(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu khả năng kháng ß lactam của các chủng salmonelia phân lập từ thịt gà tại các chợ trên địa bàn thành phố hà nội

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thùy Linh Tên Luận văn: Nghiên cứu khả năng kháng β-lactam của các chủng Salmonella phân lập từ thịt gà tại các chợ trên địa bàn thành phố Hà Nội Phươn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG β-LACTAM CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ THỊT GÀ TẠI CÁC CHỢ TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HÀ NỘI

Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 60 64 01 01

Người hướng dẫn khoa học: TS Dương Văn Nhiệm

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn

Đỗ Thùy Linh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Nhiệm – Bộ môn Thú y Cộng đồng đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập

và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, đặc biệt cám ơn PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo – Viện trưởng, và ThS Nguyễn Thành Trung – Phụ trách Khoa Vi sinh vật cùng các cán bộ Khoa Vi sinh vật

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn

Đỗ Thùy Linh

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Vi khuẩn Salmonella 3

2.1.1 Khái niệm về Salmonella 3

2.1.2 Khả năng gây bệnh của Salmonella 3

2.1.3 Gia cầm – vật chủ chứa Salmonella 6

2.2 Tình hình ô nhiễm Salmonella trên gia cầm 7

2.2.1 Tình hình ô nhiễm Salmonella trên gia cầm trên thế giới 7

2.2.2 Tình hình ô nhiễm Salmonella trên gia cầm tại Việt Nam 8

2.3 Kháng sinh và kháng kháng sinh 9

2.3.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh 9

2.3.2 Kháng sinh β-lactam 9

2.3.3 Cephalosporin và kháng sinh phổ rộng 10

2.3.4 Kháng kháng sinh 11

2.3.5 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 13

2.3.6 Kháng Cephalosporine 15

2.3.7 Enzyme B-lactamase phổ rộng 16

2.3.8 Kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella 19

2.4 Các phương pháp sử dụng để phân lập, đánh giá tính kháng kháng sinh, và xác định gen kháng thuốc (gen mã hóa enzyme β-lactamse) của vi khuẩn Salmonella 21

2.4.1 Các phương pháp phát hiện Salmonella 21

2.4.2 Các phương pháp đánh giá tính kháng kháng sinh – kháng sinh đồ 22

2.4.3 Các phương pháp xác định gen mã hóa enzyme β-lactamse 26

Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 29

3.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 29

3.2 Nội dung nghiên cứu 30

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và lưu trữ mẫu 30

3.3.2 Phương pháp phân lập Salmonella 31

3.3.4 Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh 41

Phần 4 Kết quả và thảo luận 44

4.1 Xác định tỉ lệ lưu hành của Salmonella trong thịt gà tươi tại bốn quận nội thành Hà Nội 44

4.2 Xác định khả năng kháng kháng sinh nhóm β-lactam của vi khuẩn Salmonella 46

4.2.1 Kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ 1 Cefazoline (CZ): 47

4.2.2 Kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ 2 CXM, FOX: 47

4.3 Xác định chủng Salmonella sinh enzyme β-lactamase phổ rộng 50

4.4 Xác định gen mã hóa enzyme βeta-lactamese 52

4.4.1 Xác định gen mã hóa enzyme bla TEM 52

4.4.2 Xác định gen mã hóa enzyme bla PSE 53

4.4.3 Xác định gen mã hóa enzyme bla CMY-2 54

4.4.4 Xác định gen mã hóa enzyme bla OXA 55

Phần 5 Kết luận và đề nghị 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Đề nghị 57

Tài liệu tham khảo 58

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

AOAC Hiệp hội chính thức các nhà phân tích hóa học

BHI Brain heart Infusion

BOA Văn phòng công nhận chất lượng

CAL Ceftazidime + clavulanic axit

ESBL Enzyme β-lactamase phổ rộng

FDA Cục Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ

FSIS Tổ chức Kiểm tra An toàn thực phẩm

ISO Tổ chức Tiêu chuẩn thế giới

LCR Phản ứng chuỗi Ligase

LDC Môi trường L-Lyzin đâ khử nhóm cacboxyl

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

MKTTn Tetrathionat/novobioxin muller-kauffmann

NCCLS Ủy ban Quốc gia Tiêu chuẩn Lâm sàng trong Phòng thí nghiệm NTS Salmonella không thương hàn

OMP Porin màng ngoài

PBP Protein liên kết penicillin

TSA Trypton casein soy agar

TSI Triple sugar iron

USDA Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ

WHO Tổ chức Y tế Thế giới

XLD deoxycholat lyzin xyloza

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Tên kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ 39

Bảng 3.2 Trình tự các cặp mồi 42

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt 43

Bảng 4.1 Số lượng mẫu thu thập được tại các chợ 44

Bảng 4.2 Tỉ lệ ô nhiễm Salmonella trên thịt gia cầm theo khu vực 45

Bảng 4.3 Kết quả kháng cephalosporin thế hệ 1 CZ 47

Bảng 4.4 Kết quả kháng cephalosporin thế hệ 2 CXM 48

Bảng 4.5 Kết quả kháng cephalosporin thế hệ 3 48

Bảng 4.6 Tỉ lệ kháng kháng sinh β-lactam cephalosporin 49

Bảng 4.7 Các chủng Salmonella kháng kháng sinh cephalosporin 50

Bảng 4.8 Các chủng Salmonella mang gen mã hóa enzyme β-lactamase 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella 3

Hình 2.2 Khay kháng sinh 23

Hình 2.3 Phương pháp cột khuếch tán kháng sinh – Etest 23

Hình 2.4 Phương pháp sử dụng khoanh giấy kháng sinh 24

Hình 2.5 Xác định vi khuẩn sinh ESBL 26

Hình 3.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội 29

Hình 3.2 Thịt gà bày bán tại chợ sau khi giết mổ 29

Hình 3.3 Khuẩn lạc khi ria lên thạch XLD 33

Hình 3.4 Kết quả phản ứng trên thạch TSI 33

Hình 3.5 Phản ứng trên Urea broth 34

Hình 3.6 Phản ứng trên LDC broth 34

Hình 3.7 Kháng sinh đồ trên chủng dương đối chiếu Salmonella 572 40

Hình 3.8 Kháng sinh đồ trên chủng đối chiếu E.coli ATCC 52922 40

Hình 4.1 Tỉ lệ nhiễm Salmonella trong gia cầm tại các Quận nội thành 46

Hình 4.2 Chủng Salmonella kháng với cephalosporin thế hệ 1 CZ 47

Hình 4.3 Chủng Salmonella kháng với cephalosporin thế hệ 1, 2 (CZ, CXM) 48

Hình 4.4 Chủng Salmonella đối chứng kháng kháng sinh β-lactam phổ rộng 51

Hình 4.5 Chủng Salmonella sinh enzyme B-lactamse phổ rộng 51

Hình 4.6 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla 53

Hình 4.7 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla PSE 54

Hình 4.8 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla CMY-2 55

Hình 4.9 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla OXA 55

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thùy Linh

Tên Luận văn: Nghiên cứu khả năng kháng β-lactam của các chủng Salmonella phân lập từ thịt gà tại các chợ trên địa bàn thành phố Hà Nội

Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên mục đích nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân lập Salmonella trên thịt gia cầm, phương pháp dùng khoanh giấy kháng sinh để phát hiện nhanh tính kháng kháng sinh của vi sinh vật và kiểm chứng khả năng sinh enzyme β-lactamase của chủng Salmonella đã thu thập, Các gen kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn bước đầu được phát hiện bằng kỹ thuật khuếch đại gen Polymerase chain Reaction (PCR) Các mẫu dương tính sẽ được lưu lại để thực hiện tiếp các nghiên cứu sâu hơn như phát hiện các đột biến điểm, các gen kháng kháng sinh khác

Kết quả chính và kết luận

Tỉ lệ Salmonella lưu hành trên thịt gia cầm tại các chợ tại một số quận nội thành

Hà Nội là 32.0% Các chủng Salmonella phân lập được kháng lại các kháng sinh cephalosporin thế hệ 1, 2, 3 với tỉ lệ lần lượt: Cefazolin (CZ) là 15.63%, Cefuroxime (CXM) là 6.25%, Cefoxitin (FOX) với 0%, Ceftriaxone (CRO) với 3.13%, Cefotaxime (CTX) 3.13% và Ceftazidime (CAZ) với 9.38% Có 1 chủng duy nhất sinh eznyme B-lactamase phổ rộng trong số 32 chủng Salmonella đã thu thập, cũng là chủng kháng các loại kháng sinh cephalosporin thế hệ 1, 2, 3 Có 10 chủng Salmonella sinh enzyme Bla TEM, 4 chủng sinh enzyme CMY-2, 6 chủng sinh enzyme bla PSE, 3 chủng sinh enzyme bla OXA Không có chủng Salmonella nào sinh enzyme bla SHV và enzyme bla DHA trong số 32 chủng đã thu thập

THESIS ABSTRACT Master candidate: Do Thuy Linh

Thesis title: A study on the β-lactam antibiotic resistance of Salmonella spp isolated from chicken in markets of Hanoi

Major: Veterinary Medicine Code: 60 64 01 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Materials and Methods

