Vật liệu và phương pháp
Môi trường nuôi cấy và chủng vi sinh vật
3.1 LỰA CHỌN THIẾT KẾ TỐI ƯU CHO HỆ THỐNG BES VÀ ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Thiết kế hệ thống BES
Hệ thống BES được nghiên cứu dựa trên tài liệu tham khảo, nhằm lựa chọn thiết kế có hiệu quả cao với chi phí hợp lý Hệ thống này được tối ưu hóa để ưu tiên dòng điện thấp, với giả thuyết rằng cường độ dòng điện có ảnh hưởng đến kích thước hạt.
Thí nghiệm gồm 5 hệ thống BES được tiến hành trong điều kiện anot yếm khí và các điều kiện catot khác nhau:
(1) Hệ thống BES1có catot kị khí
(2) Hệ thống BES2 có catot hiếu khí và khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút
(3) Hệ thống BES3 có catot kị khí, được với nối thêm pin AA 1.5 V thông qua một điện cực than chì phụ
(4) Hệ thống BES4 có catot hiếu khí
(5) Hệ thống BES5 có catot hiếu khí được nối thêm pin AA 1.5 V tương tự hệ thống BES3
(6) Hệ thống BESĐC: Hệ thống BES đối chứng, được đặt giống hệ thống BES1 với khoang anot không bổ sung vi khuẩn
3.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ CHỦNG VI SINH VẬT
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn chủng vi khuẩn Shewanella sp HN-41 để phát triển các hệ thống BES Chủng vi khuẩn này được phân lập từ đá phiến dầu kỉ Phấn trắng tại bãi triều Haenam, Hàn Quốc và có hoạt tính khử sắt cao, cho thấy S HN-41 là họ hàng gần của các vi khuẩn khác trong cùng nhóm.
Shewanella oneidensis MR-1 và Shewanella saccharophilus GC-29 là hai chủng vi khuẩn quan trọng được nghiên cứu bởi Ji-Hoon Lee và cộng sự vào năm 2007 Hiện tại, các chủng vi khuẩn này đang được bảo quản và lưu trữ tại phòng Vi sinh vật Môi trường thuộc Viện Công nghệ Môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.
Trước khi tiến hành bổ sung vi khuẩn vào các hệ thống BES, vi khuẩn
Shewanella sp HN-41 được nuôi cấy ở điều kiện yếm khí, 30 o C, trên môi trường Luria – Bertani (LB) Agar trong vòng 24h để thu sinh khối tế bào
3.2.2 Môi trường trong khoang Anot
Trong khoang điện cực âm, môi trường sử dụng là môi trường khoáng kị khí với sự bổ sung sodium lactate 10 mM (Ji-Hoon Lee et al., 2007b) Các dung dịch khoáng gốc và dung dịch khoáng vi lượng được chuẩn bị với nồng độ như đã trình bày trong bảng 3.1 và bảng 3.2.
Bảng 3.1 Các dung dịch khoáng gốc dùng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong khoang Anot
Thành phần khoáng Nồng độ (g/L)
Bảng 3.2 Thành phần dung dịch khoáng vi lượng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong khoang Anot
Hợp chất Nồng độ (mg/L)
Pha chế môi trường khoáng trong khoang anot theo tỷ lệ quy định, sau đó thêm nước cất đến thể tích cần thiết và điều chỉnh pH về 7,6 bằng dung dịch KOH Tiến hành đun sôi và sục khí nitơ để loại bỏ oxy Sau khi khử trùng, chia đều môi trường khoáng vào các khoang anot với thể tích 100 ml và tiếp tục sục khí nitơ trong 3 phút cho mỗi khoang.
Bảng 3.3: Thành phần môi trường lỏng dùng cho khoang Anot
Dung dịch, hợp chất Hàm lượng/môi trường lỏng
Dung dịch khoáng vi lượng (bảng
3.2.3 Môi trường trong khoang Catot
Dung dịch điện cực dương bao gồm 2 muối là Cadimi clorua (CdCl2) với nồng độ 1 mM và Natri thiosulfate (Na2S2O3) với nồng độ 5 mM, được pha trong 100 ml nước cất Dung dịch này được chia đều vào các khoang catot trong thí nghiệm Đối với hệ thống điện cực dương kị khí, dung dịch catot được sục khí nitơ để loại bỏ oxy trong khoảng 3 phút.
