(LUẬN văn THẠC sĩ) kiểm nghiệm một số chỉ tiêu của vacxin kyoto biken porcine parvovirus nhập từ nhật bản phòng bệnh rối loạn sinh sản do virus parvo gây ra trên lợn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ HUYỀN TRANG KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA VACXIN KYOTO BIKEN PORCINE PARVOVIRUS NHẬP TỪ NHẬT BẢN PHÒNG BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN DO VIRUS PARVO GÂY RA TR

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ HUYỀN TRANG

KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA VACXIN KYOTO BIKEN PORCINE PARVOVIRUS NHẬP TỪ NHẬT BẢN PHÒNG BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN

DO VIRUS PARVO GÂY RA TRÊN LỢN

Ngành: Thú y

Mã số : 60.64.01.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Trần Anh Đào

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu

được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy

bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn,

các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Đỗ Huyền Trang

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc PGS.TS Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1, công ty TNHH Kyoto Biken Hanoi Laboratories đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Đỗ Huyền Trang

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Bệnh rối loạn sinh sản do porcine parvovirus gây ra trên lợn 3

2.1.1 Lịch sử bệnh 3

2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PPV 4

2.2 Truyền nhiễm học 6

2.2.1 Đặc điểm của virus 6

2.2.2 Đặc điểm dịch tễ học 8

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh 8

2.2.4 Triệu chứng 9

2.2.5 Bệnh tích 11

2.2.6 Chẩn đoán 12

2.2.7 Miễn dịch chống PPV 14

2.2.8 Phòng và kiểm soát bệnh 15

2.3 Vacxin và vacxin phòng bệnh gây ra do PPV 16

2.3.1 Khái niệm về vacxin 16

2.3.2 Đặc tính cơ bản của vacxin 17

2.3.3 Phân loại vacxin 17

2.3.4 Nguyên lý sử dụng vacxin 19

2.3.5 Quy luật hình thành kháng thể sau khi sử dụng vacxin ở động vật 19

2.3.6 Vacxin phòng bệnh gây ra do PPV 19

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Địa điểm nghiên cứu 21

3.2 Thời gian nghiên cứu 21

3.3 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu 21

3.4 Nội dung nghiên cứu 21

3.5 Phương pháp nghiên cứu 21

3.5.1 Kiểm tra tính vô trùng của vacxin 21

3.5.2 Kiểm tra tính an toàn của vacxin 24

3.5.3 Kiểm tra hiệu lực của vacxin 25

3.5.4 Đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin 30

Phần 4 Kết quả và thảo luận 34

4.1 Kết quả kiểm tra tính vô trùng của vacxin 34

4.2 Kết quả kiểm tra tính an toàn của vacxin 37

4.2.1 Các triệu chứng lâm sàng của lợn và các phản ứng cục bộ tại vị trí tiêm trong 21 ngày sau khi tiêm vacxin 37

4.2.2 Thân nhiệt của lợn thí nghiệm trong 21 ngày sau khi tiêm vacxin 38

4.2.3 Theo dõi sự tăng trọng của lợn thí nghiệm trong 21 ngày sau khi tiêm vacxin 40

4.3 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin 41

4.4 Kết quả đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin 44

4.4.1 Kết quả kiểm tra đặc tính của vacxin trong thời gian bảo quản 45

4.4.2 Kết quả kiểm tra tính vô trùng của vacxin trong thời gian bảo quản 47

4.4.3 Kết quả kiểm tra tính an toàn của vacxin trong thời gian bảo quản 48

4.4.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trong thời gian bảo quản 53

4.4.5 Kết quả kiểm tra độ ổn định pH của vacxin trong thời gian bảo quản 55

4.4.6 Đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin 56

4.5 Đánh giá về vacxin kyoto biken porcine parvovirus 56

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 58

5.1 Kết luận 58

5.1.1 Kết quả kiểm nghiệm vacxin 58

5.1.2 Kết quả đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin 58

5.2 Kiến nghị 59

Tài liệu tham khảo 60

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

BPW Bulk Purified Water

CPE Cytopathic Pathogene Effect

DNA Deoxy Nucleic Acid

FBS Fetal Bovine Serum

HA Hemagglutination

HI Hemagglutination Inhibition

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase chain reaction

PPV Porcine Parvovirus

SCD Soybean Casein Digest

TCID 50 Tissue Culture Infective Dosage 50% TGC Thyoglycolate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra tính vô trùng của vacxin trên môi trường TGC 35

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra tính vô trùng của vacxin trên môi trường SCD 36

Bảng 4.3 Các triệu chứng lâm sàng của lợn và các phản ứng cục bộ tại vị trí tiêm trong vòng 21 ngày sau khi tiêm vacxin 38

Bảng 4.4 Bảng theo dõi nhiệt độ của lợn trong 21 ngày sau khi tiêm vacxin 39

Bảng 4.5 Tăng trọng của lợn trước khi tiêm vacxin và ngay sau quá trình thí nghiệm kết thúc 40

Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra kháng thể chống PPV trong huyết thanh của lợn trước khi tiêm vacxin 42

Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra kháng thể chống PPV trong huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 43

Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra đặc tính của vacxin trong thời gian bảo quản 46

Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra tính vô trùng của vacxin trong thời gian bảo quản 48

Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra tính an toàn của vacxin trong thời gian bảo quản trên chuột lang 49

Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra tính an toàn của vacxin trong thời gian bảo quản trên chuột nhắt trắng 50

Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra tính bất hoạt của vacxin trong thời gian bảo quản 52

Bảng 4.13 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trong thời gian bảo quản 54

Bảng 4.14 Kết quả kiểm tra độ ổn định pH của vacxin trong thời gian bảo quản 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc lớp vỏ capsid của PPV 7 Hình 1.2 Thai bị chết ở nhiều giai đoạn khác nhau 10 Hình 4.1 Diễn biến nhiệt độ cơ thể của lợn dùng trong thí nghiệm 39

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Đỗ Huyền Trang

Tên Luận văn: Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus nhập từ Nhật Bản phòng bệnh rối loạn sinh sản do virus Parvo gây ra trên lợn

- Đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin

Phương pháp nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu:

- Kiểm tra tính vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin

- Đánh giá thời hạn sử dụng của vacxin

Vật liệu nghiên cứu:

- Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus vô hoạt nhập từ Nhật Bản được sản xuất từ chủng 90HS-SK gây nhiễm trên tế bào SK-H tại công ty Kyoto Biken Laboratories Inc, Nhật Bản

- Động vật thí nghiệm: lợn ở độ tuổi 150 ngày, không có kháng thể chống Porcine Parvovirus

Phương pháp nghiên cứu:

- Phương pháp thực nghiệm khoa học

vị HI, đảm bảo hiệu lực bảo hộ cho con vật khỏi tác nhân gây bệnh

- Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus giữ được tính ổn định về đặc tính vật lý, đạt tiêu chuẩn về tính vô trùng trên các môi trường nuôi cấy Thioglycolat (TGC) và Soybean Casein Digest (SCD), an toàn khi tiêm cho động vật thí nghiệm là chuột lang và

chuột nhắt trắng, vacxin không có virus sống tồn tại, hiệu giá kháng thể trung bình đạt từ

80 – 160 đơn vị HI khi gây miễn dịch trên chuột lang, đạt hiệu quả bảo hộ cho con vật khỏi tác nhân gây bệnh và ổn định pH sau thời gian bảo quản 30 tháng ở nhiệt độ từ 2 –

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Huyen Trang Do

Thesis title: Testing some technical standards of Kyoto Biken Porcine Parvovirus vaccine imported from Japan to prevent reproductive failure disease caused by Porcine Parvovirus on pigs

Major: Veterinary Medicine Code: 60.64.01.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

- Testing some technical standards of Kyoto Biken Porcine Parvovirus vaccine produced in Japan: Sterility, safety and potency test

- Assessment of the shelf-life of vaccine

Materials and Methods

Research content:

- The sterility, safety and potency test of vaccine

- Evaluating the shelf-life of vaccine

Research material:

- Inactivated Kyoto Biken Porcine Parvovirus vaccine imported from Japan, were produced from 90HS-SK strain inoculated on SK-H cell in Kyoto Biken Laboratories Inc, Japan

- Experimental animal: 150 day old pigs, negative with antibody against Porcine Parvovirus

Research method:

- Method of scientific experimentation

- Method of observation

- Method of statistic, synthesis, comparison and data analysis

Main findings and conclusions

Main findings:

- Kyoto Biken Porcine Parvovirus vaccine was assessed to be sterilized on the Thioglycolate (TGC) and Soybean (SCD) medium, safe for target pigs designated for vaccination, antibody titer is from 80 to 160 units, ensuring to protect animals from PPV

- Kyoto Biken Porcine Parvovirus vaccine has stable characteristic, sterilized on the Thioglycolate (TGC) and Soybean Digest (SCD) medium, safety for experimental

animals, antibody titer is from 80 to 160 units with vaccination on guinea pigs and pH is stable after preservation at 2 – 8 o C and avoid direct sunlight