Based on our research objectives, we chose the traditional method for the isolation of Salmonella in poultry, the method of using disk diffusion antibiotic sensitivity testing to detect quickly antibiotic resistance of bacteria, and test the ability

of the β-lactamase gene exits in isolated Salmonella Antibiotic resistance genes were initially detected by PCR technique Positive samples will be retained for other follow-

up studies such as point mutations detect, other antibiotic resistance genes

Main findings and conclusions

The prevalence of Salmonella isolated from poultry in Hanoi is 32.0% The resistance ratios of isolated Salmonella on the first, second and third generation cephalosporin are: Cefazolin (CZ) 15.63%, Cefuroxime (CXM) 6.25%, Cefoxitin (FOX) 0%, Ceftriaxone (CRO) 3.13%, Cefotaxime (CTX) 3.13% and Ceftazidime (CAZ) 9.38% There is one Salmonella strain that produced the extended spectrum B-lactamase enzyme in 32 strains of isolated Salmonella, which resist the first, second and third generation cephalosporin There are 10 isolated strains contain CMY-2 enzyme, 6 strains contain bla PSE enzyme and 3 strains contain bla OXA enzyme There is no Salmonella strains produced bla SHV enzyme and bla DHA enzyme from

32 isolated strains

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Ngày nay, tình trạng ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là ngộ độc thực phẩm do

vi sinh vật ngày càng trở thành vấn đề báo động tại Việt Nam, trong đó có ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây nên

Salmonella là vi khuẩn gây bệnh phổ biến gây ra các triệu chứng đường ruột trên toàn thế giới Bệnh lây truyền qua thực phẩm gây ra bởi Salmonella không thương hàn đang là mối quan tâm của cộng đồng toàn cầu Hầu hết các

vụ bùng phát dịch Salmonella trên người có liên quan đến việc tiêu thụ sản phẩm từ động vật mang nguồn bệnh (Truong H T et al., 2012) Hai vấn đề chính trong dịch tễ về vi khuẩn Salmonella không thương hàn tại các nước phát triển và đang phát triển trong nửa sau của thế kỷ 20 là sự bùng phát của các ca bệnh do Salmonella lây truyền qua thực phẩm lên người và chủng Salmonella kháng nhiều loại kháng sinh Trong thế kỷ 21, tình trạng kháng kháng sinh đã trở nên được quan tâm trên toàn cầu với sự kháng fluoroquinolones, carbapenem và cephalosporins thế hệ 3 trong các vi khuẩn Salmonella không thương hàn (Chen et al., 2013) Hầu hết các ca nhiễm Salmonella không thương hàn thường ít khi phải sử dụng đến kháng sinh, trừ các trường hợp biểu hiện nặng như nhiễm trùng máu, viêm tủy xương, và viêm màng não (Chen et al., 2013) Tuy nhiên sự gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella là một vấn đề quan ngại trên toàn thế giới trong những thập kỷ gần đây bởi sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị trên người

và trong chăn nuôi Sự cùng tồn tại của nhiều loài vi khuẩn trong đường ruột của động vật và con người đã tạo điều kiện cho việc truyền gen kháng kháng sinh giữa các loài vi khuẩn với nhau Các nghiên cứu đã tiến hành cho thấy các bằng chứng về vi khuẩn kháng kháng sinh đã được lan truyền từ động vật lên người (Thai T H et al., 2012)

Bên cạnh đó việc sử dụng rộng rãi kháng sinh trong chăn nuôi cho nhiều mục đích khác nhau như điều trị bệnh, phòng ngừa bệnh và kích thích tăng trưởng đã tạo cơ hội cho các loài vi khuẩn thích nghi, tăng tính kháng kháng sinh, đồng thời thông qua chuỗi thức ăn làm gia tăng tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh lên con người

Cũng như một số nước trên toàn thế giới, Việt Nam đang phải đối mặt với khó khăn trong quá trình điều trị do sự gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh Thực tế cho thấy dễ dàng mua bán kháng sinh cho điều trị trên con người mà không cần đơn của thầy thuốc và sử dụng kháng sinh tràn lan trong chăn nuôi tại Việt Nam là một trong những nguyên nhân chính thúc đẩy tình trạng kháng kháng sinh

Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng Salmonella có trong các thực phẩm như thịt gia súc, gia cầm, trứng, các sản phẩm sữa, hoa quả, rau và các sản phẩm thực phẩm khác, trong đó gia cầm được xem là nguồn thực phẩm chính mang mầm bệnh salmonellosis (Hannah et al., 2008)

Gia cầm là nguồn thực phẩm phổ biến trong cuộc sống hằng ngày của người Việt Nam Theo công bố của tổ chức thống kê Việt Nam, tính đến tháng

10 năm 2015, tổng sản lượng gia cầm trên cả nước là 341,9 triệu con, trong đó sản lượng gia cầm giết mổ và bán ra thị trường là 908,1 nghìn tấn với mức tiêu thụ tính theo đầu người là 38,1 kg Tuy nhiên thịt gia cầm cũng là nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và khả năng lây truyền chủng vi khuẩn kháng lên người Đến nay có rất ít báo cáo đã công bố về tình trạng vi khuẩn Salmonella không thương hàn trong thịt gia cầm chứa các gen mã hóa β-lactamase có khả năng kháng kháng sinh β-lactam Để có những bằng chứng cụ thể về thực trạng kháng kháng sinh của Salmonella không thương hàn trong thịt gia cầm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng β-lactam của các chủng Salmonella phân lập từ thịt gà tại các chợ trên địa bàn thành phố Hà Nội”

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.1 Khái niệm về Salmonella

Salmonella là các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột, gram âm, kị khí tùy ý, di động, lên men đường glucose Hiện nay, chi Salmonella được chia thành hai loài: S.enterica và S.bongori Các loài S.enterica gồm sáu phân loài: S.enterica, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae, và S.indica, trong khi không có phân loài thuộc S.bongori (Hald et al., 2013) Về dịch tễ học Salmonella được phân loại thành ba nhóm dựa trên vật chủ bao gồm (i) hạn chế vật chủ, đó là những chủng có khả năng gây bệnh thương hàn trong một loài duy nhất (ví dụ như, Salmonella Typhi ở người), (ii ) vật chủ tùy nghi, là týp huyết thanh liên kết với một loài vật chủ, nhưng cũng có thể gây bệnh ở các vật chủ khác; một số trong số này là tác nhân gây bệnh của con người và có thể tồn tại trong các loại thực phẩm, và (iii) không hạn chế vật chủ là typ huyết thanh gây bệnh cho người và động vật khác, bao gồm các phân loài có trong thực phẩm, ví

dụ S Typhimurium, Newport và S Enteritidis (Calo et al., 2015)

Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella

Nguồn: Centres for Disease Control and Prevention (US) (2013)

2.1.2 Khả năng gây bệnh của Salmonella

Salmonella là một trong các tác nhân quan trọng gây bệnh trên người lây truyền qua con đường thực phẩm trên toàn thế giới và là một trong những tác nhân gây bệnh hàng đầu gây thiệt hại về kinh tế và bệnh tật cho con người Các

nghiên cứu trên toàn thế giới xác định động vật là nguồn chứa lây nhiễm Salmonella lên người thông qua chuỗi thức ăn có chứa thực phẩm bị ô nhiễm Các thực phẩm liên quan thường là thịt bò, thịt lợn, thịt gia cầm, các sản phẩm từ sữa, trứng, và các báo cáo xác nhận các nhân tố thực phẩm nói trên là nguyên nhân của việc lây truyền vi khuẩn gây bệnh lên người (Hald, 2013)

Kể từ đầu những năm 1990, các chương trình giám sát và kiểm soát Salmonella trong chuỗi thức ăn từ trang trại đến bàn ăn đã được thực hiện ngày càng nhiều tại các nước trên toàn thế giới Nhận thức của một thị trường lương thực toàn cầu đã dẫn đến các đề xuất của cộng đồng quốc tế đối với sự kiểm soát toàn cầu về Salmonella Tuy nhiên, tỷ lệ mắc Salmonella trên người tại các quốc gia vẫn còn cao Các nỗ lực để giảm tỉ lệ nhiễm bệnh do Salmonella trên người

đã gặp khó khăn bởi sự xuất hiện rộng rãi nhiều nguồn thực phẩm chứa Salmonella và do khả năng thích nghi, tồn tại với sự thay đổi điều kiện môi trường của vi khuẩn này ngày càng cao (Hald, 2013) Salmonella có thể sống sót trong điều kiện môi trường khác nhau bên ngoài vật chủ ương ứng Hầu hết các typ huyết thanh Salmonella phát triển ở một phạm vi nhiệt độ 5-47°C với nhiệt

độ tối ưu của 35-37°C, nhưng một số có thể phát triển ở nhiệt độ thấp như 2-4°C

và cao tới 54°C Với khả năng phát triển dưới nhiều điều kiện sinh trưởng khác nhau và di truyền học đặc trưng của chi, Salmonella là tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm lý tưởng cho việc phát triển nghiên cứu tìm hiểu về cơ chế liên quan đến hiệu quả của các hợp chất kháng khuẩn (Oliveira et al., 2016)

Sự lây nhiễm Salmonella tiếp tục là mối quan tâm của cộng đồng Các báo cáo về các vụ ngộ độc và kết quả nghiên cứu cho thấy liều truyền nhiễm của Salmonella cần thiết để gây bệnh là 1000-100 000 CFU Tuy nhiên liều gây bệnh của Salmonella phụ thuộc vào typ huyết thanh và trạng thái thể chất của vật chủ

bị lây nhiễm nguồn bệnh (Phillip, 2014)

