Hồi cứu về tình hình dịch cúm gia cầm tại Việt Nam từ 2014 đến nay b.Thí nghiệm công cường độc đánh giá hiệu lực vacxin Re-6 + Re-8 chống lại virus H5N6 clade 2.3.4.4 Gà, vịt được chọn
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được nghiên cứu từ tháng 11/2015 đến tháng 4/2016
- Phòng thí nghiệm Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương (TTCĐ)
- Khu nuôi động vật ATSH của TTCĐ
- Phòng thí nghiệm ATSH củaTTCĐ.
Nguyên liệu, đối tượng dùng trong nghiên cứu
- Gà và vịt 1 ngày tuổi
- Vacxin CGC: Vacxin vô hoạt tái tổ hợp Cúm H5 nhị giá chủng Re-6 và Re-8 (Reassortant AIV H5 subtype vaccine, strain Re-6 + strain Re-8) nhập khẩu từ Trung Quốc, được phát triển từ virus H5N1 clade 2.3.2.1 (chủng Re-6) và virus H5N6 clade 2.3.4.4 (chủng Re-8)
- Virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4B phân lập từ mẫu gà ở Lạng Sơn ngày 08/01/2016 (A/Ck/Vietnam/LangSon/16A10/2016(H5N6)
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 dùng cho phản ứng HI: A/ck/VN1203/2004 (clade 1), A/Hubei/1/2010 (clade 2.3.2.1) và A/ck/VN/LangSon(TrangDinh)- NCVD140450(14A324)/2014 (H5N6 clade 2.3.4.4)
3.2.2 Các loại dung dịch, môi trường
- Môi trưởng bảo quản swabs
- Bộ kit chiết tách ARN, kit nhân gen qRT-PCR
- Prime, Probe, đối chứng dương H5N6.
Trang thiết bị máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh âm sâu 80 0 C, tủ lạnh âm 20 0 C, hệ thống bơm hút chân không dùng trong chiết tách RNA, máy Real time PCR (RT-PCR),…
- Phòng thí nghiệm ATSH cấp 2 để phân lập virus
- Phòng nuôi động vật ATSH cấp 2+ để công cường độc.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tình hình dịch bệnh cúm trên đàn gia cầm tại Việt Nam
- Nghiên cứu sự phân bố và lưu hành các chủng virus cúm gia cầm trên địa bàn cả nước
- Đánh giá hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 + Re-8 khi tiêm cho đàn gà, vịt thí nghiệm
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên gà với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N1 clade 2.3.2.1
+ Hiệu giá kháng thể của vacxin Re-6 +Re-8 sau khi tiêm phòng trên vịt với kháng nguyên H5N6 clade 2.3.4.4
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và mức độ bài thải virus của gà thí nghiệm sau khi công cường độc
+ Nghiên cứu các triệu chứng lâm sàng của gia cầm sau công cường độc + Xét nghiệm virus bài thải
+ So sánh hiệu giá kháng thể trung bình và tỉ lệ bảo hộ lâm sàng của lô gà và vịt
+ Bệnh tích đại thể của đàn gà, vịt sau khi công cường độc
- Gà, vịt được chọn từ đàn sạch bệnh, chưa được tiêm phòng vacxin CGC và không có kháng thể kháng kháng nguyên cúm H 5 Gà, vịt được lấy máu trước khi tiêm vacxin (khoảng 30% tổng đàn) để kiểm tra kháng thể kháng cúm gia cầm bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1
- Bố trí tiêm vacxin cho gà như sau: Tổng số 50 gà được chia thành lô Vacxin (30 con) và lô Đối chứng (20 con) Tiêm vacxin cho 30 gà lô Vacxin với liệu trình 1 mũi lúc 03 tuần tuổi theo khuyến cáo của nhà sản xuất Gà thuộc lô Đối chứng không được tiêm