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chăn nuôi lợn ở Việt Nam đã có từ rất lâu đời và giữ một vị trí quan trọng trong hệ thống sản xuất nông nghiệp ở nước ta Theo thời gian, số lượng đàn lợn ngày càng tăng để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ của thị trường Theo số liệu điều tra của Tổng cục thống kê năm 2015, cả nước có khoảng 27,75 triệu con lợn, trong

đó có 4,06 triệu con lợn nái, sản lượng thịt lợn hơi xuất chuồng năm 2015 ước tính đạt 3,48 triệu tấn Trong những năm qua, ngành chăn nuôi lợn nước ta đã đạt được những thành tựu đáng kể nhưng cũng đang đứng trước nhiều thách thức lớn Một trong số đó là mối đe dọa nghiêm trọng từ các dịch bệnh phát sinh, gây

ra rủi ro rất lớn đến đầu tư phát triển chăn nuôi lợn, đặc biệt khi đàn lợn không được tiêm phòng nghiêm ngặt

Porcine Parvovirus (PPV) là một loại virus có mặt trong hầu hết mọi đàn lợn và đã gây ra những ảnh hưởng đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn Triệu chứng lâm sàng của lợn khi mắc bệnh đặc trưng bởi hiện tượng sảy thai, thai gỗ hoặc chết thai (Mengeling et al., 2000) và được mô tả bởi các chữ viết tắt là SMEDI (S: Stillbirth – thai lưu, M: Mummification – thai gỗ, ED: Embryonary Death – chết phôi và I: Infertility – Vô sinh) Virus có mặt ở hầu hết tất cả các đàn lợn trên thế giới và tác động lên lợn nái, gây rất nhiều thiệt hại cho các trại giống lợn sinh sản Bệnh tác động làm tăng tỷ lệ sảy thai, giảm số đầu lợn con sơ sinh lên tới 50- 60%/năm, giảm trọng lượng của lợn con lúc cai sữa, lợn nái chậm lên giống, tăng nguy cơ mang thai giả và tăng chi phí để khắc phục hậu quả do bệnh gây ra PPV có thể làm tăng các ảnh hưởng của virus PCV2 trong Hội chứng còi cọc sau cai sữa

Porcine Parvovirus là loại ADN virus, có kích thước rất nhỏ (20-22nm), không vỏ bọc, tồn tại lâu trong cơ thể lợn và bền vững cao với điều kiện môi trường bên ngoài, điều này làm cho việc kiểm soát mầm bệnh trở nên rất khó khăn Một trong những biện pháp phòng bệnh gây ra do Porcine Parvovirus một cách có hiệu quả là tiêm phòng vacxin

Hiện nay, trong nước mới chỉ có 2 xí nghiệp tự sản xuất được vacxin phòng bệnh gây ra do Porcine Parvovirus, các loại vacxin phòng Porcine Parvovirus khác hiện đang sử dụng ở nước ta chủ yếu được nhập khẩu từ nước

ngoài, đưa ra thị trường bởi các công ty và đại lý phân phối Mỗi loại vacxin khi nhập về Việt Nam đều phải trải qua quá trình kiểm nghiệm các chỉ tiêu kỹ thuật và khảo nghiệm trên thực địa trước khi đưa vào sử dụng và lưu hành Nhằm mục đích kiểm tra và đánh giá các chỉ tiêu kỹ thuật của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus sản xuất tại Nhật Bản, cung cấp những dữ liệu và thông tin cơ bản về vacxin, làm tiền đề cho việc khảo nghiệm vacxin trên thực địa và làm cơ sở khoa học cho việc nhập khẩu, phân phối vacxin ra thị trường Việt Nam, góp phần vào việc phòng chống bệnh do Parvovirus gây ra trên lợn, hạn chế những ảnh hưởng của bệnh đến hiệu quả chăn nuôi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus nhập từ Nhật Bản phòng bệnh rối loạn sinh sản do virus Parvo gây

ra trên lợn”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Đánh giá các chỉ tiêu kỹ thuật của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus

về tính vô trùng, an toàn, hiệu lực và thời hạn bảo quản

- Từ đó làm tiền đề cho việc tiến hành khảo nghiệm vacxin trên thực địa và làm cơ sở khoa học cho việc nhập khẩu, phân phối vacxin ra thị trường Việt Nam 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Kiểm nghiệm các chỉ tiêu kỹ thuật của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus bước đầu giúp cung cấp các thông tin cơ bản về chất lượng của vacxin, làm tiền đề cho việc tiến hành khảo nghiệm vacxin trên thực địa và đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của vacxin khi sử dụng tại Việt Nam

- Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus là

cơ sở khoa học cho việc nhập khẩu, phân phối vacxin ra thị trường Việt Nam, giúp người chăn nuôi có thêm sự lựa chọn vacxin để phòng bệnh gây ra do Porcine Parvovirus

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN DO PORCINE PARVOVIRUS GÂY RA TRÊN LỢN

Bệnh rối loạn sinh sản do Porcine Parvovirus (PPV) gây nên là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở lợn Đối với lợn nái, bệnh gây ra các biểu hiện lâm sàng điển hình như thai gỗ, thai lưu, tiêu thai, sẩy thai, lợn con đẻ ra yếu, chết ngay sau sinh hoặc còi cọc, chậm lớn

Ở những lợn khác như lợn đực giống, lợn vỗ béo, bệnh không gây nên các biểu hiện lâm sàng, con vật chỉ mang trùng và là nguồn gieo rắc mầm bệnh 2.1.1 Lịch sử bệnh

Báo cáo đầu tiên về Parvovirus là vào năm 1959 (Kilham and Olivier, 1959), Parvovirus được mô tả là căn nguyên gây bệnh ở chuột hamster, được gọi

là “hamsterosteolytic viruses” Vào những năm sau đó, Parvovirus được tìm thấy

ở hơn 5 loài vật chủ khác nhau ở một vài quốc gia trên thế giới (Hallauer and Kronauer, 1960; Burger et al., 1963; Hampton, 1964; Cartwright and Hulk, 1967; Rose et al., 1969) và kích thước, cấu trúc và đặc điểm sinh học của Parvovirus được xác định (Payne, 1964; Karasaki, 1966; Hoggan, 1971; Tinsley and Longworth, 1976)

Ban đầu, những virus này được xếp vào họ Picodnaviruses (Mayor and Melnick,1966), bởi vì hình thái và kích thước của chúng giống với Picodnaviruses Sau khi xác định được genome của virus chứa DNA sợi đơn thì tên Parvovirus được đề xuất (Andrews, 1970) và được chấp nhận bởi Ủy ban quốc tế về danh pháp của virus (ICNV) Hiện nay, Parvovirus được xếp vào họ Parvoviridae, được chia thành hai phân họ là Densovirinae và Parvovirinae Virus thuộc phân họ Densovirinae được chia làm các chi Brevidensovirus, Densovirus, Iteravirus và Pefudensovirus, chúng chủ yếu gây bệnh trên côn trùng Virus thuộc phân họ Parvovirus bao gồm chi Amdovirus, Bocavirus, Dependovirus, Erythrovirus và Parvovirus, chúng gây bệnh trên rất nhiều loài động vật khác nhau

Ở lợn, rối loạn sinh sản ở những đàn thương phẩm với nguyên nhân không

rõ ràng diễn ra rất phổ biến vào những năm 1960 Ở thời điểm đó, nguyên nhân được coi là do môi trường, dinh dưỡng, di truyền và độc tố (Lawson, 1961; Rasbech, 1969) Dấu hiệu đầu tiên của Porcine Parvovirus được phát hiện trên tế

bào sơ cấp và thứ cấp từ thận và tinh hoàn lợn được sử dụng trong nuôi cấy virus dịch tả lợn Quá trình nuôi cấy những tế bào này phát hiện tạp nhiễm các hạt nhỏ kích thước 22-23nm (Mayr and Mahnel, 1964) Dựa vào sự nhân lên của virus này trên các dòng tế bào có nguồn gốc từ lợn, có thể phân lập và phân loại chúng như là một Parvovirus (Siegl, 1976)

Sự xuất hiện của PPV trên lợn lần đầu tiên được mô tả bởi Cartwright và Huck năm 1967 liên quan tới các hiện tượng thai gỗ, thai chết lưu và sảy thai Những năm sau đó, PPV được xác định là tác nhân chính gây ra hội chứng SMEDI trên lợn (S: Stillbirth – thai lưu, M: Mummification – thai gỗ, ED: Embryonary Death – chết phôi và I: Infertility – Vô sinh) (Thompson and Prozesky, 1994) 2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PPV

2.1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Kể từ năm 1967, khi lần đầu tiên PPV được mô tả bởi Cartwright và Huck, cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về PPV Nhiều thành quả đã được ứng dụng và mang lại hiệu quả thiết thực cho công tác phòng và kiểm soát bệnh gây ra do PPV trên thế giới

Johnson (1973) đã tiến hành phân lập thành công Parvovirus trên lợn ở Queensland, Úc