Hầu hết các ca nhiễm Salmonella không thương hàn thường gây viêm dạ dày ruột, biểu hiện từ nhẹ đến đau bụng dữ dội có hoặc không có sốt (39oC), buồn nôn, và tiêu chảy Các triệu chứng xuất hiện thường xảy ra trong vòng 6-12

h sau khi tiêu thụ thức ăn ô nhiễm hoặc uống nước mang mầm bệnh Các triệu chứng này thường giảm xuống trong vòng 3-4 ngày, nhưng có thể kéo dài tới 1 tuần Sau khi các triệu chứng giảm xuống, những người bị nhiễm bệnh có thể tiếp tục bài xuất vi khuẩn cho đến 3 tháng sau khi bị ốm, do đó nguy cơ lây nhiễm mầm bệnh lên người lành là rất cao Giống như hầu hết các bệnh nhiễm

trùng khác, các bệnh nhân nhỏ tuổi, người già, và người bệnh suy giảm miễn dịch

có nguy cơ gặp các biến chứng nguy hiểm (Phillip, 2014)

Salmonella có tập hợp các gen nằm trong nhiễm sắc thể có liên quan đến khả năng gây bệnh và được gọi là vùng gây bệnh Salmonella, có thể khác nhau

về kích thước, số lượng, và thành phần Một số những gen cần thiết cho cuộc xâm lược vào các tế bào biểu mô ruột, khởi phát tấn công đường ruột và phản ứng viêm được mã hóa trong vùng gây bệnh SPI-1, trong khi đó SPI-2 là chìa khóa cho sự hình thành nhiễm trùng hệ thống vượt ra ngoài biểu mô đường ruột cũng như mã hóa gen cần thiết để nhân rộng trong tế bào Độ bám dính của vi khuẩn Salmonella với bề mặt biểu mô ruột là một bước quan trọng đầu tiên trong sinh bệnh học Khi Salmonella được gắn vào các tế bào biểu mô ruột, các protein lông hoạt động tạo điều kiện bám dính, xâm lược, và chống lại sự tấn công của đại thực bào Những protein lông có liên quan với SPI-1 và SPI-2, tạo ra các kênh protein thụ thể trong tế bào biểu mô chủ tạo điều kiện cho các protein mang chức năng di chuyển xâm lấn vào các tế bào Trong lịch sử, các nhà nghiên cứu

đã sử dụng các tế bào động vật nuôi có vú như các mô hình trong phòng thí nghiệm để nghiên cứu sự tương tác của Salmonella theo một loạt các điều kiện khác nhau Cuộc xâm lược trong các tế bào biểu mô nuôi cấy thường được sử dụng để xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn Salmonella và so sánh các chủng khác nhau Một loạt các nghiên cứu cổ điển sử dụng nuôi cấy mô cho thấy Salmonella xâm nhập vào các tế bào động vật nuôi có vú có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều tác nhân kích thích từ môi trường như độ thẩm thấu carbohydrate sẵn có,

và oxy sẵn có Trong nghiên cứu của Durant và cộng sự vào năm 1999 đã báo cáo rằng sự xâm nhiễm của vi khuẩn Salmonella có thể bị ngăn cản bởi nồng độ cao của các axit béo chuỗi ngắn ở khu vực thấp hơn của đường tiêu hóa, ngoài việc thay đổi pH, căng thẳng oxy, và thẩm thấu (Oliveira et al., 2016)

Mặc dù có sự cải thiện vệ sinh môi trường và chất lượng thực phẩm, Salmonella không gây thương hàn tiếp tục là nguyên nhân của các vụ dịch lây truyền qua thực phẩm tại các nước kém phát triển Người ta ước tính có tới 93.800.000 trường hợp viêm dạ dày ruột do vi khuẩn Salmonella spp xảy ra trên toàn thế giới dẫn đến 155.000 ca tử vong mỗi năm Theo Chương trình giám sát Salmonella được thiết lập và hỗ trợ bởi Tổ chức Y tế thế giới, dữ liệu từ năm

2001 đến 2005, thì S.Enteritidis là typ huyết thanh phổ biến nhất trên toàn thế giới (65% các chủng), tiếp theo là S typhimurium (12%) và S Newport (4%) Tại

châu Phi, S Enteritidis and S Typhimurium đại diện 26% và 25% các chủng Ở châu Á, châu Âu và Mỹ Latin/Caribbean, S Entiritidis là typ huyết thanh được phân lập nhiều nhất trong số các typ huyết thanh Salmonella với tỉ lệ lên tới 38%, 87% và 31% Tại Bắc Mỹ S Typhimurium được tìm thấy thường xuyên nhất với 29%, tiếp theo là S Enteritidis với 21% (Sanchez et al., 2011)

Các nghiên cứu về vụ dịch xảy ra đã chỉ ra rằng Samonella non-typhi (NTS) truyền sang người có thể xảy ra bởi sự tiêu thụ sản phẩm động vật, các sản phẩm thực phẩm có chứa mầm bệnh, sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm, hoặc do tiếp xúc với động vật hoặc sản phẩm thực phẩm nhiễm bẩn Các trang trại nuôi động vật được xem là nguồn chứa mầm bệnh NST Con người dễ dàng lây nhiễm nguồn bệnh do do tiếp xúc với phân động vật Hơn nữa, chính hoạt động sản xuất

và phân phối thực phẩm đã làm phát tán hàng loạt các mầm bệnh và nhanh chóng lây lan trong cộng đồng Thêm vào đó sức đề kháng kháng sinh của NTS làm cho hoạt động kiểm soát và phòng chống bệnh truyền nhiễm càng gặp nhiều khó khăn hơn Bên cạnh đó, các hệ sinh thái phức tạp liên kết NTS với động vật, NTS

tự nhiên được tìm thấy ở gà, vịt, cừu, dê, lợn, bò sát, động vật lưỡng cư, chim, động vật gặm nhấm vật nuôi, chó, mèo, và trong hàng loạt động vật hoang dã là thách thức đối với cơ quan y tế công cộng trong công cuộc kiểm soát lây nhiễm (Sanchez et al., 2011)

2.1.3 Gia cầm – vật chủ chứa Salmonella

Salmonella lây truyền phổ biến nhất là thông qua thực phẩm hoặc nước bị

ô nhiễm, và thường liên quan đến việc tiêu thụ trứng hoặc sản phẩm gia cầm Theo Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA), từ 30 đến 35 % gia cầm chế biến bị nhiễm vi khuẩn Salmonella Một trong mười ngàn trứng sản xuất ở Đông Bắc Hoa Kỳ cũng được cho là bị nhiễm vi khuẩn Salmonella Ngoài thịt gia cầm, thịt bò, sản phẩm tươi sống, nước, thì các loại thực phẩm tươi như bơ đậu phộng, hạnh nhân,

và các loại thực phẩm ăn nhẹ, đều có liên quan đến các vụ dịch Salmonella (USDA, 2016) Do vệ sinh không đúng cách, nhiễm chéo, và thịt, trứng chưa được nấu nhiệt độ đủ cao để tiêu diệt vi khuẩn Salmonella được cho là các yếu tố góp phần vào sự bùng phát khuẩn Salmonella

Các nguồn chứa Salmonella tương đối đa dạng, nhưng một trong những nguồn chính là gia cầm và sản phẩm gia cầm Trong suốt thập niên vừa qua, khoảng 80% các vụ dịch Salmonella liên quan tới một số typ huyết thanh

Salmonella cụ thể Trong những vụ dịch, S.Enteritidis gây ra 35,7% với 65% trong số này liên quan đến trứng gia cầm và 13% liên quan đến thịt gia cầm Salmonella Typhimurium là nguyên nhân của 14,4% vụ dịch, trong đó 26% xuất phát từ thịt gà và 7% vụ dịch bắt nguồn từ trứng (Turki et al., 2017)

Thịt gia cầm là thực phẩm phổ biến trên toàn cầu do nhu cầu tiêu thụ của con người đã thúc đẩy sự tăng trưởng đáng kể trong việc sản xuất và tiêu thụ gia cầm và các sản phẩm gia cầm Trứng, các sản phẩm từ thịt gà và thịt gia cầm khác gia cầm khác là một trong các loại thực phẩm được tiêu thụ cao nhất trên toàn thế giới (Turki et al., 2017) Hàng năm, mức tiêu thụ thịt gà tính trên đầu người tại

Mỹ là trên 36,8 kg, vượt qua mức tiêu thụ thịt bò trong năm 2010 Ở các nước Liên minh châu Âu, 1,2 triệu tấn thịt gia cầm đã được sản xuất trong năm 2011, sau đó sản lượng thịt gia cầm theo xu hướng tăng lên hàng năm Số lượng thịt gà tiêu thụ tính theo bình quân đầu người là 23 kg trong năm 2011 (Turki et al., 2017) Tại Việt Nam, gia cầm cũng là nguồn thực phẩm phổ biến trong cuộc sống hằng ngày của người dân Theo công bố của tổ chức thống kê Việt Nam, tính đến tháng 10 năm 2015, tổng sản lượng gia cầm trên cả nước là 341,9 triệu con, trong đó sản lượng gia cầm giết mổ và bán ra thị trường là 908,1 nghìn tấn với mức tiêu thụ tính theo đầu người là 38,1 kg Do đó cần thiết đưa ra các yêu cầu tiêu chuẩn về an toàn thực phẩm để tránh sự lây lan của tác nhân Salmonella tại bất kỳ khâu nào của quá trình chăn nuôi và chế biến (Turki et al., 2017)

2.2.1 Tình hình ô nhiễm Salmonella trên gia cầm trên thế giới

Salmonella là nguyên nhân hàng đầu của bệnh từ thực phẩm do vi khuẩn tại các nước phát triển, và gia cầm được xác định là một trong những vật chủ hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc do Salmonella trên người Kể từ đầu những năm