Tiến hành thí nghiệm và phân tích
Thí nghiệm được tiến hành lấy mẫu như sau: Đối với các hệ thống BES1, BES2 và BES3
Tại điện cực âm (Anot): lấy mẫu theo ngày 0, 2, 4, và 6, mỗi lần 2 ml để đo hàm lượng lactate, OD tại bước sóng 600 nm và pH môi trường
Tại điện cực dương (Catot): lấy mẫu theo ngày 0, 2, 4, và 6 để phân tích hàm lượng ion Cd (II) trong dung dịch
Hệ thống BES4 và BES5
Hệ thống BES4 và BES5 được chuẩn bị và theo dõi giống như hệ BES1, với điểm khác biệt là điện cực dương hoạt động trong điều kiện hiếu khí Điều này giúp đảm bảo quá trình diễn ra hiệu quả và ổn định.
Việc thu mẫu H2S chỉ được thực hiện tại điện cực âm vào các thời điểm 0, 7 và 14 ngày để đo OD và pH, trong khi dung dịch điện cực dương của hai hệ BES được lấy mẫu vào các ngày 0, 7, 14 và 21 nhằm xác định nồng độ Cd Vào ngày 21 của thí nghiệm, mẫu kết tủa được thu để tiến hành phân tích hình thái và cấu trúc vật liệu qua các phương pháp như hiển vi điện tử quét (SEM), hiển vi điện tử truyền qua (TEM), phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX), phổ nhiễu xạ tia X (XRD) và phổ hấp thụ tử ngoại (UV-Vis) Kết quả theo dõi hàm lượng lactate tại điện cực âm cho thấy hàm lượng lactate đã giảm đáng kể.
Sau 5 đến 6 ngày thí nghiệm, mẫu đã phân tủy hoàn toàn Do đó, lactate được bổ sung để duy trì hàm lượng 10 mM trong khoang điện cực âm, và quá trình phân tích hàm lượng lactate đã được dừng lại.
Phân tích mẫu
3.4.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào, pH môi trường và nồng độ lactat còn lại trong môi trường nuôi cấy
Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trong khoang điện cực âm được xác định thông qua mật độ quang tế bào (OD) tại bước sóng 600 nm bằng máy quang phổ UV-vis 2450 (Shizuma, Nhật Bản) pH của môi trường nuôi cấy được đo bằng máy HQ40d (Hach, Mỹ) Hàm lượng lactat còn lại trong khoang cực âm được phân tích bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC, Agilent Infinity 1260, Mỹ) với đầu dò SPD-10A UV (Shizuma, Tokyo, Nhật Bản) và cột Shodex RSpack KC-811 (8.0 mm ID × 300 nm) (Shodex, Tokyo, Nhật Bản) Pha động sử dụng là 5 mM H2SO4 với tốc độ 0.5 ml/phút, và phổ UV được phát hiện ở bước sóng 210 nm Trước khi phân tích, mẫu được ly tâm ở 12000 rpm để loại bỏ sinh khối tế bào, sau đó chuẩn bị 0.5 ml mẫu cho vào ống chứa mẫu để tiến hành phân tích.
3.4.2 Phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) xác định nồng độ ion Cd trong mẫu
Nguyên tắc: Mẫu phân tích được chuyển thành trạng thái hơi tự do Chiếu
Khi một chùm tia sáng với bước sóng xác định chiếu vào đám mây nguyên tử tự do, các nguyên tử này sẽ hấp thụ năng lượng từ tia sáng và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử đặc trưng Việc đo phổ hấp thụ này cho phép xác định nguyên tố cần phân tích (Phạm Luận và cs., 1990; Trần Tứ Hiếu và cs., 2003) Để thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố, cần tiến hành các bước nhất định.
Chọn các điều kiện và loại trang bị phù hợp để chuyển đổi mẫu phân tích ban đầu, bao gồm dạng rắn hoặc dung dịch, thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do.
Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích vào đám hơi nguyên tử tự do sẽ khiến các nguyên tử trong đám hơi này hấp thụ những tia bức xạ nhất định, tạo ra phổ hấp thụ đặc trưng Trong một giới hạn nồng độ nhất định, cường độ hấp thụ này tỷ lệ thuận với nồng độ của nguyên tố cần phân tích, theo một phương trình tuyến tính.
Trong đó: A : Cường độ vạch phổ hấp thụ
K: hằng số thực nghiệm l: chiều dài chùm sáng đi qua
C: nồng độ nguyên tố cần phân tích
Sử dụng hệ thống máy quang phổ, người ta thu thập toàn bộ chùm sáng và phân tách để chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần nghiên cứu Cường độ của vạch phổ này được đo và chính là tín hiệu hấp thụ của nguyên tử.