Kim (1974) nghiên cứu về khả năng gây ngưng kết hồng cầu (phản ứng HA) của PPV và phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) của PPV Sau đó Joo, Donaldson-Wood and Johnson (1976b, 1976c) đã đưa ra phương pháp chẩn đoán nhanh giúp phát hiện PPV trên các xác bào thai và chuẩn hóa phương pháp

HI sử dụng cho định lượng hàm lượng kháng thể chống PPV

Mengeling and Cutlip (1976) đã tiến hành gây bệnh sinh sản thử nghiệm bằng cách cho lợn nái mang thai tiếp xúc với PPV Tiếp đó Lenghaus, Forman and Hale (1978), gây nhiễm thử nghiệm PPV cho bào thai lợn ở 35, 50 và 60 ngày tuổi Mengeling (1979), tiếp tục tiến hành nghiên cứu về tác động của PPV thông qua việc gây nhiễm cho lợn mẹ đang mang thai bằng cách cho tiếp xúc với PPV

ở ngày thứ 7 hoặc ngày thứ 14 của giai đoạn mang thai Từ những nghiên cứu này

đã giúp tìm ra những ảnh hưởng khác nhau của PPV đến bào thai lợn ở các giai đoạn khác nhau của thai kỳ

Mengeling, Cutlip and Barnett (1978) nghiên cứu về sinh bệnh học, tỷ lệ lưu hành và cách phòng bệnh gây ra do PPV Fujisaki (1978) nghiên cứu tỷ lệ

thai chết lưu gây ra bởi PPV và biện pháp kiểm soát bệnh này ở Nhật Bản Những nghiên cứu này cơ bản đã giúp tìm ra cơ chế gây bệnh của PPV trên lợn nái mang thai và bào thai ở các giai đoạn khác nhau của thời kỳ mang thai Đồng thời, các biện pháp giúp kiểm soát bệnh cũng được đưa ra, góp phần làm giảm tác động của bệnh đến hiệu quả chăn nuôi

Mengeling, Brown, Paul and Guntekunst (1979), tiến hành nghiên cứu hiệu quả của vacxin bất hoạt phòng bệnh rối loạn sinh sản gây ra do PPV Nối tiếp nghiên cứu đó, Mengeling, Paul, Gutekunst, Pirtle and Brown (1980b) đã đưa ra phương pháp tiêm chủng vacxin phòng bệnh cho lợn Những nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng trong việc phòng và kiểm soát hiệu quả bệnh rối loạn sinh sản gây ra do PPV

Hohdatsu, Baba, Ide, Tsuchimoto, Nagano, Yamagami, Yamagishi, Fujisaki, and Matumoto (1988), nghiên cứu chẩn đoán, phát hiện kháng thể PPV trong huyết thanh của lợn bằng phương pháp ELISA Phương pháp này đã được ứng dụng một cách hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh bệnh gây ra do PPV Bergeron, Menezes and Tijssen (1993) tiến hành giải mã bộ gen và lập bản

đồ cho các sản phẩm phiên mã và dịch mã của chủng NADL-2 Tiếp đó, Bergeron, Hérbert and Tijssen (1996) tiếp tục tiến hành giải mã bộ gen của chủng Kresse, xác định các đồng vị và so sánh với chủng NADL-2

Ngoài ra, có rất nhiều các công trình nghiên cứu khác về PPV đã được thực hiện và mang ý nghĩa khoa học rất lớn

2.1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Bệnh gây ra do PPV xảy ra phổ biến và được các nước trên thế giới quan tâm, nghiên cứu khá nhiều Tuy nhiên, ở Việt Nam, bệnh chưa thực sự được chú trọng và đầu tư nghiên cứu

Phạm Hùng (1999), đã tiến hành nghiên cứu về vai trò của PPV trong hội chứng rối loạn sinh sản của lợn ở một số tỉnh miền Trung Việt Nam và nghiên cứu chế vacxin phòng bệnh Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về bệnh rối loạn sinh sản trên lợn do PPV gây nên ở khu vực miền Trung Qua nghiên cứu này, tác giả đã xác định được tỷ lệ lợn bị rối loạn sinh sản, đánh giá được vai trò của PPV trong rối loạn sinh sản ở lợn tại một số tỉnh miền Trung, nghiên cứu chế tạo thành công vacxin PPV vô hoạt, sử dụng an toàn và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao trên lợn và xác định được thời điểm thích hợp để tiêm phòng vacxin cho lợn nái hậu bị cũng như lợn nái cơ bản

Trần Duy Khanh (2004), tiến hành nghiên cứu về hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn tại Thái Bình, xác định vai trò của PPV, một trong những nguyên nhân gây rối loạn sinh sản và thử nghiệm vacxin, đã xây dựng biện pháp phòng chống bệnh rối loạn sinh sản do PPV gây ra

Ngoài ra, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào về PPV ở Việt Nam

2.2 TRUYỀN NHIỄM HỌC

2.2.1 Đặc điểm của virus

PPV là loại virus chứa một sợi ADN, bộ gen gồm 5000 cặp gốc kiềm, có kích thước nhỏ PPV thuộc chi Parvovirus, họ Parvoviridae

2.2.1.1 Đặc điểm chung của họ Parvoviridae

Các virus thuộc họ Parvoviridae không có vỏ ngoài, capsid có dạng hình cầu đối xứng khối Virus có đường kính 18 – 22nm, cấu tạo từ 32 đơn vị capsome Virus có tính đề kháng rất cao, đề kháng với các dung môi hữu cơ, axit, kiềm (pH 3 – 9) Hầu hết các Parvovirus giữ được tính cảm nhiễm ngay cả sau hơn 1 giờ xử lý ở 56oC (Phạm Hồng Sơn, 2005)

Họ Parvoviridae bao gồm 3 chi: chi Parvovirus, chi Dependovirus và chi Densovirus Các virus thuộc chi Parvovirus là virus chứa DNA kích thước 5kb, sợi đơn âm, duỗi thẳng nhưng cũng có một số virion chứa DNA sợi đơn dương Ở các chi Dependovirus và chi Densovirus thì số lượng virion chứa DNA chuỗi âm và virion chứa DNA chuỗi dương gần như tương đương nhau Chi Parvovirus và Dependovirus có 3 loại protein cấu trúc, chi Densovirus có 4 loại protein cấu trúc Capsid được lắp ráp và thành thục ở trong nhân tế bào Sự phát triển của các virus thuộc chi Parvovirus phụ thuộc vào cơ năng tế bào ở kỳ S của chu kỳ phân bào của tế bào ký chủ, do đó phát triển tốt trong các tế bào liên lục phân bào nhanh chóng Trong sự phát triển của chi Dependovirus cần phải có sự cảm nhiễm đồng thời của virus trợ giúp (helper virus) là Adenovirus hoặc Herpesvirus (tác động tương bổ) (Phạm Hồng Sơn, 2005)

Chi Parvovirus có virus vi tiểu của chuột (MVM: Minute virus of mice) là loài quy chuẩn, khi không có mặt của virus trợ giúp cũng có thể phát triển nên còn được gọi là "Parvovirus tự chủ" (Autonomous Parvovirus) Đây là nhóm virus có tính đặc hiệu ký chủ tương đối cao Mặc dù không thấy protein cấu trúc

có sự giao chéo kháng nguyên nhưng đã xác nhận được có 2 - 3 protein phi cấu trúc của virus có tính kháng nguyên giao chéo Chúng hình thành các thể bao hàm trong nhân tế bào cảm nhiễm (Phạm Hồng Sơn, 2005)

Chi Dependovirus thường thấy cùng với Adenovirus nên thường được gọi là

"Virus tùy Adeno" (Adeno-associated Virus - AAV) Chữ "depend" có nguồn gốc từ từ Latin "dependere" nghĩa là tùy thuộc, phụ thuộc Trong trường hợp không có mặt của các virus trợ giúp thì chúng là các virus khuyết tổn (defective virus) Ngược lại, sự phát triển của virus tùy adeno (AVV) ức chế sự phát triển của các virus trợ giúp (helper virus) (Phạm Hồng Sơn, 2005)

Chi Densovirus là nhóm virus phát triển tự lập ở trong cơ thể ấu trùng, nhộng

và thành trùng của côn trùng "Denso" là chữ bắt nguồn từ từ Latin "densus" là

"dày đặc" hàm ý kết quả của sự cảm nhiễm virus rằng trong nhân tế bào cảm nhiễm hình thành các khối rắn do các virion tụ tập lại (Phạm Hồng Sơn, 2005) 2.2.1.2 Đặc điểm của PPV

PPV là một “Virus tự chủ” (Autonomous virus), nó không cần đến các virus trợ giúp để nhân lên PPV virion có kích thước khoảng 28nm và bao gồm 60 bản sao của Protein cấu trúc VP1/VP2, khoảng 90% trong số đó là phân tử VP2 và 10% là VP1 Cấu trúc của lớp vỏ capsid đặc trưng bởi cấu trúc đối xứng khối 20 mặt (Sympson et al., 2002)