1990, các chương trình giám sát và kiểm soát Salmonella trong chuỗi thức ăn từ trang trại đến bàn ăn đã được thực hiện ngày càng nhiều tại các nước trên toàn thế giới Nhận thức của một thị trường lương thực toàn cầu đã dẫn đến các đề xuất của cộng đồng quốc tế đối với sự kiểm soát toàn cầu về Salmonella Tuy nhiên, tỷ lệ mắc Salmonella trên người tại các quốc gia vẫn còn cao Các nỗ lực

để giảm tỉ lệ nhiễm bệnh do Salmonella trên người đã gặp khó khăn bởi sự xuất hiện rộng rãi nhiều nguồn thực phẩm chứa Salmonella và do khả năng thích nghi, tồn tại với sự thay đổi điều kiện môi trường của vi khuẩn này ngày càng cao

(Hald et al., 2013) Salmonella có thể sống sót trong điều kiện môi trường khác nhau bên ngoài vật chủ ương ứng Hầu hết các typ huyết thanh Salmonella phát triển ở một phạm vi nhiệt độ 5-47°C với nhiệt độ tối ưu của 35-37°C, nhưng một

số có thể phát triển ở nhiệt độ thấp như 2-4°C và cao tới 54°C Với khả năng phát triển dưới nhiều điều kiện sinh trưởng khác nhau và di truyền học đặc trưng của chi, Salmonella là tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm lý tưởng cho việc phát triển nghiên cứu tìm hiểu về cơ chế liên quan đến hiệu quả của các hợp chất kháng khuẩn (Oliveira et al., 2016)

Một chương trình khảo sát Salmonella kéo dài theo từng năm đã được thiết lập tại các nước phát triển như Mỹ và cộng đồng châu Âu nhằm đưa ra các cách thức ngăn chặn tỉ lệ nhiễm bệnh trên gia cầm và ngăn chặn khả năng lây lan sang người Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp Mỹ, năm 2014, 325 mẫu thịt gà nguyên con nhiễm Salmonella trong tổng số 8816 mẫu đã phân tích chiếm 3.7% (USDA, 2016) Báo cáo của hội đồng châu Âu năm 2010 cho thấy sự lưu hành của Salmonella tại các nước thuộc cộng đồng châu âu dao động từ 0-26% Tuy nhiên tỉ lệ Salmonella trên thịt gia cầm tại Hungary

là rất cao so với các nước còn lại, lên tới 85,6% Tại Úc, tỉ lệ Salmonella nhiễm trong gà là 10,4% (Manning et al., 2015)

Tại một số nước láng giềng của Việt Nam, sự lưu hành của Salmonella trong gia cầm chiếm một tỉ lệ rất cao Tại Thái Lan là 57%, Campuchia là 88.2%, Malaysia là 35,5% (Ta et al., 2012) và tại Trung Quốc là 41.6% (Zhua

et al., 2014)

2.2.2 Tình hình ô nhiễm Salmonella trên gia cầm tại Việt Nam

Sự lưu hành của Salmonella trên thịt gia cầm tại Việt Nam có sự thay đổi

về tỉ lệ giữa các nghiên cứu trên một vùng miền hoặc giữa các vùng miền khác nhau thuộc các tác giả khác nhau vào từng thời điểm khác nhau, tuy nhiên Salmonella vẫn hiện diện với tỉ lệ cao trên các mẫu thịt gia cầm thu thập, dao động từ 21% đến hơn 50% Nghiên cứu của Luu và cộng sự vào năm 2006 cho thấy tỉ lệ Salmonella trên thịt gia cầm thu thập tại các chợ Việt Nam là 48.9% (n=262) (15) Nghiên cứu của Ta và cộng sự vào năm 2011, cho thấy tỉ lệ nhiễm Salmonella tại Hà Nội là 51.1% (n=264) (15) Tiếp đó, báo cáo của Thái và cộng

sự vào năm 2012 cho thấy, 42,9% (n=115) mẫu thịt gà thu thập tại Hà Tây và Bắc Ninh nhiễm Salmonella (Thai T H et al., 2012)

Trong khi đó nghiên cứu thực hiện tại Thành phố Hồ Chí Minh và khu vực đồng bằng sông Mê Công cũng cho tỉ lệ nhiễm Salmonella trên gia cầm là cao Van và cộng sự báo cáo tỉ lệ thịt gia cầm nhiễm Salmonella tại Thành phố

Hồ Chí Minh là 53.3% (n=30) (Ta et al., 2012) Gần đây nhất nghiên cứu về Salmonella của Nguyễn và cộng sự cho thấy 65,3% mẫu thịt gà dương tính với Salmonella (Nguyen et al., 2016) Trong khi đó nghiên cứu của Phan và cộng sự tại vùng đồng bằng sông Mê Công cho thấy tỉ lệ nhiễm Salmonella thấp hơn với chỉ 21% (Ta et al., 2012)

2.3.1 Lịch sử phát triển của kháng sinh

Kháng sinh được phát hiện vào năm 1928 khi Fleming ghi nhận một khuẩn lạc khác thường của nấm mốc trong một số đĩa petri có chứa vi khuẩn Staphylococcus Các khuẩn lạc mốc đã khuếch tán vi khuẩn xung quanh nó, không có khuẩn lạc Staphylococcus xung quanh khuẩn lạc mốc Fleming đã viết bài báo đầu tiên của ông về penicillin trong năm 1929, đề cập đến việc sử dụng các chất bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để chọn lọc và phân lập vi khuẩn Haemophilus influenzae, được cho là nguyên gây ra bệnh cúm Theo thời gian, Fleming đã chứng minh rằng Penicillin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, và thậm chí diệt khuẩn Tuy nhiên trong giai đoạn này penicillin đã không được sử dụng rộng rãi Tiếp đó, sulfonamidochrysoidine (KI-730, Prontosil), được tổng hợp bởi các nhà hóa học Josef Klarer và Fritz Mietzsch và đã được thử nghiệm bởi nhà vi khuẩn học người Đức Gerhard Domagk về hoạt tính kháng khuẩn trên các loại bệnh khác nhau Trong các khoảng thời gian tiếp theo, rất nhiều họ kháng sinh và thế hệ kháng sinh mới ra đời, nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh trên người và động vật(Oliveira et al., 2016)

binding proteins) của tế bào Có khoảng 3 – 6 thụ thể PBP, trong đó một số thụ thể là những emzyme transpeptidase Sau khi kháng sinh gắn vào một hay nhiều thụ thể thuốc sẽ phong bế transpeptidase, làm ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của vách tế bào Giai đoạn tiếp theo

có liên quan đến việc hoạt hóa các emzyme tự tiêu (autolytic emzymes) gây ra sự

ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương Trong môi trường ưu trương những

tế bào bị biến đổi thành protoplast hay sphaeroplast chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào nên rất dễ vỡ Một số thuốc khác như Bacitracin, Vancomycin, Novobiocin ức chế giai đoạn đầu của việc tổng hợp peptidoglycan, Bacitracin ngăn cản việc dephosphoryl hóa phospholipid cần thiết cho việc tổng hợp chuỗi peptidoglycan Vancomycin ngăn cản sự di chuyển đường pentapeptide thành chuỗi đa phân tử bên ngoài màng tế bào Do việc tổng hợp ở giai đoạn đầu này xảy ra ở bên trong màng tế bào chất nên thuốc phải ngấm vào bên trong màng mới có tác dụng (Lee et al., 2015)

2.3.3 Cephalosporin và kháng sinh phổ rộng

Lớp kháng sinh cephalosporin – thuộc nhóm kháng sinh β-lactam – được phát hiện đầu tiên vào năm 1945, tuy nhiên phải mất gần 2 thập kỷ để đưa các kháng sinh này vào điều trị Một thập kỷ sau phát hiện ban đầu, các chất cephalosporin được phân lập và xác định là sản phẩm lên men của nấm mốc

Các nhà khoa học tại Oxford, bao gồm Florey và Abraham, với các thiết

bị đầy đủ đã nghiên cứu ra đặc điểm cấu trúc của các cephalosporin, như họ đã làm đối với penicillin một thập kỷ trước đó Ba chất cephalosporin P, N, và C đã được xác định Mỗi sản phẩm đều hoạt động kháng khuẩn nhưng chỉ cephalosporin C kháng cả vi khuẩn gram âm và gram dương Cephalosporin C đã trở thành nền tảng để phát triển các dòng cephalosporin tiếp theo Dược phẩm Cephalosporin đầu tiên là cephalothin, đã được giới thiệu để sử dụng lâm sàng vào năm 1964 Và đến nay đã có hơn 20 thuốc kháng sinh cephalosporin được sử dụng trong điều trị Cephalosporin là một trong những lớp kháng sinh được các nhà điều trị kê toa rộng rãi nhất vì độc tính thấp và khả năng hoạt động phổ rộng của chính kháng sinh này

Về cấu trúc hóa học, hầu hết các cephalosporin có sẵn là các dẫn xuất bán tổng hợp của cephalosporin C Cấu trúc cơ bản của hạt nhân cephem bao gồm một vòng β-lactam hàn lại thành một, sáu thành viên có chứa lưu huỳnh vòng

dihydrothiazine Hạt nhân cephem hóa học riêng biệt từ lõi penicillin, trong đó có một chiếc vòng thiazolidine năm thành viên Sửa đổi hóa học của cấu trúc cephem

cơ bản bằng cách thay thế các thành phần tại các vị trí C1, C3, và C7 dẫn đến các hợp chất cephalosporin khác nhau trong sử dụng ngày nay (Threlfall, 2002)

