Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu

BÀI THỰC HÀNH SỐ 1 CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH Ống nghiệm: Được sử dụng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút bằng gòn không thấm nước hay bằng nhựa chịu nhiệt Hình

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Trang 3

THỰC TẬP VI SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN MỸ LINH, NGUYỄN THỊ TỊNH ẤU

Chịu trách nhiệm xuất bản và nội dung

Đối tác liên kết – Tổ chức bản thảo và chịu trách nhiệm tác quyền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM

Website: http://hcmute.edu.vn

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Phòng 501, Nhà Điều hành ĐHQG-HCM, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, TP Hồ Chí Minh

ĐT: 028 6272 6361 - 028 6272 6390 E-mail: vnuhp@vnuhcm.edu.vn

Website: www.vnuhcmpress.edu.vn VĂN PHÒNG NHÀ XUẤT BẢN PHÒNG QUẢN LÝ DỰ ÁN VÀ PHÁT HÀNH

Tòa nhà K-Trường Đại học Khoa học Xã hội & Nhân văn, số 10-12 Đinh Tiên Hoàng, phường Bến Nghé,

Quận 1, TP Hồ Chí Minh

ĐT: 028 66817058 - 028 62726390 - 028 62726351 Website: www.vnuhcmpress.edu.vn

Trang 4

THỰC TẬP VI SINH

KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN MỸ LINH, NGUYỄN THỊ TỊNH ẤU

ĐỂ CÓ SÁCH HAY, CẦN CHUNG TAY BẢO VỆ TÁC QUYỀN!

Trang 6

LỜI NÓI ĐẦU

Giáo trình “Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường” được biên

soạn nhằm phục vụ cho công tác giảng dạy môn học Thực tập vi sinh vật

kỹ thuật môi trường cho sinh viên ngành Công nghệ kỹ thuật môi trường Môn học cung cấp những kiến thức và kỹ thuật cơ bản về phân tích; kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh trong lĩnh vực kỹ thuật môi trường Nội dung sách bao gồm 8 phần đi từ hướng dẫn các thao tác cơ bản trong việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy, phân lập vi sinh vật và giữ giống vi sinh vật đến việc

phân tích các chỉ tiêu Coliforms; tổng vi khuẩn hiếu khí là những chỉ tiêu

đáng quan tâm trong tiêu chuẩn xử lý nước thải; nước cấp

Quyển sách này có thể được sử dụng làm tài liệu học tập cho sinh viên chuyên ngành kỹ thuật môi trường Đồng thời, các cán bộ nghiên cứu, cán bộ quản lý và kỹ sư môi trường có thể sử dụng quyển sách này làm tài liệu tham khảo trong quá trình nghiên cứu và học tập

Các tác giả xin trân trọng gửi đến bạn đọc và mong nhận được ý kiến đóng góp về nội dung quyển sách để những lần tái bản sau được hoàn chỉnh và chất lượng hơn

Các tác giả

Trang 8

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 3

CÁC KÝ HIỆU VÀ ĐƠN VỊ 11

MỞ ĐẦU 13

BÀI THỰC HÀNH SỐ 1: CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG .17

1.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT 17

1.1.1 Dụng cụ 17

1.1.2 Thiết bị 19

1.1.3 Các phương pháp khử trùng dụng cụ 23

1.1.4 Kỹ thuật bao gói dụng cụ 25

1.2 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 26

1.2.2 Dụng cụ 26

1.3 THỰC NGHIỆM 27

1.3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng và bao gói ống nghiệm 27