- Bố trí tiêm vacxin cho vịt như sau: Tổng số 50 vịt được con chia thành lô Vacxin (30 con) và lô Đối chứng (20 con) Tiêm vacxin cho 30 vịt lô Vacxin với liệu trình 1 mũi lúc 3 tuần tuổi và nhắc lại lúc 6 tuần tuổi theo khuyến cáo của nhà sản xuất Vịt thuộc lô Đối chứng không được tiêm
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin
Nhóm Số lượng Liều vacxin
Gà Tiêm vacxin 30 0,3 ml/con Đối chứng 20 Không tiêm
Vịt Tiêm vacxin 30 0,3 ml/con Đối chứng 20 Không tiêm
- Ba tuần sau khi hoàn tất liệu trình vacxin, lấy máu gà, vịt để xác định hiệu giá kháng thể kháng H 5 của virus CGC bằng phương pháp HI với kháng nguyên H5N1 đồng chủng vacxin (hoặc gần với chủng virus vacxin nhất) và kháng nguyên virus dùng để công cường độc
- Công cường độc vào lúc 6 tuần tuổi đối với gà và 9 tuần tuổi đối với vịt, tức là 03 tuần sau khi hoàn tất liệu trình vacxin Lựa chọn gà, vịt để công cường độc theo tỷ lệ phân bố hiệu giá kháng thể đối với kháng nguyên đồng chủng vacxin Mỗi loài bao gồm 10 con thuộc lô Vacxin và 5 con thuộc lô Đối chứng
Số còn lại để dự phòng
- Theo dõi trong vòng 10 ngày sau công cường độc, chấm điểm lâm sàng hằng ngày theo quy trình của OIE Đánh giá theo các mức độ sau: Điểm Ý nghĩa
Không chấm điểm Khoẻ mạnh
- Mổ khám gia cầm chết, đánh giá bệnh tích đại thể Mổ khám gia cầm sống sót để so sánh bệnh tích với những con chết
- Lấy mẫu swab hầu họng vào các ngày thứ 3, thứ 10 và ngày gia cầm chết sau công cường độc để xét nghiệm virus bài thải bằng phương pháp Real-time RT-PCR
- Lấy mẫu huyết thanh gia cầm sống sót vào ngày thứ 10 để đánh giá đáp ứng miễn dịch đối với virus cường độc
3.4.2.2 Phương pháp điều tra hồi cứu
Thu thập, tổng hợp thông tin từ Cục Thú y về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch CGC, kết quả tiêm phòng vacxin, kết quả xét nghiệm giám sát huyết thanh sau tiêm phòng qua các năm Từ đó đánh giá được hiệu quả của việc tiêm phòng vacxin cúm trên thực địa
3.4.2.3 Chuẩn đoán phòng thí nghiệm
Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm: (phụ lục 5) Tất cả các thao tác liên quan đến xử lý mẫu, chiết tách ARN, phân lập virus trong tiêu chuẩn này phải được tiến hành trong buồng an toàn sinh học cấp 2 trở lên a Lấy mẫu bệnh phẩm
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
Mẫu xét nghiệm kháng nguyên: lấy 3 gam đến 5 gam bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột…) của gia cầm bị bệnh Trong trường hợp gia cầm còn sống, sử dụng tăm bông để ngoáy dịch ổ nhớp (swab), họng hoặc lấy phân tươi sau đó cho vào dung dịch PBS, pH 7,2 đến 7,4, có bổ sung dung dịch kháng sinh theo tỉ lệ 1:10 (xem a, phụ lục 1)
Dung dịch muối đệm phosphat (PBS):
+ Natri clorua (NaCl) 8 g + Natri hydro photphat dihydrat (Na 2 HPO 4 2H 2 O) 2,9 g + Kali dihydro photphat (KH 2 PO 4 ) 0,2 g + Kali clorua (KCl) 0,2 g
Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N Hấp vô trùng ở 121 o C trong 30 giây
*) Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
Chỉ thực hiện đối với gia cầm chưa tiêm vacxin cúm gia cầm: lấy máu của gia cầm nghi mắc cúm bằng cách sử dụng xy lanh 5 ml để lấy 1 ml máu, rút cán xy lanh tới mức cao nhất để tạo nhiều khoảng trống bên trong, đặt xi lanh nằm nghiêng