Về phân loại, cephalosporin gồm 5 thế hệ, dựa vào phổ hoạt động của kháng sinh Thế hệ đầu cephalosporin hoạt động tập trung chủ yếu vào các vi khuẩn gram dương Các thế hệ thứ hai thuốc đã tăng cường hoạt động chống trực khuẩn gram âm nhưng duy trì mức độ khác nhau của hoạt động đối với cầu khuẩn Gram dương Các cephalosporin thế hệ thứ ba đã tăng lên rõ rệt tiềm năng chống lại vi khuẩn gram âm Tuy nhiên, đối với một số hợp chất trong nhóm 3, hoạt động chống lại cầu khuẩn gram dương lại giảm Trong số nhóm thế hệ thứ

ba, một vài hợp chất, chẳng hạn như ceftazidime và ceftolozane, được xem xét riêng biệt cho hoạt động chống lại P aeruginosa Thế hệ thứ tư có phổ hoạt động rộng nhất trong năm nhóm Những loại thuốc, chẳng hạn như cefepime và cefpirome, chống lại hầu hết các trực khuẩn gram âm, và duy trì hiệu lực chống lại cầu khuẩn gram dương Các loại thuốc thứ ba và thứ tư kết hợp cũng được gọi

là mở rộng phổ cephalosporin Nhóm thứ năm được gọi là cephalosporin kháng

tụ cầu kháng methicillin bao gồm ceftaroline và ceftobiprole

2.3.4 Kháng kháng sinh

Dưới tác dụng của kháng sinh, một số chủng vi khuẩn đã dần thích nghi

và kháng lại các kháng sinh Sự xuất hiện của các mầm bệnh kháng nhiều loại thuốc khác nhau đã làm gia tăng lo ngại về những hậu quả và tác động của chúng sức khỏe con người và quá trình điều trị bệnh trên người (Oliveira et al., 2016)

Sự kháng thuốc được định nghĩa là sức đề kháng của vi khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn mà mà trước đây chúng chỉ biểu hiện sự nhạy cảm Đầu tiên hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn là quá trình tiến hóa tự nhiên, sau

đó hiện tượng kháng thuốc ngày càng gia tăng trong các loài vi sinh vật gây bệnh bởi bởi sử dụng sai thuốc kháng sinh và sự lây lan toàn cầu của vi khuẩn kháng thuốc, chủ yếu ảnh hưởng đến bệnh nhân có hệ miễn dịch kém hoặc sức khỏe yếu Sự kháng thuốc đã tiêu tốn nhiều chi phí hơn trong quá trình chữa trị và trong hoạt động nghiên cứu về ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh Một loạt các loại thuốc kháng sinh đã bị kháng bởi các vi sinh vật gây bệnh trong những thập kỷ gần đây, và nhân tố kháng thuốc có thể được tạo ra và lan truyền từ vi

sinh vật này sang vi sinh vật khác, từ loài vi khuẩn này sang loài vi khuẩn khác theo nhiều cách khác nhau (Oliveira et al., 2016)

Thông qua hoạt động chuyển gen, ví dụ, integrons, nhân tố DNA di động

có thể bắt giữ và mang các gen, được vận chuyển bởi các gen nhảy (transposon), cho phép các vi sinh vật gây bệnh trao đổi cơ chế kháng kháng sinh Một trường hợp đề kháng tự nhiên được thấy thường xuyên bởi các tỷ lệ đột biến tự nhiên trong gen nằm trên nhiễm sắc thể mà sau đó được nhân tố đột biến được lan truyền bởi sự nhân lên của vi khuẩn Một trong những cơ chế kháng là sự tích hợp của DNA trên hệ gen từ vi khuẩn chết và plasmid của các tế bào sống, mà cũng có thể xảy ra với integrons đến từ phẩy khuẩn Đột biến xảy ra tất cả các thời gian, và một đơn giản, thay đổi nucleotide duy nhất có thể làm thay đổi gen

và, bằng cách chuyển gen kháng lên vi sinh vật Các plasmid từ một loại vi khuẩn, với bất kỳ loại integron, có thể dễ dàng chuyển sang vi khuẩn khác thông qua chuyển gen ngang bởi sự tiếp hợp (Oliveira et al., 2016)

Vật liệu di truyền được trao đổi giữa các vi sinh vật qua ba tuyến đường chính: (i) tái tổ hợp DNA, ví dụ: từ Streptococcus mitisto sang Streptococcus pneumoniae, (ii) truyền nhân tố kháng kháng sinh, ví dụ kháng methycillin trong Staphylococcus aureus đã được phân lập trong các mẫu phân ở các trang trại và

cơ sở giết mổ; và (iii) sự tiếp hợp, ví dụ là các plamid chịu trách nhiệm cho sự phổ biến toàn cầu của các gen mã hóa enzyme carbapenemase hoặc β-lactamase, đặc biệt phổ biến trong các vi khuẩn gram âm và tụ cầu (Urumova, 2015)

Sự hình thành tính kháng kháng sinh của vi khuẩn đã được ghi nhận sớm nhất vào giai đoạn đầu của kỷ nguyên kháng sinh Trong vòng 20 năm qua, sự phát triển của các chủng gây bệnh nguy hiểm và khả năng kháng kháng sinh của chúng đã liên tiếp phát triển Nguyên nhân chính là sự thiếu hiểu biết của người

sử dụng về kháng sinh, dẫn đến lạm dụng kháng sinh trong điều trị Sự lạm dụng kháng sinh đã gây ra áp lực chọn lọc tự nhiên cho vi khuẩn và thúc đẩy quá trình tiến hóa nhanh của vi khuẩn Hơn nữa, các hợp chất trong hệ sinh thái và điều kiện môi trường sống cũng góp phần cung cấp áp lực chọn lọc bổ sung lên vi sinh vật Bên cạnh đó, nguyên nhân khác thúc đẩy hiện tượng kháng kháng sinh

ở vi khuẩn là việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích trị bệnh và thúc tăng trọng Hiện nay, kháng kháng sinh đã là vấn đề toàn cầu, và các nước phát triện hiện đã xây dựng các chương trình để hạn chế tình trạng này Ví dụ, ở các nước Bắc Âu, đã nghiên cứu việc sử dụng hợp lý thuốc kháng sinh, cùng với

loại bỏ các chất kích thích tăng trưởng cho từ động vật nuôi Từ năm 2006, các nước Liên minh châu Âu khác đã và đang áp dụng các biện pháp tương tự để hạn chế sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp (Oliveira et al., 2016)

2.3.5 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

Có rất nhiều cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn, trong số đó 5 cơ chế thường thấy nhất là: 1) enzyme ức chế hoạt động của kháng sinh, 2) biến đổi trong protein liên kết penicillin (PBP), 3) đột biến Porin, bơm đẩy kháng sinh ra 4) khỏi tế bào, và 5) thay đổi mục tiêu của kháng sinh (thay đổi thành tế bào) (Calo et al., 2015)

Để ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, kháng sinh có xu hướng tác động lên mục tiêu cụ thể như ức chế tổng hợp protein cụ thể, DNA và RNA tổng hợp, can thiệp vào sự tổng hợp thành tế bào, phá vỡ các cấu trúc màng thấm, và ức chế sự tổng hợp chất chuyển hóa thiết yếu Do cấu trúc sinh học khác nhau của kháng sinh, các mục tiêu tấn công của kháng sinh có thể khác nhau tùy thuộc vào từng đối tượng vi khuẩn đang tiếp xúc với chính kháng sinh Ví dụ, thuốc kháng sinh như penicillin và cephalosporin ức chế vi khuẩn tổng hợp vách tế bào bằng cách can thiệp với các enzyme liên quan đến tổng hợp lớp peptidoglycan; trong khi tetracycline và streptogramin làm việc bằng cách phá vỡ sự tổng hợp protein Một chủng vi khuẩn được xem là kháng với một kháng sinh đặc biệt khi các kháng sinh không còn hiệu quả để điều trị một căn bệnh gây ra bởi một tác nhân gây bệnh của vi khuẩn đặc biệt (Calo et al., 2015)

Enzyme ức chế hoạt động của kháng sinh

Cơ chế kháng phổ biến nhất của vi khuẩn là enzyme ức chế Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của kháng sinh, bằng cách này chúng có thể phá hủy hoạt tính của kháng sinh

Cơ chế này được dựa trên một số chiến lược để thay đổi cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn: thủy phân, một loại phản ứng xảy ra chủ yếu với các kháng sinh β-lactam; thay đổi các nhóm chức năng (acyl, phosphoryl, thiol, nucleotidil, ADP-ribosyl, glycosyl), xảy ra với rất nhiều kháng khuẩn, chẳng hạn như aminoglycoside, chloramphenicol, rifamycin, và lincosamide; và oxi hóa khử, xảy ra với tetracycline, rifamycin, và streptogramin Hơn nữa enzyme có thể sửa đổi các hợp chất kháng khuẩn, β-lactamase là một vấn đề lớn trong việc điều trị các vi khuẩn Gram âm Chúng bao gồm enzyme penicillinases, chống lại các kháng sinh penicillin, hoặc enzyme AmpC cephalosporinases (ví dụ, MOXs,

MIR, FOX) Có nhiều enzyme β-lactamase phổ rộng (ví dụ, SHV-1, TEM-1, TEM-2, CTX), có khả năng thủy phân các penicillin và các cephalosporin và kháng lại các chất ức chế lactamase (ví dụ, axit clavulanic, sulbactam và tazobactam) Nhóm enzyme kháng lại penicillin và cephalosporin, bao gồm cefotaxime và ceftazidime; Hơn nữa, nhiều vi khuẩn sản sinh enzyme TEM và SHV còn đồng kháng với tetracycline, sulfonamides, và aminoglycosid Phần lớn các vi khuẩn sinh enzyme CTX-M kháng với fluoroquinolones Cuối cùng, enzyme carbapenemases (ví dụ, IMP, VIM, KPCs, OXAs), là các enzyme có khả năng bất hoạt tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam (Calo et al., 2015)