Hình 2.1 Cấu trúc lớp vỏ capsid của PPV

A Mô tả bề mặt lớp vỏ capsid

B Cấu trúc 3D của Protein VP2

Hệ gen của PPV là DNA sợi đơn, kích thước phân tử khoảng 5000 bazơ Hệ gen của virus mã hóa cho 4 loại protein Hai loại protein phi cấu trúc NS1 và NS2 có vai trò trong quá trình nhân lên của virus, cụ thể là trong quá trình sao chép DNA Hai loại protein cấu trúc VP1 và VP2 được phiên mã và dịch mã từ

hệ gen của virus Protein nhỏ hơn VP2 được tạo ra bởi sự ghép nối từ cùng bản mẫu RNA giống như Protein lớn hơn VP1

PPV có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài động vật trong đó bao gồm chuột cống, khỉ, gà, chuột lang và người (nhóm máu O) (Siegl, 1976)

Virus có thể nuôi cấy trên một vài dòng tế bào nguồn gốc từ lợn như PK5, SPEV, tế bào tinh hoàn lợn và một số tế bào khác gây ra hiện tượng bệnh tích tế bào PPV có sức đề kháng cao với một số loại hóa chất khử trùng như cồn 70%, các hóa chất amoni bậc bốn (0.05%), Javen nồng độ thấp (2500ppm) và axit peracetic (0.2%) nhưng dễ dàng bị bất hoạt bởi hợp chất aldehyde, Javen ở nồng

độ cao hơn (25000ppm) và nước oxi già 7.5% (Hydrogen peroxide) PPV tương đối bền vững với nhiệt và có thể tồn tại ở điều kiện nhiệt khô 90oC (194oF) (Eterpi et al., 2009)

Dịch tễ học của PPV biểu hiện chủ yếu bởi sự bền vững của virus bên ngoài môi trường PPV có khả năng tồn tại và gây bệnh trong nhiều tháng, chúng nhiễm vào các dụng cụ chăn nuôi hoặc chuồng nuôi và trở thành nguồn bệnh Virus có thể nhiễm vào quần áo của người chăn nuôi và làm lây truyền bệnh từ đàn này sang đàn khác Cũng có những ý kiến cho rằng loài gặm nhấm có thể là nhân tố làm lan truyền virus sang những đàn mới (Truyen and Streck, 2012) Virus lan truyền trong một đàn lợn qua phân và các chất bài tiết khác từ những con lợn bị mắc bệnh Sự xuất hiện của PPV không phải lúc nào cũng gây

ra các triệu chứng lâm sàng Nếu lợn nái được tiêm vacxin định kỳ hoặc có miễn dịch tự nhiên, con vật nhiễm virus có thể không có triệu chứng lâm sàng (Truyen and Streck, 2012)

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh

Cơ chế sinh bệnh của PPV phản ánh khả năng virus có thể xâm nhập vào bào thai (Mengeling et al., 2000) Tuy nhiên, PPV thực sự đã đi qua hàng rào

nhau thai của lợn như thế nào thì vẫn chưa được giải thích một cách rõ ràng Cũng giống như các virus khác, PPV có thể tấn công đến bào thai bằng ba con đường: theo dịch thể của cơ thể như máu hoặc lympho, được nhân lên dần qua các lớp tế bào nhau thai, hoặc nhân lên trong tế bào như đại thực bào hoặc tế bào lympho (Mengeling et al., 2000)

Sau quá trình sao chép ở các mô lympho, PPV được phát tán một cách có

hệ thống thông qua hệ tuần hoàn (Brown et al., 1980, Paul et al., 1980) Tuy nhiên, biểu mô nhau thai lợn được cấu tạo từ 6 lớp mô và nó hoàn toàn có thể ngăn cản sự lưu thông máu giữa mẹ và bào thai, và những tế bào nhau thai được liên kết chặt chẽ tới mức không cho những phân tử dù rất nhỏ đi qua, ví như kháng thể Những tế bào nhau thai không dễ dàng bị xâm nhập bởi PPV,

và PPV cũng không được phát hiện trong các mô nhau thai, vì thế không có khả năng xảy ra hiện tượng virus có thể đi qua hàng rào nhau thai để nhân lên (Mengeling et al., 1978) Do vậy, nhiều khả năng nhất là virus đã tấn công vào bào thai thông qua các tế bào miễn dịch Những nghiên cứu đã cho biết rằng virus có mặt ở cả các mô lympho của lợn (Lucas et al., 1974, Mengeling

et al., 2000) và các tế bào bạch cầu trong hệ tuần hoàn của lợn nái mang thai (Rudek and Kwiatkowska, 1983)

Ở trong bào thai, PPV gặp được môi trường thuận lợi để nhân lên bởi chỉ số phân bào của hầu hết các mô của bào thai đang phát triển là rất lớn Virus có thể được phát hiện ở rất nhiều mô và cơ quan, điều này cho thấy không có mô nào đặc hiệu với tác động của virus (Wilhelm et al., 2005)

Virus xâm nhập vào tế bào thông qua một chuỗi các tương tác và giải phóng vật liệu di truyền vào khoang tế bào và ở đó, sự nhân lên của virus có thể được diễn ra (Harbison et al., 2008) Cơ chế xâm nhập của virus vào tế bào chưa được giải thích một cách rõ ràng Sau khi vào đến nhân tế bào, PPV nhân lên nhờ

cơ chế sao chép của tế bào chủ Virus nhân lên trong tế bào ở pha S, sử dụng DNA polymerase của tế bào để sao chép DNA của chúng Điều này giải thích yêu cầu tế bào phải có chỉ số nhân lên cao hơn (Rhode, 1973)

Về các biểu hiện cận lâm sàng, hiện tượng giảm bạch cầu ở mức độ vừa phải và tạm thời, không phụ thuộc vào giới tính hay lứa tuổi lợn có thể được quan sát thấy ở giai đoạn giữa ngày thứ 5 và ngày thứ 10 sau lần nhiễm virus đầu tiên (Joo et al., 1976b, Mengling and Cutlip, 1976; Zeeuw et al., 2007) Báo cáo

về việc xác định được PPV ở trong phân của lợn bị tiêu chảy cũng được công bố Tuy nhiên, liệu rằng virus có nhân lên ở biểu mô ruột và từ đó gây nên các bệnh đường ruột ở lợn giống như ở các động vật khác bị nhiễm parvovirus hay không còn chưa được khẳng định chắc chắn (Dea et al., 1985; Yasahura et al., 1989) Đối với lợn cái, những di chứng bệnh lý gây ra bởi PPV liên quan chủ yếu đến giai đoạn mang thai, là giai đoạn xảy ra sự nhiễm bệnh Ở giai đoạn đầu của thời kỳ mang thai (dưới 6 ngày), phôi thai được bảo vệ bởi lớp màng trong suốt

và vì thế có khả năng chống lại sự xâm nhập của virus Trong suốt thời kỳ phôi thai (12 – 35 ngày), kết quả của việc nhiễm PPV là phôi chết và bị tái hấp thu Từ ngày thứ 35 của thời kỳ mang thai là thời điểm bắt đầu quá trình hình thành xương, kết quả của việc nhiễm PPV là chết thai và sau đó là khô thai Cuối cùng,

kể từ ngày thứ 70 của thời kỳ mang thai, bào thai đã có khả năng sản sinh miễn dịch, có thể chống lại sự xâm nhập của virus và lợn con khi sinh ra sẽ có kháng thể chống PPV (Joo et al., 1976a; Lenghaus et al., 1978)

Hậu quả của nhiễm PPV quan sát ở các thời điểm khác nhau của thời kỳ mang thai (Phỏng theo Mengeling et al., 2000)

Hình 2.2 Thai bị chết ở nhiều giai đoạn khác nhau

2.2.5 Bệnh tích

Gây nhiễm thử nghiệm PPV trên lợn đực, lợn hậu bị và lợn nái không gây nên những bệnh tích điển hình (Lenghaus et al., 1978) Dấu hiệu chết phôi kèm theo sự tái hấp thu chất lỏng và mô mềm là hậu quả chung nhất khi bị nhiễm PPV Những bệnh tích rõ ràng ở bào thai bao gồm các mức độ còi cọc khác nhau của bào thai Thỉnh thoảng xuất hiện dấu hiệu các mạch máu nổi lên trên bề mặt của cơ thể do sung huyết và rò rỉ máu vào các mô liên kết Sung huyết, phù nề, xuất huyết cùng với sự tích tụ dịch não tủy ở bên trong các xoang của cơ thể, màu sắc của bào thai dần thay đổi, trở nên tối hơn sau khi chết và bị mất nước (thai khô) là những bệnh tích điển hình khi nhiễm PPV Nhau thai có thể bị mất nước và có màu nâu xám, lượng dịch ối bị giảm (Joo et al., 1977; Lenghaus et al., 1978) Sau khi bào thai trở nên có khả năng miễn dịch, không có biến đổi đại thể nào được quan sát thấy

