vẫn giữ được hiệu lực của vắc xin

Nghiên cứu hiệu lực của vắc xin viêm gan vịt vô hoạt, các tác giả đều cho biết vắc xin có khả năng tạo miễn dịch cao cho đàn vịt (Gough, 1981) Sử dụng 3 lần vắc xin vô hoạt nhũ dầu cho đàn vịt giống sẽ tạo được miễn dịch thụ động cho đàn vịt con Hiện nay, trên thế giới mới có vắc xin viêm gan vịt nhược độc

và vô hoạt serotype 1

Trên thị trường Việt Nam đang sử dụng rộng rãi nhiều loại vắc xin nhược độc viêm gan vịt do các công ty Vetvaco, Navetco, Marphavet và RTD sản xuất đang dần dần thay thế vắc xin ngoại trong việc phòng chống bệnh

Qua khảo sát sinh học phân tử hệ gen bước đầu cho thấy, chủng virus được

sử dụng làm vắc xin có nguồn gốc từ Hàn Quốc, Ai Cập, Mỹ, Trung Quốc Ngoài ra, một chủng virus vắc xin nhược độc khác của Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng đã được nghiên cứu đầy đủ về đặc tính sinh học (Nguyễn Phục Hưng, 2004; Nguyễn Bá Hiên, 2007), Quy trình sản xuất (Bùi Thanh Khiết, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007), đặc tính phân tử và đã bước đầu được ứng dụng vào thực tế Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy các loại vắc xin sử dụng tại Việt Nam đều thuộc genotype 1

Khoảng thời gian bảo vệ kéo dài, kháng thể tồn tại được 14 ngày trong máu sau khi tiêm và thời gian kháng virus hiệu quả cao hơn 10 ngày, vì vậy 1 lần tiêm

có thể bảo vệ vịt khỏi bệnh trong 14 ngày, tỷ lệ phòng bệnh hiệu quả là 100% và

tỷ lệ chữa khỏi bệnh hơn 95%

Sản phẩm an toàn, không độc, không tồn dư, không gây ô nhiễm và không ảnh hưởng đến chất lượng thịt