Biến đổi các protein liên kết penicillin (PBPs)

PBPs là protein quan trọng có liên quan trong việc xây dựng các peptidoglycan, là thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn Các enzyme này xúc tác các sợi glycan và và liên kết ngang giữa các chuỗi glycan Các vị trí hoạt động của sợi glycan là mục tiêu của kháng sinh β-lactam Các hợp chất này bắt chước sợi peptit đôi D-Ala-D-Ala trong peptidoglycan và tạo thành một phức acyl-enzyme rất ổn định, dẫn đến enzyme bị bất hoạt Khi các PBPs thay đổi vị trí hoạt động, thì các kháng sinh β-lactam sẽ để mất hoặc làm giảm ái lực của chúng với các protein mục tiêu, dẫn đến sự kháng thuốc

Biến đổi Porin

Vi khuẩn Gram âm có một lớp màng bên ngoài vách tế bào, màng ngoài, trong đó bao gồm một lớp lipid kép Các thành phần chính của lớp đôi này là lipopolysaccharide, là hợp chất kị nước, nên các hợp chất ưa nước rất khó khăn

để đi qua Do đó, porins hoặc porins màng ngoài (OMP), là các protein hỗ trợ trong việc thông qua các chất hòa tan thấm qua màng lipid kép Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng của thuốc để vượt qua porins, chẳng hạn như hình dạng, kích thước Có một số porins điển hình, chẳng hạn như OmpF, OmpC, và OmpE Mỗi loài vi khuẩn sản xuất các porins cụ thể, và sự mất mát hoặc giảm hoạt động của một hoặc nhiều OMP là một yếu tố góp phần phổ biến trong việc xây dựng sức đề kháng (ví dụ, mất OprD) của P aeruginosa đối với imipenem và meropenem Ở các loài khác, mất OmpF có thể dẫn đến các sinh vật kháng với nhiều loại kháng sinh (đa kháng) Trong một số chủng, sự giảm hoặc mất ái lực của thuốc với các protein (porin), dẫn đến mất khả năng để vượt qua các màng ngoài và không thể xâm nhập vào tế bào Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng

áp lực chọn lọc tác dụng bởi việc sử dụng kéo dài của thuốc kháng sinh là một

yếu tố quan trọng trong sự xuất hiện của vi khuẩn đa kháng, và việc sửa đổi các porins là một yếu tố quan trọng sự hình thành đa kháng thuốc (Calo et al., 2015)

Protein bơm

Một cơ chế hiệu quả cao của kháng kháng sinh là sự sản sinh hệ thống protein bơm kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn Tất cả các thành viên của họ protein này bao gồm 3 dạng không thay đổi sau: Dạng A, đóng vai trò như cửa của tế bào chất, kiểm soát sự di chuyển của các chất nền đến và đi từ các tế bào chất; dạng B, đó là tham gia vào các khớp nối năng lượng; và dạng C, định hướng vị trí và đề xuất hướng vận chuyển Các protein đặc trưng nhất trong họ này là protein vận chuyển tetracycline (TetB), đã được tìm thấy trong E coli (Calo et al., 2015)

Sửa đổi phân tử mục tiêu của các kháng sinh

Hầu hết các kháng sinh ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein đều nhằm vào các ribosome mục tiêu, và sự khác biệt giữa cấu trúc của ribosome này cho các hành động chọn lọc của thuốc kháng sinh trong vi khuẩn, vi khuẩn cổ, và các tế bào nhân chuẩn Ngay cả giữa các loài, sự thay đổi nhỏ trong cấu trúc ribosome có thể dẫn đến mang phong cách riêng, tương tác đặc hiệu mang tính chất của loài lên kháng sinh Do đó các kháng sinh nhắm vào ribosome là chất diệt khuẩn rất mạnh Tuy nhiên, qua nhiều thập kỷ sử dụng, các tác nhân gây bệnh đã trở nên đề kháng với thuốc kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein Một

cơ chế đáng chú ý của kháng là việc sửa đổi các mục tiêu của kháng sinh Ví dụ, những thay đổi nhỏ trong một chuỗi axit amin, dẫn đến thay đổi cấu trúc protein

đủ để cản trở kháng sinh Các báo cáo đầu tiên của sự thay đổi cấu trúc ribosome trong đột biến erythromycin kháng E coli mô tả sự thay đổi protein ribosome, đáng chú ý là các protein L4 và L22 (Calo et al., 2015)

2.3.6 Kháng Cephalosporine

Escherichia coli, Salmonella spp và Acinetobacter spp là tác nhân gây bệnh quan trọng ở người Các trường hợp nhiễm khuẩn nặng do các vi sinh vật nói trên thường được điều trị bằng cephalosporin phổ rộng (ESCs).Tuy nhiên, trong hai thập kỷ qua, hoạt động điều trị đã phải đối mặt với sự gia tăng nhanh chóng các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi sự kháng cephalosporin phổ rộng của các chủng vi khuẩn gây bệnh do sự hình thành enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL), plamid trung gian AmpCs và các enzyme carbapenemase Tình trạng

này làm hạn chế đáng kể quá trình điều trị và gây nguy hiểm đến sức khỏe con người Gia cầm được xem như là nguồn chứa các vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc Chính việc sử dụng tự do các kháng sinh trong chăn nuôi đã góp phần vào

sự thích nghi và tính chọn lọc của vi khuẩn trong quá trình kháng lại kháng sinh cephalosporin phổ rộng của chủng vi khuẩn Salmonella Ngày nay, sự phổ biến của thức ăn có nguồn gốc từ động vật có chứa các vi khuẩn Salmonella và E coli mang gen kháng kháng sinh cephalosporin phổ rộng (đặc biệt là các chủng vi khuẩn có chứa gen CTX-M và CMY-2 pAmpC mã hóa enzyme B-lactamase) đã gây ra lo ngại cho công cuộc điều trị Hơn nữa, gần đây với sự xuất hiện các chủng kháng carbapenem (vi khuẩn đường ruột sản sinh VIM-1, NDM-1 hay OXA-23) đang là mối quan tâm lớn của cả cộng đồng (Seiffert et al., 2013)

Việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y đã góp phần vào việc lựa chọn và lây lan của các vi khuẩn gram âm đa kháng kháng sinh, đặc biệt là là E coli, Salmonella kháng cephalosporin phổ rộng đã được phân lập trên động vật nuôi tại các trang trại, động vật hoang dã, trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và từ môi trường(Seiffert et al., 2013)

2.3.7 Enzyme B-lactamase phổ rộng

Nhóm enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL), là enzyme có tác dụng kháng cephalosporin thế hệ ba và thế hệ 4, carbapenem và monobactam Hiện tượng kháng các kháng sinh trên đã được ghi nhận vào thập niên 1980, tại Đức, năm 1983, ca bệnh đầu tiên đã được mô tả là có sự xuất hiện vi sinh vật sản sinh enzyme β-lactamase Vi khuẩn sinh enzyme ESBL thường đa kháng do các gen qui định tính kháng lên các loại kháng sinh khác nhau đều nằm trên cùng 1 plasmid Một số vi khuẩn sinh enzyme ESBL kháng với nhóm aminoglycosides, 4-quinolon Bên cạnh đó nhiều vi khuẩn sinh enzyme beta-lactamase phổ rộng đang hoạt động chống lại hầu hết các kháng sinh β-lactam, bao gồm oxyimino-betalactams, ceftazidime, ceftiofur, aztreonam, có thể bị bất hoạt bởi axit clavulanic (Lee et al., 2015)

Nhóm enzyme ESBL được phân loại dựa trên cấu tạo, kết cấu phân tử của enzyme và nhóm kháng sinh mà các enzyme này ức chế Năm 2010, dựa trên cấu trúc phân tử, các enzyme B-lactamase được chia làm 4 nhóm: nhóm 1 (lớp C) bao gồm các enzyme kháng cephalosporin; nhóm 2 (lớp A và D) bao gồm ESBL

và các enzymecarbapenemases; nhóm 3 gồm metallo-β-lactamase; nhóm 4 là các enzyme penicillinase kháng clavulanic axit (Lee et al., 2015)

ESBL còn được định nghĩa là các enzyme b-lactamase có thể bị ức chế bởi axit clavulanic, tazobactam hoặc sulbactam, và được mã hóa bởi các một số gen có thể được trao đổi giữa các vi khuẩn như sau (Shaikh et al 2014):

Enzyme SHV

Tập hợp các enzyme SHV của nhóm β-lactamase dường như được bắt nguồn từ Klebsiella spp Khởi nguồn của tập hợp enzyme SHV, là SHV-1, tìm thấy đầu tiên trong chủng vi khuẩn gây bệnh K pneumoniae Trong nhiều chủng

K pneumoniae, các gen mã hóa SHV 1, LEN-1, cư trú trên các nhiễm sắc thể của

vi khuẩn, sau đó được kết hợp vào một plasmid và đã phát tán gen này đến các vi khuẩn đường ruột khác SHV-1 kháng với penicillin phổ rộng như ampicillin, tigecycline và piperacillin