5 o ở nhiệt độ 20 đến 30 o C trong thời gian 30 min để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm
Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2 o C đến 8 o C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24h b Phát hiện kháng nguyên
- Mẫu bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột)
+ Nghiền 1 gam bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch 10 %
+ Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm Ly tâm ở tốc độ 8 000 r/min trong 15 s
+ Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào 2 ống 1,5 ml Một ống dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR (rRT-PCR), phân lập virus trên tế bào, phân lập trên trứng, ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ - 80 o C
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân tươi
+ Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc trong 15 s, ly tâm ống ở tốc độ 8000 g/min trong 15 giây
+ Dùng pipet hút dịch trong ống chuyển sang 2 ống 1,5 ml Một ống dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR, phân lập virus trên tế bào hoặc phân lập trên trứng, ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ - 80 o C
*) Phương pháp Realtime PCR (phụ lục 4)
Tất cả các thao tác tiêm truyền trứng và thu hoạch nước trứng (dịch niệu mô) sau phân lập phải được thực hiện trong điều kiện an toàn sinh học cấp 3
+ Mỗi mẫu bệnh phẩm cần được tiêm truyền lên 3 trứng
+ Chọn trứng gà có phôi 9 ngày đến 10 ngày tuổi khoẻ mạnh không có kháng thể cúm
+ Lau trứng bằng cồn 70 % và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi
+ Dùng xi lanh 1 ml với kim 23G và hút dịch bệnh phẩm tiêm phía trên buồng hơi thẳng xuống xoang niệu mô với lượng 0,2 ml/trứng
+ Bịt lỗ tiêm trên vỏ trứng bằng keo dán
+ Đặt trứng trong tủ ấp trứng 37 o C và theo dõi trong vòng 72 h
+ Soi trứng mỗi ngày 2 lần, nếu phát hiện trứng chết, giữ trứng trong tủ lạnh (4 o C) cho đến khi thu hoạch dịch niệu mô để giám định virus
+ Đối với trứng không chết sau 72 h, cất vào tủ lạnh (4 o C) qua đêm hoặc ít nhất 4 h trước khi thu hoạch dịch niệu mô cho giám định virus
- Thu hoạch dịch niệu mô
+ Dùng panh và kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên
+ Thu hoạch dịch niệu mô từ 5 ml đến 10 ml/trứng vào các ống nghiệm riêng rẽ để giám định virus
+ Trước khi tiến hành giám định, sử dụng phương pháp HA để xác định sự có mặt virus cúm gia cầm (Newcastle, vi rút gây hội chứng giảm đẻ) trong dịch niệu mô thông qua đặc tính gây ngưng kết hồng cầu Nếu HA dương tính, dịch niệu mô có virus
+ Giám định virus trong dịch niệu mô bằng phương pháp HI sử dụng kháng huyết thanh chuẩn H5 hoặc bằng phương pháp Realtime RT-PCR
+ Kết quả giám định (bằng HI hoặc phản ứng realtime RT- PCR hoặc RT- PCR) dương tính, dịch niệu mô có virus cúm gia cầm H5N1
+ Kết quả giám định âm tính, dịch niệu mô không có virus cúm gia cầm + Trong trường hợp giám định âm tính, dùng dịch niệu mô thu hoạch ở lần thứ nhất để tiêm truyền trứng lần hai sau đó theo dõi và thu hoạch dịch niệu mô như lần thứ nhất để giám định Nếu kết quả giám định lần thứ hai vẫn âm tính thì kết luận mẫu âm tính với virus cúm gia cầm H5N1 c Phát hiện kháng thể