Để chuẩn bị mẫu phân tích, 1 ml mẫu thu được từ khoang điện cực dương tại các thời điểm khác nhau sẽ được ly tâm với tốc độ 12000 rpm Sau đó, dịch nổi được thu để xác định nồng độ ion trong mẫu Nồng độ Cd 2+ trong dung dịch ở điện cực dương được xác định bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng máy AAS (PinAAcle 900T, Perkin Elmer).
3.4.3 Phương pháp nghiên cứu cấu trúc, hình thái học và tính chất của vật liệu
Sau khi kết thúc thí nghiệm vào ngày thứ 21, toàn bộ mẫu trong khoang catot được rửa ba lần với nước cất đề ion bằng cách ly tâm ở tốc độ 12000 rpm trong 10 phút để chuẩn bị cho các phân tích đặc trưng hóa vật liệu Các phân tích bao gồm: phân tích hình thái và cấu trúc hạt bằng kính hiển vi điện tử quét và truyền qua; phân tích thành phần cấu trúc hạt qua phổ tán sắc năng lượng; phân tích dạng tinh thể dựa trên phổ nhiễu xạ tia X; và cuối cùng là phân tích hấp thụ tử ngoại - khả kiến để xác định tính chất vật lý của hạt nghiên cứu.
3.4.3.1 Kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope) được dùng để khảo sát hình thái bề mặt và cấu trúc lớp mỏng dưới bề mặt
Nguyên lý của phương pháp quét điện tử (SEM) là sử dụng một chùm điện tử hẹp để quét trên bề mặt mẫu vật, từ đó phát ra các bức xạ thứ cấp như điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược, điện tử Auger và tia X Việc tạo ảnh mẫu vật dựa trên việc ghi nhận và phân tích các bức xạ này Khi chùm điện tử đi vào trường thế biến thiên đột ngột do đám mây điện tử âm và hạt nhân dương, nó sẽ bị tán xạ mạnh Mỗi nguyên tử trở thành tâm tán xạ của chùm điện tử, và hiện tượng này rất phù hợp cho nghiên cứu cấu trúc màng mỏng Phương pháp SEM có ưu điểm nổi bật là quy trình xử lý đơn giản và không cần phá hủy mẫu.
Chuẩn bị mẫu chụp ảnh SEM bao gồm việc nhỏ mẫu vật và để khô trên các tấm silicon wafer, nhằm phục vụ cho phân tích dưới kính hiển vi điện tử quét Hitachi S4800 của Nhật Bản.
3.4.3.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope) là thiết bị quan trọng trong nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, hoạt động bằng cách chiếu chùm điện tử năng lượng cao xuyên qua mẫu vật mỏng Thiết bị này sử dụng thấu từ để tạo ra hình ảnh với độ phóng đại rất lớn, có thể đạt tới hàng triệu lần, và hình ảnh được hiển thị trên màn huỳnh quang, phim quang học hoặc thiết bị kỹ thuật số.
Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tạo ra ảnh dựa trên các cơ chế quang học, tuy nhiên, tính chất của ảnh phụ thuộc vào từng chế độ ghi ảnh Điểm khác biệt chính giữa ảnh TEM và ảnh trong kính hiển vi quang học là độ tương phản Trong khi độ tương phản của ảnh quang học chủ yếu do hiệu ứng hấp thụ ánh sáng, thì ở TEM, độ tương phản chủ yếu đến từ khả năng tán xạ điện tử Các chế độ tương phản trong TEM đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích và hình dung cấu trúc vật liệu.
Tương phản biên độ là hiệu ứng hấp thụ điện tử của mẫu vật, ảnh hưởng bởi độ dày và thành phần hóa học Kiểu tương phản này bao gồm tương phản độ dày và tương phản nguyên tử khối, đặc biệt trong kỹ thuật STEM.
Tương phản pha là hiện tượng xảy ra khi các điện tử bị tán xạ ở các góc khác nhau, đóng vai trò quan trọng trong các hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (HRTEM) và các Lorentz TEM được sử dụng để chụp ảnh cấu trúc từ.
Để chuẩn bị mẫu chụp ảnh TEM, một giọt dung dịch mẫu cần được nhỏ lên lưới đồng đã được phủ màng cácbon Sau đó, mẫu sẽ được để khô trong không khí trước khi được quan sát dưới kính hiển vi TEM (JEOL JEM-1010, Nhật Bản).
3.4.3.3 Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng kỹ thuật phổ tán sắc năng lượng (EDS) hay phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) để xác định thành phần nguyên tử của các nguyên tố có mặt trong vật liệu nano.