Bệnh tích đại thể đã được quan sát thấy ở trong các mô của lợn nái sau khi các bào thai của chúng được gây nhiễm bởi virus Những lợn nái âm tính với PPV được gây nhiễm ở thời điểm 70 ngày của giai đoạn mang thai và được mổ khám sau 12 và 21 ngày sau khi gây nhiễm cho thấy sự tích tụ của các tế bào đơn nhân ở nội mạc tử cung và các lớp sâu hơn của mô liên kết Cũng tìm thấy sự tập trung thành dải của các tương bào, các tế bào lympho ở não, tủy sống và màng mống mắt Khi bào thai được gây nhiễm vào thời điểm sớm hơn trong giai đoạn mang thai (35, 50 và 60 ngày) và lợn mẹ được tiến hành mổ khám sau khi gây nhiễm 7 và 11 ngày, bệnh tích cũng biểu hiện tương tự Tuy nhiên, khi đó bệnh tích ở tử cung biểu hiện nghiêm trọng hơn và dải tế bào đơn nhân xung quanh cổ

tử cung và nội mạc tử cung cũng rộng hơn (Lenghaus et al., 1978) Sự tập trung của các tế bào lympho ở bên trong tử cung của những con lợn dương tính với PPV chỉ được tìm thấy khi các bào thai của chúng bị nhiễm PPV (Mengeling and Cutlip, 1976)

Sự thay đổi mô bệnh học ở bào thai có xu hướng lan rộng và bệnh tích vi thể chủ yếu là sự hoại tử của các tế bào trong các hệ cơ quan tổ chức đang phát triển (Joo et al., 1977; Lenghaus et al., 1978) Sự xuất huyết được quan sát thấy ở các mô dưới da và khối cơ Sự hoại tử và khoáng hóa là những dấu hiệu thường thấy

ở phổi, thận, cơ xương và đặc biệt là ở gan và tim (Lenghaus et al., 1978) Sau khi bào thai trở nên có miễn dịch, bệnh tích vi thể là sự phì đại nội mạc tử cung và sự xâm nhập của các tế bào đơn nhân (Joo et al., 1977)

Hiện tượng viêm màng não đặc trưng bởi các dải mạch máu cùng với sự tăng sinh của lớp tế bào bên ngoài thành mạch, tế bào đại thực bào và một vài tương bào ở chất xám và chất trắng của não, ở màng não cũng được quan sát thấy

ở những bào thai bị nhiễm PPV ở giai đoạn muộn của thời kỳ mang thai và còn sống hoặc ở những lợn con sơ sinh (Joo et al., 1977)

PPV cũng liên quan đến bệnh viêm cơ tim không kết hợp ở lợn con, đặc trưng bởi sự thâm nhiễm các tế bào đơn nhân và xuất huyết mức độ từ nhẹ đến trung bình giữa các tế bào cơ tim (Bolt et al., 1997)

Ở lợn đực giống, gây nhiễm thử nghiệm vào bên trong dịch hoàn dẫn đến

sự thoái hóa cấp tính biểu mô dịch hoàn cùng với sự hình thành và bong tróc các

tế bào đa nhân Bệnh tích vi thể không được quan sát thấy sau khi gây nhiêm vào bên trong lớp cơ (Thacker et al., 1987)

2.2.6 Chẩn đoán

Khi xuất hiện một trong những triệu chứng như: sảy thai kết hợp với hiện tượng thai khô, vô sinh, thai chết lưu, lợn con sinh ra yếu, số con sơ sinh thấp thì nên tiến hành điều tra về khả năng nhiễm virus PPV Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh: giả dại (Aujeszky), sảy thai truyền nhiễm (Brucellosis), lợn nghệ (Leptospirosis), PRRS, nhiễm ký sinh trùng và nhiễm khuẩn ở tử cung

Bệnh phẩm dùng để chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm là xác bào thai Theo cách truyền thống, việc phát hiện và chuẩn độ hiệu giá virus có thể được thực hiện bằng phản ứng HA, dựa vào khả năng ngưng kết hồng cầu các loài động vật như: gà, người, chuột lang của PPV (Joo et al., 1976b)

Virus có khả năng nhân lên một cách hiệu quả trên tế bào thận và tinh hoàn lợn Virus thường được nuôi cấy trên các dòng tế bào như ESK (Embryonic swine kidney – tế bào thận lợn phôi thai), PK-15 (pig kidney – tế bào thận lợn), SK6 (Swine kidney - tế bào thận lợn), STE (Swine testicular epitheloid – tế bào biểu mô tinh hoàn lợn) và SPEV (Swine embrio kidney – tế bào thận lợn bào thai) Sự nhân lên của PPV trên các dòng tế bào này thường gây ra hiện tượng bệnh tích tế bào và dẫn đến tế bào bị chết (Cartwright et al., 1969; Mengeling, 1972) Do hiện tượng bệnh tích tế bào gây ra bởi các loại virus khác có thể giống với PPV hoặc do tác động của enzyme nên việc phân lập virus dựa vào kính hiển

vi huỳnh quang (Cartwright et al., 1971; Johnson 1973; Mengeling et al., 1978) Gần đây, các kỹ thuật dựa vào axit nuclecic có thể được sử dụng để phát hiện virus trong các mẫu lâm sàng với độ nhạy cao hơn Kỹ thuật PCR là một

phương pháp hiệu quả để chẩn đoán bệnh qua các mô của bào thai Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với phản ứng HA (Soars et al., 1999) Ngoài ra, còn có thể sử dụng phương pháp real-time PCR để phát hiện DNA của virus và định lượng virus

Huyết thanh được lấy từ lợn hậu bị và lợn nái có thể được kiểm tra tại thời điểm xảy ra hiện tượng rối loạn sinh sản, và lần lấy mẫu thứ hai được tiến hành sau 2-4 tuần Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) được sử dụng như một phương pháp tiêu chuẩn để định lượng hàm lượng kháng thể đặc hiệu chống PPV Huyết thanh sử dụng cho HI cần được xử lý trước khi thực hiện phản ứng bằng cách bất hoạt nhiệt, sau đó hấp phụ Kaolin (Morimoto et al., 1972)

Một kỹ thuật khác là ELISA có thể được sử dụng một cách dễ dàng và tự động Với phương pháp này, huyết thanh không cần phải xử lý trước khi thực hiện (Westenbrink et al., 1989) ELISA có khả năng phân biệt những động vật được tiêm vacxin với những động vật đã từng bị nhiễm PPV vì những vacxin bất hoạt hiện tại được sử dụng để phòng bệnh gây ra do PPV sinh ra kháng thể chống lại PPV VP proteins mà không chống lại NS proteins, ELISA có thể phân biệt hai loại proteins này (Madsen et al., 1997)

Chẩn đoán phân biệt bệnh do Parvovirus với các bệnh:

- Bệnh sảy thai truyền nhiễm: Bệnh gây nên hiện tượng sảy thai đồng loạt vào giữa tháng thứ ba và thứ tư trong thời kỳ chửa Sau khi sảy thai luôn kèm theo hiện tượng lưu nhau thai, viêm tử cung, viêm khớp Lợn đực bị nhiễm Brucella luôn bị viêm khớp, viêm tinh hoàn và túi chứa tinh trùng

- Bệnh lợn nghệ: Các biểu hiện của bào thai trong suốt thời gian chửa giống như bệnh do Parvovirus nhưng bệnh lợn nghệ được quan sát thấy ở các lợn với các lứa tuổi khác nhau trong cùng ô chuồng với các biểu hiện vàng da, vàng mắt, đái ra máu, nước tiểu màu nâu, sốt ngắt quãng, có dử mắt, táo bón xen kẽ tiêu chảy

- Bệnh giả dại: Bệnh cũng có các biểu hiện chết thai, sảy thai hoặc con non chết sau khi đẻ ra Nhưng lợn con sinh ra bị bệnh giả dại luôn có các biểu hiện thần kinh, hai chân đạp bơi trong không khí Mổ khám lợn sơ sinh thấy xuất huyết lấm tấm ở gan, thận và não Xét nghiệm não thấy hạt virion virus

Ở lợn vỗ béo, lợn lớn, con vật xuất hiện các triệu chứng viêm phổi kèm theo bọt, dãi hoặc mủ, …

- Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp: Ngoài hiện tượng sảy thai, đẻ chậm, đẻ ra những thai chết lưu hoặc chết non …, những lợn sơ sinh luôn kèm theo viêm phổi và tiêu chảy, rìa tai xanh tím Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi và các biểu hiện lâm sàng xuất hiện ở ba hệ cơ quan: sinh sản, hô hấp và tiêu hóa Bệnh xảy ra không phụ thuộc vào giới tính của lợn, không phụ thuộc hình thức chăn nuôi và thời tiết Ở lợn lớn bao giờ cũng xuất hiện hiện tượng ban đỏ, viêm phổi nặng, mắt phù nề, thâm quầng

2.2.7 Miễn dịch chống PPV

Sự bảo vệ đầu tiên của lợn con giúp chống lại PPV chính là kháng thể có trong sữa mẹ mà lợn con sử dụng trong những ngày đầu tiên được sinh ra Lợn con bắt đầu phải tự sản xuất kháng thể kể từ tuần thứ hai, trong khi đó hàm lượng kháng thể trong sữa của mẹ ngày càng giảm dần và kháng thể trong sữa

mẹ vẫn còn cho đến tháng thứ 4 – 6 (Johnson et al., 1976) Nếu con vật được tiêm vacxin trong khi hàm lượng kháng thể trong sữa của mẹ cao thì những kháng thể này có thể gây trở ngại cho vacxin phát huy tác dụng của nó Mặt khác, nếu hàm lượng kháng thể trong sữa mẹ giảm một cách nhanh chóng thì con vật sẽ không được bảo vệ trong một vài tuần cho tới khi tiêm vacxin Vì thế, thời điểm tiêm vacxin mũi đầu tiên cho con vật là rất quan trọng quyết định hiệu quả của việc tiêm vacxin