1.3.2 Thí nghiệm 1: Khử trùng và bao gói đĩa petri 27

1.4 CÂU HỎI ÔN TẬP 27

1.5 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 27

BÀI THỰC HÀNH SỐ 2: CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 28

2.1.1 Khái niệm 28

2.1.2 Phân loại môi trường dinh dưỡng 28

Trang 9

2.1.3 Điều chỉnh độ pH của môi trường 29

2.1.4 Phân phối môi trường vào dụng cụ 30

2.1.5 Bảo quản và kiểm tra môi trường 31

2.1.6 Các phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng 32

2.2 HÓA CHẤT 32

2.3 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 33

2.3.2 Dụng cụ 33

2.4.1 Thí nghiệm 1: Pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy nấm men (Hansen) 33

2.4.2 Thí nghiệm 2: Phân phối môi trường vào ống nghiệm (thạch đứng, thạch nghiêng) 34

BÀI THỰC HÀNH SỐ 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT 36

3.1.2 Kỹ thuật phân lập vi sinh vật thuần khiết 36

3.2 HÓA CHẤT 39

3.3.2 Dụng cụ 39

3.4.1 Thí nghiệm 1: Thực hiện kỹ thuật cấy ria chủng vi sinh nấm men 39

Trang 10

3.4.2 Thí nghiệm 2: Thực hiện kỹ thuật đổ đĩa chủng

vi sinh nấm men 41

3.4.3 Thí nghiệm 3: Thực hiện kỹ thuật trải đĩa chủng vi sinh nấm men 41

BÀI THỰC HÀNH SỐ 4: KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT 44

4.1.2 Nguyên tắc 44

4.2 HÓA CHẤT 45

4.3.2 Dụng cụ 45

BÀI THỰC HÀNH SỐ 5: CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT 48

5.1.1 Phương pháp làm tiêu bản tạm thời 48

5.1.2 Phương pháp làm tiêu bản cố định 49

5.2 HÓA CHẤT 50

5.3.2 Dụng cụ 50

Trang 11

5.4.1 Thí nghiệm 1: Quan sát hình thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuật tiêu bản giọt ép 50

5.4.2 Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuật tiêu bản giọt treo 51

5.4.3 Thí nghiệm 3: Quan sát hình thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuật tiêu bản tạm thời có nhuộm màu 52

5.4.4 Thí nghiệm 4: Quan sát hình thái của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) trên kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm Gram 52

BÀI THỰC HÀNH SỐ 6: TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 55

6.1.1 Kỹ thuật đếm trên đĩa tế bào dị dưỡng 55

6.1.2 Phương pháp xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 55

6.2 HÓA CHẤT 56

6.3.2 Dụng cụ 56

6.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đổ đĩa 57

6.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật trải đĩa 57

6.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 58

Trang 12

BÀI THỰC HÀNH SỐ 7: PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TỔNG COLIFORMS TRONG NƯỚC THẢI 60

7.1.2 Sự phân bố của vi sinh vật và ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu 60

7.1.3 Phương pháp màng lọc 61

7.1.4 Phương pháp MPN (Most Probable Number – phương pháp định lượng; phương pháp pha loãng tới hạn) 61

7.2 HÓA CHẤT 63

7.3.2 Dụng cụ 63

7.4.1 Thí nghiệm 1: Kiểm tra Coliforms trong nước thải bằng phương pháp màng lọc 64

7.4.2 Thí nghiệm 2: Kiểm tra Coliforms trong nước thải bằng phương pháp MPN 65

7.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 66

BÀI THỰC HÀNH SỐ 8: KIỂM TRA E COLI TRONG NƯỚC THẢI .68

8.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT 68

Trang 13

8.1.2 Các loại môi trường thường được sử dụng 68

8.2 HÓA CHẤT 70

8.3.2 Dụng cụ 70

8.4.1 Thí nghiệm 1: Kiểm tra sơ bộ E coli bằng ống chuông 70

8.4.2 Thí nghiệm 2: Nuôi cấy E coli bằng phương pháp trải đĩa 71

PHỤ LỤC 1 72

PHỤ LỤC 2 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

Trang 14

CÁC KÝ HIỆU VÀ ĐƠN VỊ

VSV Vi sinh vật Microoganisms CFU/mL TCVN

CFU

Tiêu chuẩn Việt Nam

Đơn vị khuẩn lạc Colony forming unit

PCA Môi trường Plate count agar

R2A Môi trường Reasoner’s 2A Agar

LT Môi trường Lauryl Tryptose

BGBL Môi trường Brilliant Green Lactose

Bile Salt MPN Phương pháp pha

loãng tới hạn

Most Probable Number CFU/mL

E.M.B

Agar

Môi trường Eosin Methylene-blue

Lactose Sucrose agar E.C Broth Môi trường Escherichia coli Broth

Trang 16

- Điều hành một nhóm sinh viên cùng thực hiện một công việc.

- Luyện tập khả năng viết một báo cáo kỹ thuật

2 Yêu cầu trước thí nghiệm

- Sinh viên phải đọc bài hướng dẫn thí nghiệm, tham khảo tài liệu liên quan để tìm hiểu các kiến thức cần thiết cho bài thí nghiệm

- Xem thiết bị để hiểu cách tiến hành thí nghiệm, vạch kế hoạch làm việc và phân công trong nhóm

- Chuẩn bị mẫu nước và các dụng cụ cần thiết trước khi tiến hành thí nghiệm

3 Yêu cầu khi làm thí nghiệm

Sau mỗi bài thí nghiệm, mỗi nhóm sinh viên phải làm một bản báo cáo kết quả thu được Tổng hợp tất cả các bản báo cáo thành một tập và nộp lại cho giảng viên sau khi học xong 08 bài thí nghiệm

4 Nội dung

- Trình bày yêu cầu, nội dung tóm tắt và kết quả của bài thí nghiệm

- Lý thuyết liên quan đến bài thí nghiệm

- Thực hiện: trình bày các bước thí nghiệm và số liệu thô

- Kết quả tính toán, nhận xét kết quả thu được

- Tài liệu tham khảo (nếu có)

5 Nội quy phòng thí nghiệm

Nguyên tắc chung

- Chuẩn bị bài thí nghiệm trước khi vào phòng thí nghiệm

Trang 17

- Làm thí nghiệm theo chỉ dẫn của giáo viên và điều kiện đã nêu trong tài liệu.