Enzyme TEM

Enzyme TEM-1, lần đầu tiên được báo cáo từ một chủng E coli phân lập vào năm 1965, có khả năng kháng kháng sinh tương tự như enzyme SHV-1 TEM 1 có khả năng thủy phân penicillin và cephalosporin thế hệ đầu tiên nhưng không thể tấn công các cephalosporin oxyimino Tuy nhiên sau đó đã xuất hiện các biến thể TEM đầu tiên gia tăng hoạt động chống lại các cephalosporin phổ rộng là TEM-3 TEM-3, lần đầu được báo cáo vào năm 1989, là enzyme TEM β-lactamase đầu tiên hiển thị các kiểu hình ESBL Hiện nay các biến thể của TEM ngày càng mở rộng về số lượng và phổ biến trong các vi khuẩn đường ruột

Enzyme CTX

Một nhóm enzyme β-lactamase mới là CTX, ưu tiên thủy phân cefotaxime Nhóm enzyme này đã được tìm thấy trên một số chủng vi khuẩn như Salmonella Typhimurium, E coli và một số loài Enterobacteriaceae khác Đây

là nhóm enzyme liên quan rất chặt chẽ với enzyme TEM hoặc SHV CTX-M lactamase được cho là bắt nguồn từ gen nhiễm sắc thể ESBL trong loài Kluyvera spp., một tác nhân gây bệnh cơ hội của thuộc vi khuẩn Enterobacteriaceae được tìm thấy trong môi trường CTX-M protein đã được phát hiện vào cuối những năm 1980 và ngày nay hơn 100 biến thể đã được giải trình tự Dựa trên trình tự axit amin của chúng, nhóm enzyme này có thể được chia làm năm nhóm (CTX-

β-M nhóm 1, 2, 8, 9, và 25):

• СТХ-М-1: bao gồm 6 enzyme liên quan đến plasmid 12-15, FEC-1) and enzymes СТХ-М-22, -23, -28;

(СТХ-М-1,-3,-10,-• СТХ-М-2: bao gồm enzymes liên quan đến plamid (СТХ-М-2, -4, -5, -6, -7,- 20, Toho-1);

• СТХ-М-8 bao gồm 1 enzyme liên quan đến plasmid;

• СТХ-М-9 gồm các enzyme có trên plasmid (СТХ-М-9,-13, -14, -16, -17, -19, -21, -27, Toho2) và СТХ-М-24;

• СТХ-М-25 bao gồm СТХ-М-25 và СТХ-М-26

Nguồn gốc của các enzyme CTX-M là khác nhau với enzyme TEM và SHV ESBL Trong khi enzyme SHV-ESBL và TEM-ESBL được tạo ra bằng cách thay thế axit amin của protein vi khuẩn gốc thì CTX-M ESBL đã được tiếp nhận bởi hiện tượng chuyển gen từ các vi khuẩn khác khi có sự tiếp hợp của plasmid hoặc các gen nhảy Các trình tự gen mã hóa enzyme CTX-M cho thấy một sự tương đồng cao với những β-lactamase của loài Kluyvera Ngoài ra, các trình tự gen tiếp giáp với các gen CTX-M trên các vi khuẩn Enterobacteriaceae cũng tương tự như những gen xung quanh các gen β-lactamase trên nhiễm sắc thể của loài Kluyvera

Enzyme OXA

Các enzyme β-lactamase OXA được đặt tên dựa trên khả năng thủy phân oxacillin Các β-lactamase này được đặc trưng bởi tỷ lệ thủy phân cloxacillin và oxacillinlớn hơn 50% đối với Penicillin G Chúng chủ yếu xảy ra ở P aeruginosa nhưng đã được phát hiện trong nhiều vi khuẩn Gram âm khác Sự tiến hóa của enzyme ESBL OXA có nhiều điểm tương đồng với sự tiến hóa của enzyme ESBL SHV- và TEM

β-lactamase từ Plasmid (AmpC)

Plasmid mang gen mã hóa enzyme βlactamase AmpC thường sở hữu các gen kháng kháng sinh khác nhau kháng với các kháng sinh nhóm aminoglycosides, chloramphenicol, sulfonamides, tetracycline, trimethoprim

và phân tử thủy ngân Các chủng vi sinh gây bệnh sản sinh ra enzyme lactamase AmpC và các enzyme β-lactamase khác, mà các gen nằm trong cùng một hoặc trên các plasmid khác nhau đã được phân lập Enzyme β-lactamase AmpC được phân loại thành 5 nhóm (С1-С5) theo trình tự axit amin Các thành viên thường gặp nhất của nhóm này là enzyme beta-lactamase CMY 2 (Lee et al., 2015)

β-Các enzyme ESBL khác

Một số enzyme ESBL khác như PER, GES, BES, CME, SFO, GES, PSE

đã được tìm thấy và phân lập trên vi sinh vật gây bệnh ở khắp nơi trên thế giới (Shaikh et al., 2014)

2.3.8 Kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella

Trong nhiều năm qua, tình hình kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Salmonella đã được ghi nhận rộng rãi trên toàn thế giới

Tại Vương quốc Anh trong 1964-1966, S Typhimurium là các tác nhân gây bệnh chủ yếu trong chăn nuôi, quá trình điều trị kháng sinh để tiêu diệt S Typhimurium đã tạo nên các vi khuẩn kháng thuốc Chủng vi khuẩn này đã được lan truyền từ bò lên người, dẫn đến tình trạng kháng thuốc ở người (Jorgensen et al., 2009)

Tại Hà Lan từ năm 1972 và 1974, gần 50.000 Salmonella phân lập được

từ nhiều nguồn khác nhau (người, động vật, sản phẩm động vật, nước thải, vv) đã cho kết quả kháng với ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, và tetracycline Trong nghiên cứu này, tỷ lệ kháng với ít nhất một trong các loại thuốc trên dao động từ 39,2% đến 45,6% Hơn nữa, nhiều chủng đa kháng S Typhimurium và

S Dublin được phân lập từ bê và gia súc Năm 1974, 64,4% của tất cả các chủng

S Typhimurium từ những con vật này xuất hiện đề kháng với ampicilin, tetracyclin, chloramphenicol, và kanamycin, và 25,5% của S Dublin đã được tìm thấy là kháng chloramphenicol và tetracycline (Jorgensen et al., 2009)

Cohen & Tauxe (1986) đã phân tích sự xuất hiện của kháng kháng sinh ở serovar Salmonella tại Hoa Kỳ từ năm 1960 đến năm 1980, kết luận rằng việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đóng một vai trò quan trọng trong sự xuất hiện hoặc sự bền bỉ của các chủng Salmonella kháng thuốc

Năm 2009, Zewdu & Cornelius đánh giá kháng kháng sinh của 98 chủng Salmonella thu hồi từ thực phẩm ở Addis Ababa, Ethiopia Các kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng 32 chủng Salmonella kháng với một hoặc nhiều trong số 24 chất kháng khuẩn được thử nghiệm Tính kháng phổ biến nhất là kháng streptomycin (75%), ampicillin (59,4%), tetracycline (46,9%), spectinomycin (40,6%), và sulfisoxazole (40,6%) Mức độ kháng kháng sinh cao hơn đáng kể cho các chủng phân lập từ thịt gà (62,1%) và từ thịt lợn (22,7%) (Jorgensen et al., 2009)

Việc sử dụng kháng sinh như ampicillin, chloramphenicol, tetracycline đã không còn hiệu quả cao do sự xuất hiện của chủng Salmonella đa kháng Tương

tự như vậy, các chủng Salmonella phân lập tại thời điểm hiện tại có khả năng kháng fluoroquinolones, như ciprofloxacin, hoặc cephalosporin phổ rộng, là các loại kháng sinh thường được sử dụng để điều trị bệnh nhân bị nhiễm Salmonella enterica hoặc để điều trị trường hợp nghiêm trọng của viêm dạ dày ruột Varma et

al (2005) đã báo cáo rằng kháng kháng sinh ở Salmonella không thương hàn làm tăng các ca bệnh nhiễm trùng máu Nhiễm trùng đường máu đã được báo cáo xảy

ra thường xuyên hơn ở những người bị nhiễm vi khuẩn Salmonella không thương hàn đa kháng với nhiều loại kháng sinh Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy có mối liên quan giữa sức đề kháng, nhiễm trùng máu, và nhập viện trên các bệnh nhân mang mầm bệnh Salmonella không thương hàn (Calo et al., 2015)

Các ví dụ về sự gia tăng tính kháng của Salmonella không thương hàn được thấy rõ tại các nước Ấn Độ, phía nam Đông Nam Á, Trung Mỹ và Châu Phi bởi các typ huyết thanh Salmonella Typhimurium, Salmonella Johannesburg và Salmonella Oranienburg (Neto et al., 2010)

Cơ chế hoạt động kháng thuốc của Salmonella

Alcaine et al (2007) đã xác định hai cơ chế được biết đến là rất quan trọng cho sự lây lan của kháng kháng sinh ở vi khuẩn Salmonella là (i) chuyển các gen kháng kháng sinh và (ii) lây lan của chủng kháng khuẩn Salmonella kháng thuốc Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng khả năng kháng fluoroquinolines ở một số phân typ huyết thanh Salmonella là kết quả của đột biến gen một hoặc nhiều điểm mục tiêu Trong trường hợp của tetracycline, Salmonella với kháng sinh thông qua cơ chế bơm thuốc ra từ các tế bào, làm giảm mức độ độc hại của thuốc trong tế bào vi khuẩn (Calo et al., 2015)