Hàm lượng kháng thể tăng khi tiêm vacxin và hàm lượng kháng thể tăng do

sự tiếp xúc với nguyên nhân gây bệnh một cách tự nhiên có sự khác nhau rõ rệt Bằng thử nghiệm HI, hiệu giá kháng thể do tiêm vacxin thường thấp hơn 1:512 (Oravainen et al., 2005), trong khi hiệu giá kháng thể sau khi con vật tiếp xúc với mầm bệnh bên ngoài tự nhiên có thể thường xuyên vượt quá 1:2000 (van Leengoed et al., 1983) Thông thường, con vật sẽ sản sinh kháng thể sau 6 – 9 ngày kể từ ngày tiêm vacxin và hàm lượng kháng thể đạt cao nhất trong khoảng

từ ngày 14 đến ngày 21 (Johnson and Colling, 1969; Cartwright et al., 1971) Hiệu giá kháng thể có thể vẫn còn cao ở lợn nái trong vòng 4 năm sau khi nhiễm bệnh tự nhiên (Johnson et al., 1976) Tuy nhiên, có ý kiến cho rằng việc nhiễm PPV một cách thầm lặng có thể là nguyên nhân khiến kháng thể vẫn tồn tại một cách lâu dài (Szelei et al., 2006)

Việc sử dụng vacxin bất hoạt chống lại PPV đã giúp làm giảm các vấn đề

về sinh sản liên quan đến PPV ở trong đàn Vì vacxin bất hoạt giúp sản sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể chủ yếu nên người ta cho rằng sự bảo hộ khỏi tác động

của PPV là do kháng thể Miễn dịch tế bào cũng đã được mô tả, miễn dịch này chủ yếu dựa vào Lympho T gây độc tế bào (CTL) Ở một số thử nghiệm gây nhiễm trên những con vật chưa từng tiếp xúc với PPV và không có kháng thể chống PPV, đáp ứng CTL yếu khi con vật chỉ được gây nhiễm một lần Điều này cho thấy kết quả của đáp ứng miễn dịch dịch thể nhanh là đã làm tiêu diệt yếu tố gây bệnh trước khi CTL được kích hoạt Tuy nhiên, đáp ứng CTL thể hiện rõ rệt trong lần gây nhiễm thứ hai, điều này cho thấy rằng các CTL có thể đóng một vài trò quan trọng trong việc kiểm soát tái nhiễm PPV (Laderkjaer-Mikkelsen and Nielsen, 2002)

2.2.8 Phòng và kiểm soát bệnh

Hiện nay, chưa có thuốc điều trị đặc hiệu chống PPV Thêm vào đó, sự lan truyền rộng rãi và tính đề kháng mạnh của virus dẫn đến việc kiểm soát bệnh do PPV rất khó khăn Thực hiện chăn nuôi an toàn sinh học và các biện pháp vệ sinh cho đàn vật nuôi là yếu tố quan trọng hàng đầu để giảm thiểu sự lây nhiễm bệnh Tuy nhiên, biện pháp hiệu quả nhất để phòng bệnh đó là tiêm phòng vacxin đinh

kỳ cho con giống (Truyen và Streck, 2012)

Trước khi vacxin được sử dụng phổ biến rộng rãi trên thế giới, kỹ thuật

“feed-back” được sử dụng thường xuyên trong các đàn vật nuôi Kỹ thuật này dựa trên việc gây nhiễm cho con hậu bị trước khoảng 1 tháng trước khi thụ tinh Miễn dịch được thực hiện thông qua việc tiếp xúc trực tiếp của lợn nái với phân

và những bào thai bị chết do bệnh (Truyen and Streck, 2012) Kỹ thuật này giúp con vật có miễn dịch với hiệu giá kháng thể cao nhưng vì virus không được loại

bỏ hoặc giảm đi nên nguy cơ xảy ra dịch luôn luôn hiện diện

Vacxin phòng bệnh lần đầu tiên được phát triển thử nghiệm là vào cuối những năm 1970 (Joo and Johnson, 1977; Mengeling et al., 1979) Một vài năm sau đó, việc sử dụng vacxin định kỳ để phòng bệnh cho lợn nái với loại vacxin bất hoạt trở nên phổ biến trên thế giới Hiện nay, vacxin PPV được sản xuất trên tế bào đã được gây nhiễm virus, bất hoạt bằng hóa chất (như formalin, beta-propiolactone hoặc binary ethyleneimine), kết hợp với các chất

bổ trợ như dầu hoặc hydroxit nhôm và được dùng qua đường tiêu hóa (Truyen and Streck, 2012) Việc sử dụng những vacxin này giúp sinh ra kháng thể làm giảm thiểu các biểu hiện lâm sàng nhưng không thể ngăn chặn yếu tố gây bệnh Lịch sử dụng vacxin có thể được điều chỉnh theo từng đối tượng vật nuôi Lợn hậu bị sử dụng liều đầu tiên ở độ tuổi khoảng 170 – 180 ngày hoặc

30 ngày trước khi thụ tinh Liều thứ hai sử dụng sau liều đầu tiên 15 ngày Lợn nái sử dụng sau mỗi lứa đẻ từ 10 – 15 ngày Lợn đực giống có thể sử dụng với lịch tương tự và nhắc lại hàng năm

Vacxin sống giảm độc lực (MLV) có thể là một biện pháp thay thế sử dụng

để phòng bệnh gây ra do PPV Báo cáo về loại vacxin giảm độc lực chống PPV

sử dụng chủng virus NADL2 được thực hiện trong những năm 1980 (Paul and Mengeling, 1984) Khi tiến hành gây nhiễm thử nghiệm cho lợn nái đang mang thai với chủng 143a, IDT, NADL2 và Stendal (chủng được coi như là có độc lực thấp) thì kết quả cho thấy những virus này không lây truyền vào bào thai Thêm vào đó, những chủng này gây ra một đáp ứng miễn dịch dịch thể rất mạnh (Zeeuw et al., 2007)

2.3 VACXIN VÀ VACXIN PHÒNG BỆNH GÂY RA DO PPV

2.3.1 Khái niệm về vacxin

Theo quan điểm trước đây, vacxin là một chế phẩm sinh học trong đó chứa chính mầm bệnh hoặc kháng nguyên của mầm bệnh gây ra một bệnh truyền nhiễm nào đó cần phòng (nếu là mầm bệnh thì phải được giết chết hoặc làm nhược độc bởi các yếu tố vật lý, hóa học và sinh vật học) Khi sử dụng cho động vật, vacxin tạo ra một đáp ứng miễn dịch chủ động giúp động vật chống lại được

sự xâm nhiễm của mầm bệnh tương ứng) Ngày nay, vacxin không chỉ còn là chế phẩm từ vi sinh vật hoặc ký sinh trùng được dùng để phòng bệnh mà còn được làm từ các vật liệu sinh học khác (không vi sinh vật) và được dùng với mục đích không phòng bệnh Nhưng dù là vacxin được chế tạo từ vật liệu nào

và được dùng với mục đích gì thì thành phần bắt buộc phải có trong vacxin là kháng nguyên và khi đưa vào cơ thể động vật, kháng nguyên sẽ gây ra đáp ứng miễn dịch Như vậy, hiện nay vacxin được hiểu với khái niệm rộng hơn: Vacxin

là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên có thể tạo cho cơ thể một đáp ứng miễn dịch và được dùng với mục địch phòng bệnh hoặc mục đích khác (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

Vacxin tạo ra trong cơ thể sống một đáp ứng miễn dịch Hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, sinh ra kháng thể dịch thể đặc hiệu hoặc kháng thể tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố gây bệnh, cơ thể sử dụng vacxin xuất hiện trạng thái miễn dịch thu được chủ động nhân tạo và có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của yếu tố gây bệnh tương ứng

2.3.2 Đặc tính cơ bản của vacxin

Vacxin phải đảm bảo 4 đặc tính cơ bản là: Tính sinh miễn dịch (tính mẫn cảm), tính kháng nguyên (tính sinh kháng thể), tính hiệu lực và tính an toàn (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

Tính sinh miễn dịch hay tính mẫn cảm: Là khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể hoặc tế bào hoặc cả hai

Tính kháng nguyên hay tính sinh kháng thể: Một vacxin khi đưa vào cơ thể phải có khả năng kích thích cơ thể sinh ra kháng thể

Tính hiệu lực: Tính hiệu lực nói lên khả năng bảo hộ động vật sau khi được

sử dụng vacxin

Tính an toàn: Là một đặc tính quan trọng Vacxin sau khi sản xuất phải được kiểm định chặt chẽ về mặt vô trùng, thuần khiết, vô độc