Trong tế bào vi khuẩn Salmonella, cơ chế đề kháng với beta-lactam đã được

mô tả phổ biến nhất liên quan đến sự sản sinh các enzyme β-lactamase Chloramphenicol thuộc về họ kháng sinh phenicols và cơ chế hoạt động của nó là thông qua việc ngăn ngừa hình thành liên kết peptide Có hai cơ chế đề kháng trong Salmonella cho kháng sinh này là: (i) bất hoạt khả năng phân giải của kháng sinh và (ii) loại bỏ các kháng sinh thông qua một máy bơm tuôn ra (Calo et al., 2015)

Chủng Salmonella đa kháng

Chủng Salmonella đa kháng được định nghĩa là những chủng có khả năng kháng hai hoặc nhiều chất kháng khuẩn Ví dụ, Salmonella Heidelberg đã phân

lập thường đặc trưng bởi sự đề kháng với ampicillin, amoxicillin-clavulanic axit, ceftiofur, cũng như cephalothin Salmonella đa kháng có thể mang yếu tố quyết định tới khả năng kháng của chúng trên các vị trí thuộc về nhiễm sắc thể hoặc plasmid, hoặc trên cả hai S Typhimurium đa kháng đã phân lập có hai dạng kháng thuốc phổ biến, cụ thể là: (i) kháng với ampicillin, kanamycin, streptomycin, sulfamethoxazole, và tetracycline hoặc (ii) kháng với ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulfamethoxazole, và tetracycline Một số typ huyết thanh thường cho thấy tỉ lệ đa kháng thuốc như phân loài Agona, Anatum, Cholerasuis, Derby, Dublin, Kentucky, pullorum, Schwarzengrund, Seftenberg, và Uganda, Typhimurium, Heidelberg, và Newport trong đó 2 typ huyết thanh Typhimurium và Newport có tỉ lệ kháng đa thuốc ngày càng tăng cao (Calo et al., 2015)

2.4.1 Các phương pháp phát hiện Salmonella

2.4.1.1 Phương pháp vi sinh truyền thống

Phương pháp nuôi cấy là phương pháp truyền thống được sử dụng rộng rãi trong việc phát hiện và định lượng Salmonella dựa trên nguyên lý tăng sinh làm giàu vi khuẩn, phân lập trên thạch chọn lọc, tính chất sinh hóa và phản ứng kháng huyết thanh Để phát hiện Salmonella cần 1 tuần để phân tích, và dù tiêu tốn nhiều thời gian, thì phương pháp truyền thống vẫn được xem là một “tiêu chuẩn vàng” ngay cả trong thời kỳ hưng thịnh của kỹ thuật phân tử, giúp sàng lọc nhanh Salmonella trong mẫu bệnh phẩm, thực phẩm và mẫu môi trường (26) Có nhiều phương pháp truyền thống khác nhau dựa trên môi trường nuôi cấy sử dụng đã được ban hành bởi các tổ chức quốc tế như Tổ chức Tiêu chuẩn hoá (ISO), Hiệp hội chính thức các nhà hóa học phân tích (AOAC), Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA), và Tổ chức An toàn và Kiểm tra Thực phẩm (FSIS) của Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA)

Các phương pháp vi sinh truyền thống thường được lựa chọn là phương pháp phân tích trong nhiều phòng thí nghiệm an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng do dễ sử dụng, độ tin cậy của kết quả, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, và chi phí thấp hơn so với công nghệ phân tử

2.4.1.2 Phương pháp phát hiện nhanh

Một số phương pháp nhanh chóng sử dụng kỹ thuật khuếch đại phân tử DNA đã được phát triển, xác nhận, và có sẵn trên thị trường Các phương pháp này được tiến hành trong thời gian ngắn với lượng mẫu nhiều Các phương pháp nhanh cho phép phát hiện Salmonella spp trong các mẫu và cung cấp kết quả trong vòng một vài giờ đến một ngày Phương pháp nhanh bao gồm phương pháp

sử dụng môi trường chọn lọc mới biểu hiện bằng phát màu, xét nghiệm dựa trên miễn dịch học, và các xét nghiệm dựa trên axit nucleic Trong các phương pháp khác nhau, kỹ thuật ELISA và PCR thường được sử dụng ELISA có thể phát hiện Salmonella ở cấp 104-105/ml trong khi thử nghiệm PCR có mức độ nhạy cảm tại 104/ml sau khi làm giàu Độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp này chủ yếu phụ thuộc vào hệ vi sinh vật trong mẫu, nền mẫu, và chất ức chế (ví

dụ chất béo, protein, polysaccharides, kim loại nặng, thuốc kháng sinh, và các hợp chất hữu cơ) (Ta et al., 2014)

2.4.2 Các phương pháp đánh giá tính kháng kháng sinh – kháng sinh đồ 2.4.2.1 Phương pháp dịch pha loãng

Một trong những phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ sớm nhất là phương pháp dịch pha loãng Phương pháp này liên quan đến việc chuẩn bị dịch pha loãng của kháng sinh theo cấp độ nhị phân (ví dụ: 1, 2, 4, 8, và 16 mg/ml) trong môi trường chất lỏng phân phối trong ống nghiệm Các ống chứa kháng sinh được nhiễm dịch vi khuẩn 1-5x105 CFU/ml, tiến hành nuôi qua đêm ở 35°C, các ống đã được kiểm tra độ đục cho thấy sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nồng độ thấp nhất của kháng sinh mà tại đó vi khuẩn không phát triển được cho là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Độ chính xác của phương pháp này được coi là cộng hoặc trừ nồng độ đo 1 đến hai lần, do ảnh hưởng của kỹ thuật chuẩn bị độ pha loãng của các kháng sinh Ưu điểm của kỹ thuật này là đưa ra kết quả định lượng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Các nhược điểm chính của phương pháp là khả năng sai sót trong quá trình chuẩn bị dung dịch kháng sinh, các khả năng sai sót trong việc chuẩn bị kháng sinh, và số lượng tương đối lớn các kháng sinh và hóa chất tham gia trong thử nghiệm, và phải lựa chọn số lượng kháng sinh cứng nhắc khi sử dụng khay kháng sinh đã được thương mại bởi nhà sản xuất (Holmes et al., 2015)

Hình 2.2 Khay kháng sinh 2.4.2.2 Phương pháp cột khuếch tán kháng sinh

Các phương pháp cột khuếch tán kháng sinh sử dụng các nguyên tắc thành lập một cột nồng độ kháng sinh trong một môi trường để xác định tính nhạy cảm Các Etest (bioMe'rieux AB BIODISK) là một phiên bản thương mại có sẵn, sử dụng que thử nhựa mỏng được tẩm lên mặt dưới với một dãy nồng độ kháng sinh khô và được đánh dấu trên bề mặt phía trên Có đến 5 hoặc 6 dải có thể được đặt trên bề mặt của một thạch thích hợp (150-mm) đã được cấy vi sinh vật theo tiêu chuẩn hóa Sau khi ủ qua đêm, các kết quả được đọc bằng cách xem các dải từ đầu đĩa MIC được xác định bởi giao của phần dưới của hình elip (hình vùng ức chế sự tăng trưởng) với que thử Các phương pháp cột khuếch tán có tính linh hoạt để thử nghiệm các loại thuốc mà phòng thí nghiệm chọn Nói chung, kết quả Etest có sự tương quan tốt với phương pháp dịch pha loãng MIC hoặc các phương pháp pha loãng agar (Holmes et al., 2015)

Hình 2.3 Phương pháp cột khuếch tán kháng sinh – Etest

2.4.2.3 Phương pháp sử dụng khoanh giấy kháng sinh

Phương pháp sử dụng đĩa kháng sinh được thực hiện bằng cách trải dung dịch chủng có nồng độ 106-108 lên bề mặt thạch Mueller-Hinton Số lượng đĩa giấy kháng sinh được đặt trên bề mặt thạch cấy phụ thuộc vào kích thước đĩa và khả năng kháng của vi sinh vật đích Đĩa thạch chứa khoanh giấy kháng sinh được ủ trong 16-24 giờ ở 35°C trước khi đọc kết quả Các vùng ức chế sự phát triển xung quanh mỗi khoanh giấy kháng sinh được đo đến mm gần nhất Đường kính của vùng ức chế liên quan đến tính nhạy cảm và tính kháng của vi khuẩn đích Kết quả đo vùng ức chế sẽ được so sánh với các tiêu chuẩn công bố của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và thí nghiệm (CLSI, trước đây là Ủy ban Quốc gia Tiêu chuẩn lâm sàng trong phòng thí nghiệm hoặc NCCLS) hoặc theo hướng dẫn của FDA Các kết quả của đĩa cho biết vi khuẩn nhạy cảm, trung gian hoặc kháng với kháng sinh đang thử nghiệm Những lợi thế của phương pháp đĩa là sự đơn giản trong quá trình tiến hành kiểm tra mà không cần bất kỳ thiết bị đặc biệt nào, cung cấp kết quả phân loại dễ dàng giải thích bởi tất cả các biểu hiện (nhạy cảm, trung gian, kháng), và linh hoạt trong việc lựa chọn các đĩa kháng sinh để thử nghiệm (Holmes et al., 2015)

Hình 2.4 Phương pháp sử dụng khoanh giấy kháng sinh

2.4.2.4 Phương pháp sử dụng các thiết bị tự động

Phương pháp sử dụng các thiết bị đo đạc chuẩn hóa điểm đọc và thường đưa ra kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm trong một thời gian ngắn hơn so với các phương pháp đọc thông thường vì hệ thống phát hiện quang cho phép phát hiện những thay đổi tinh tế trong sự phát triển của vi khuẩn Có 4 thiết bị tự