2.3.3 Phân loại vacxin

Có thể chia vacxin làm 4 loại: Vacxin chết (Vô hoạt); Vacxin sống; Vacxin dưới đơn vị; Vacxin thế hệ mới sản xuất bằng công nghệ gen (Nguyễn Bá Hiên

và Trần Thị Lan Hương, 2010)

2.3.3.1 Vacxin chết

Là loại vacxin được chế từ các yếu tố gây bệnh (virus hoặc vi khuẩn) đã được làm chết bằng các phương pháp hóa học hoặc vật lý nhưng vẫn giữ được tính mẫn cảm và tính kháng nguyên

Vacxin chết có ưu điểm: Không độc, không gây ô nhiễm môi trường, tính

an toàn cao, dễ bảo quản

Nhược điểm của loại vacxin này là: Thời gian duy trì miễn dịch ngắn do lượng kháng nguyên cố định và ít dần chứ không nhân lên được như vacxin sống; Liều lượng tiêm lớn, do đó khó tiêm và dễ gây áp xe; Miễn dịch xuất hiện chậm, gây miễn dịch tế bào kém; Không dùng để can thiệp trực tiếp vào ổ dịch; Phải đưa vacxin nhiều lần làm tăng nguy cơ dị ứng

2.3.3.2 Vacxin sống

Là loại vacxin được sản xuất nhờ chủng vi sinh vật còn sống, hầu như không có tính gây bệnh cho động vật được tiêm phòng nhưng có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh, chúng nhân lên trong cơ thể vật chủ và tiếp tục tạo ra

sự kích thích của kháng nguyên trong một khoảng thời gian

Vacxin sống bao gồm: Vacxin nguyên độc, vacxin vô độc và vacxin nhược độc

Vacxin nguyên độc: Dùng chủng virus nguyên độc có quan hệ từ các loài động vật khác Đưa vào cơ thể virus có độc lực hoặc đã làm giảm một phần độc lực theo con đường thực nghiệm (không giống sự xâm nhập của chúng trong tự nhiên)

Vacxin vô độc (Vacxin nhược độc tự nhiên): Được sản xuất từ những chủng

vi sinh vật vô độc phân lập trong tự nhiên

Vacxin nhược độc hóa: Được sản xuất từ những chủng vi sinh vật sống có độc lực yếu, không có khả năng gây bệnh cho động vật được tiêm chủng Các chủng vi sinh vật này được làm giảm độc lực bằng các phương pháp: vật lý, hóa học, sinh vật học và công nghệ gen

Vacxin sống có ưu điểm: Tạo miễn dịch nhanh, mạnh, miễn dịch tồn tại lâu bền do vi sinh vật vẫn có khả năng nhân lên và tồn tại lâu trong cơ thể được tiêm chủng; Tạo miễn dịch tế bào cao hơn so với vacxin chết; Có thể dùng can thiệp trực tiếp vào ổ dịch; Liều lượng ít, dễ tiêm chủng

Nhược điểm của vacxin sống là: Mức độ an toàn thấp do đột biến dẫn đến

sự trở lại cường độc; Tạp nhiễm virus trong nuôi cấy tế bào; Không sử dụng được cho động vật mang thai; Không dùng cho những vùng an toàn dịch; Khó bảo quản, chi phí lớn

2.3.3.3 Vacxin dưới đơn vị

Là loại vacxin chứa những kháng nguyên tương đối tinh khiết phân lập từ virus hay vi khuẩn sinh bệnh

Vacxin dưới đơn vị có mức độ thuần nhất và tinh khiết hơn toàn bộ vi sinh vật cho nên các tính mẫn cảm, tính sinh kháng thể và tính hiệu lực đều cao 2.3.3.4 Vacxin thế hệ mới sản xuất bằng công nghệ gen

Vacxin thế hệ mới là thành phẩm của một quy trình có sự can thiệp, sử dụng, thao tác của công nghệ gen

Trong một loại vacxin, yếu tố quyết định tính sinh miễn dịch chính là thành phần protein đặc biệt có trên bề mặt của vi sinh vật gây bệnh Thành phần protein này được gọi là kháng nguyên và do một gen hay một số gen có trong hệ gen của

vi sinh vật gây bệnh quyết định tổng hợp nên Những gen chịu trách nhiệm về việc tổng hợp (hay sản xuất) protein kháng nguyên được gọi là gen kháng nguyên Nếu tách gen kháng nguyên khỏi vật liệu di truyền của vi sinh vật rồi ghép vào một hệ thống plasmid vector thích ứng nào đó thì gen kháng nguyên

này vẫn hoạt động như khi tồn tại trong hệ gen của vi sinh vật chủ và phân tử protein kháng nguyên được tổng hợp ra vẫn có thể có chức năng như cũ, tức là có tính sinh miễn dịch Chế phẩm protein kháng nguyên được tạo ra như thế được gọi là vacxin tái tổ hợp gen hay vacxin thế hệ mới – vacxin công nghệ gen 2.3.4 Nguyên lý sử dụng vacxin

Khi đưa vacxin vào cơ thể động vật, với sự kích thích của yếu tố kháng nguyên có trong vacxin, hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, tạo ra một đáo ứng miễn dịch dịch thể và tế bào Đáp ứng này làm sản sinh ra các yếu tố vận chuyển để chống lại kháng nguyên, đó là kháng thể dịch thể đặc hiệu hoặc kháng thể tế bào Các yếu tố này lưu thông trong máu và dịch thể của cơ thể động vật, gây ra trạng thái miễn dịch tiếp thu chủ động nhân tạo Khi kháng nguyên là mầm bệnh cường độc từ bên ngoài xâm nhập, chúng sẽ bị các kháng thể đặc hiệu tiêu diệt hoặc loại trừ, không thực hiện được quá trình gây bệnh Phản ứng tiêu diệt hoặc loại trừ mầm bệnh của các yếu tố kháng thể rất đặc hiệu Vì vậy, không phải vacxin nào cũng gây miễn dịch chung chống lại mọi tác nhân gây bệnh, vacxin tạo

ra từ loại tác nhân gây bệnh nào thì chỉ có tác dụng sinh đáp ứng miễn dịch chống lại chính tác nhân đó (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

2.3.5 Quy luật hình thành kháng thể sau khi sử dụng vacxin ở động vật Khi đưa vacxin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vacxin và sự xâm nhập của kháng nguyên vacxin lần đầu hay lần thứ hai, thứ ba,

… Sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất sau 2 – 3 tuần rồi giảm dần và mất đi sau vài tháng hoặc vài năm Sử dụng vacxin lần đầu, đáp ứng miễn dịch gọi là sơ cấp hay tiên phát Sử dụng vacxin lần hai, đáp ứng miễn dịch gọi là thứ cấp hay thứ phát Trong đáp ứng miễn dịch thứ phát, thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện kháng thể sớm (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

2.3.6 Vacxin phòng bệnh gây ra do PPV

Hiện nay, trên thị trường vacxin của nước ta đang lưu hành khá nhiều loại vacxin phòng bệnh gây ra do PPV Nhưng chỉ có một loại được sản xuất trong nước, đó là vacxin “Parvo lợn” của Xí nghiệp thuốc thú y TW, đây là loại vacxin

vô hoạt có chất bổ trợ keo phèn, được sản xuất từ virus Parvo ở lợn nuôi cấy trên

tế bào thận bào thai lợn Các loại vacxin phòng PPV khác hiện đang lưu hành trên thị trường chủ yếu là vacxin nhập ngoại

Trong danh mục vacxin, chế phẩm sinh học, vi sinh vật, hóa chất dùng trong thú y được phép lưu hành tại Việt Nam ban hành kèm theo Thông tư số 28/2013/TT-BNNPTNT ngày 31 tháng 05 năm 2013 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT, các vacxin phòng PPV nhập ngoại hiện đang lưu hành tại Việt Nam gồm có:

Porcilis Aujeszky + Parvo (Công ty Intervet – Hà Lan): Phòng bệnh giả dại

và rối loạn sinh sản trên lợn

Porcilis Parvo (Công ty Intervet – Hà Lan): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn

Porcilis Ery+Parvo (Công ty Intervet – Hà Lan): Phòng bệnh đóng dấu và rối loạn sinh sản trên lợn

Porcine parvovirus gene vaccine (Công ty Green Gross Veterinary Products – Hàn Quốc): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn

PPV-VAC và Suishot Parvoguard (Công ty Choongang vaccine laboratory – Hàn Quốc): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn

Parvoerysin (Công ty Bioveta, A.S – Đức): Phòng bệnh đóng dấu và rối loạn sinh sản trên lợn

Parvosin - OL (Công ty Bioveta, A.S – Đức): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn

Suvaxyn®P (Công ty Fort Dodge Animal Health – Mỹ nhập khẩu từ Brazil): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn

Farrowsure B (Công ty Zoetis – Mỹ): Phòng bệnh đóng dấu lợn, rối loạn sinh sản, 6 chủng Lepto trên lợn

Parvovax (Công ty Merial – Pháp): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn Parvosuin-Mr (Công ty Laboratories Hipra S.A – Tây Ban Nha): Phòng bệnh đóng dấu và rối loạn sinh sản trên lợn

Parvo Shield L5E (Công ty Novartis – Thụy Sỹ): Phòng bệnh đóng dấu, rối loạn sinh sản và 5 chủng Lepto trên lợn

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được tiến hành tại:

- Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1

Địa chỉ: Phường Phương Mai – Đống Đa – Hà Nội

- Công ty TNHH Kyoto Biken Hanoi Laboratories

Địa chỉ: Khu công nghiệp Thăng Long II – Yên Mỹ – Hưng Yên

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 4/2016 đến tháng 4/2017

3.3 ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus vô hoạt nhập từ Nhật Bản được sản xuất từ chủng 90HS-SK gây nhiễm trên tế bào SK-H tại công ty Kyoto Biken Laboratories Inc, Nhật Bản

Mỗi liều vắc xin chứa ít nhất 2x107 TCID50 Porcine Parvovirus

- Động vật thí nghiệm: lợn cái ở độ tuổi 150 ngày, là con lai giữa lợn đực Duroc với nái F1 (Landrace x Yorkshire), không có kháng thể chống Porcine Parvovirus

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Kiểm tra tính vô trùng, tính an toàn và hiệu lực của vacxin

- Đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Kiểm tra tính vô trùng của vacxin

Vacxin khi đưa vào sử dụng cho động vật cần đạt yêu cầu về tính vô trùng, vacxin không được nhiễm các vi sinh vật khác, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh Thử nghiệm vô trùng có thể thực hiện bằng hai phương pháp: Phương pháp màng lọc và phương pháp cấy trực tiếp Phương pháp màng lọc dùng một bơm chân không hút tất cả vacxin trong lọ cần kiểm tra đi qua một màng lọc có kích thước

lỗ lọc nhỏ hơn hoặc bằng 0.45µm để giữ lại vi khuẩn và nấm trên màng, rửa màng lọc để loại bỏ hết các chất ức chế bằng cách cho các dung dịch rửa đi qua, sau đó nuôi cấy màng lọc trong các môi trường thích hợp cho vi khuẩn và nấm phát triển Trong nghiên cứu này, phương pháp cấy trực tiếp được sử dụng để

kiểm tra tính vô trùng của vacxin Sử dụng 2 loại môi trường là Thioglycolat (TGC) và Soybean Casein Digest (SCD) để kiểm tra

- Môi trường TGC được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí

- Môi trường SCD được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm

Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp thử vô trùng của vacxin

và chế phẩm sinh học dùng trong thú y quy định trong TCVN 8684:2011

3.5.1.1 Dụng cụ, thiết bị, nguyên vật liệu

a Pha môi trường thử vô trùng

- Tính lượng môi trường cần pha;

- Cân bột TGC và SCD theo tỷ lệ: 30g/1000ml;

- Chuẩn bị chai đựng, dán nhãn, ghi ngày pha;

- Cho 1/2 - 1/3 lượng nước vào từng chai

TGC: sử dụng nước nóng khoảng 70oC

SCD: sử dụng nước ở nhiệt độ thường

- Thêm lượng bột TGC và SCD đã cân vào từng chai đó

- Thêm nốt lượng nước còn lại cho vừa đủ thể tích cần pha (nghiêng chai rót nước từ miệng chai xuống sao cho hòa tan nốt lượng bột còn dính trên thành chai)

- Cho nam châm vào, sử dụng máy khuấy từ thực hiện khuấy cho tan hoàn toàn

- Dùng pipet hút 15ml TGC, SCD môi trường cho vào ống nghiệm, xếp ống nghiệm lên giá Đạy nút silicon xốp sâu tới 2/3 nút

Ghi nhãn đầy đủ các thông tin: Tên môi trường, ngày pha, hạn sử dụng

- Hấp tiệt trùng môi trường đã chia trong các ống nghiệm ở 121oC trong

15 phút

- Sau khi kết thúc quá trình tiệt trùng, để nguội môi trường ở nhiệt độ phòng Môi trường đã pha có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 - 25 oC) và sử dụng trong 3 tuần

b Quy trình thử vô trùng

Thử nghiệm vô trùng phải thực hiện dưới điều kiện hốt Biosafety Cabinet class II đạt cấp độ A, trong nền phòng sạch cấp độ B Phòng sạch phải được kiểm soát áp xuất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí và giám sát vi sinh Người thực hiện được trang bị phương tiện bảo hộ vô trùng và tuân thủ mọi quy trình ra vào khu vực sạch

- Lấy mẫu vacxin ra khỏi nơi bảo quản, lau cồn ngoài vỏ lọ vacxin trước khi chuyển vào Clean Bench

- Thể tích mẫu vacxin được lấy để cấy:

Môi trường TGC: 1ml mẫu/ ống x 2 ống thử;

- Sử dụng 2 ống thử của mỗi loại môi trường TGC và SCD, cấy 1ml nước cất/ ống để làm đối chứng

- Các ống môi trường TGC sau khi cấy được nuôi ở nhiệt độ 36 – 38oC, các ống môi trường SCD được nuôi ở nhiệt độ 20 – 25oC trong 14 ngày

c Đánh giá

Sau khi nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả ở các thời điểm 3 – 5 ngày, 7 – 9 ngày, 14 ngày sau khi cấy bằng các so sánh màu và độ đục của ống đã cấy mẫu vacxin và ống đối chứng cùng loại

- Kết quả dương tính khi môi trường tạo váng, đục hoặc lắng cặn;

- Kết quả âm tính khi môi trường không có sự thay đổi về màu sắc và độ đục, giống ống đối chứng

Vacxin được coi là vô trùng khi tất cả các ống thử đều âm tính sau 14 ngày nuôi cấy

Trong trường hợp ống thử dương tính, làm tiêu bản nhuộm Gram, soi kính hiển vi để phát hiện loại vi sinh vật tiến hành nhắc lại thử nghiệm

Nếu không bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ hai thì sản phẩm được coi là vô trùng Nếu bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ hai với cùng loại vi sinh vật ở lần kiểm tra thứ nhất thì sản phẩm không đạt tính vô trùng Nếu bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ hai không cùng loại vi sinh vật ở lần kiểm tra thứ nhất thì tiến hành thử nghiệm lần ba

Nếu ở lần kiểm tra thứ ba kết quả không bị nhiễm thì sản phẩm được coi là

vô trùng Nếu ở lần kiểm tra thứ ba kết quả bị nhiễm dù chỉ một ống, cho dù là bất kỳ loại vi sinh vật nào thì sản phẩm được coi là không đảm bảo tính vô trùng 3.5.2 Kiểm tra tính an toàn của vacxin

An toàn là một chỉ tiêu quan trọng của một vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus là vacxin vô hoạt, độ an toàn được đánh giá qua thử nghiệm sử dụng quá liều gấp 2 lần so với chỉ định

Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp được quy định trong 10/KN1 tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1

31VR-3.5.2.1 Bố trí thí nghiệm

Sử dụng 6 lợn cái là con lai giữa lợn đực Duroc với nái F1 (Landrace x Yorkshire) ở độ tuổi 150 ngày, khỏe mạnh

Thí nghiệm được bố trí như sau:

- Lô đối chứng (03 con): không tiêm vacxin;

- Lô thí nghiệm (03 con): mỗi lợn được tiêm dưới da với 02 liều vacxin ghi trên nhãn

STT Lô Số con Liều và đường đưa vacxin Phương pháp đánh giá

1 Đối chứng 03 Không dùng vacxin - Theo dõi triệu chứng

Phản ứng cục bộ tại vị trí tiêm: Sưng, áp xe, viêm

Nếu có lợn chết sẽ tiến hành mổ khám và kiểm tra bệnh tích

Ghi chép chi tiết số lợn ốm, chết Mô tả chi tiết triệu chứng lâm sàng và bệnh tích nếu động vật chết

- Thể trọng: Thể trọng của từng lợn trong thí nghiệm được cân ngay trước khi tiêm vacxin và ngay sau khi quá trình thí nghiệm kết thúc

3.5.2.2 Đánh giá

- Sau khi tiêm vacxin, nếu lợn sống khỏe mạnh, sinh trưởng và phát triển bình thường, không có các phản ứng bất thường trong thời gian 21 ngày sau khi tiêm vacxin thì vacxin đảm bảo tính an toàn

- Nếu lợn xuất hiện các triệu chứng bất thường liên quan đến vacxin thì vacxin không đảm bảo tính an toàn

3.5.3 Kiểm tra hiệu lực của vacxin

Kiểm tra hiệu lực của vacxin là một yêu cầu cần thiết để đảm bảo vacxin sau khi sử dụng đem lại hiệu quả bảo hộ cho con vật với tác nhân gây bệnh đặc hiệu Có nhiều phương pháp kiểm tra hiệu lực như công cường độc, định lượng kháng nguyên, định lượng kháng thể trong huyết thanh, thử hiệu lực lâm sàng PPV là virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, để kiểm tra hiệu lực của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus, sử dụng phương pháp định lượng kháng