- Không tự ý thay đổi quy trình làm thí nghiệm đã được giáo viên hướng dẫn và trong tài liệu

- Không làm việc một mình trong phòng thí nghiệm

- Không gây ồn ào, đùa giỡn trong phòng thí nghiệm

- Nơi làm việc phải sạch sẽ, ngăn nắp Chỉ để vở ghi chép và tài liệu hướng dẫn thí nghiệm tại bàn làm việc Các loại sách khác, túi xách, nón,… phải để đúng nơi qui định

- Luôn mặc áo blouse dài tay, kính bảo hộ khi trong phòng thí nghiệm

- Tóc dài phải được buộc gọn lại, đặc biệt khi làm việc gần ngọn lửa

- Không đeo các đồ trang sức hoặc trang phục không gọn gàng (dây chuyền, vòng tay, áo khoác,…) trong phòng thí nghiệm

- Tuân thủ các chỉ dẫn trong phòng thí nghiệm

- Lắp ráp dụng cụ thí nghiệm theo đúng chỉ dẫn của giáo viên và tài liệu

- Để xa các chất, vật liệu dễ cháy khỏi nguồn lửa

- Luôn sử dụng các dụng cụ được chỉ định (kẹp ống nghiệm, các loại kẹp tay dài, găng tay,…) khi sử dụng các thiết bị hay dụng cụ khác

- Không dùng tay trần lấy hóa chất, trừ khi được hướng dẫn bởi chính giáo viên

- Không để mặt sát vào miệng chai, lọ chứa hóa chất

- Không ngửi hóa chất, trừ khi được hướng dẫn bởi giáo viên Khi cần kiểm tra mùi, dùng tay quạt nhẹ hơi cần thử về phía mũi

- Phải làm việc trong tủ hút đối với các chất khí độc

- Đổ nước thải, hóa chất thải đúng nơi quy định (các bình đã dán nhãn)

- Lau chùi ngay lập tức những thứ bị đổ, tràn ra ngoài

- Làm sạch và lau khô nơi làm việc khi kết thúc lớp học Rửa tay kỹ

- Biết nơi để các thiết bị cần thiết trong các trường hợp khẩn cấp

Trang 18

(bình chữa cháy, vòi nước chữa cháy, tủ y tế,…) và biết cách sử dụng các thiết bị này.

- Báo ngay lập tức cho giáo viên các tai nạn xảy ra trong phòng thí nghiệm

Sử dụng hóa chất

- Đọc và kiểm tra nhãn trên chai, lọ hóa chất trước khi lấy hóa chất

sử dụng Lấy lượng hóa chất vừa đủ dùng

- Không bỏ lại hóa chất không sử dụng vào lọ hóa chất gốc

- Khi chuyển hóa chất từ lọ này qua lọ khác phải để các lọ này cách

- Không bao giờ dùng lực mạnh khi tháo hay lắp một dụng cụ thủy tinh vào nút cao su Hãy sử dụng động tác vặn Nhờ giáo viên nếu không thể tháo dụng cụ thủy tinh đó

- Không đun dụng cụ thủy tinh không chịu nhiệt trực tiếp với ngọn lửa trần, nguồn nhiệt

- Không chạm tay trần vào dụng cụ thủy tinh đang nóng, không làm lạnh đột ngột dụng cụ thủy tinh nóng (Hãy nhớ: Thủy tinh nóng trông giống như nguội)

Sử dụng các nguồn nhiệt

- Phải cực kỳ cẩn thận khi sử dụng đèn cồn Để quần áo, đầu tóc tránh xa ngọn lửa

Trang 19

- Luôn tắt lửa khi không sử dụng.

- Không để hóa chất tiếp xúc với ngọn lửa, đặc biệt là các chất dễ cháy (bông gòn, giấy, ), trừ khi được hướng dẫn làm như vậy

- Không đun nóng bất cứ thứ gì khi không được chỉ dẫn

- Khi gia nhiệt các chất ống nghiệm, không để miệng ống nghiệm hướng vào mình hoặc người khác

Các lưu ý khi thực hiện thí nghiệm

- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- Mang khẩu trang và bao tay khi thao tác với vi sinh vật

- Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm

chlorox 10%), để khô Thực hiện tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn khi tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng này sau khi hoàn thành công việc

- Cần ghi chú tên chủng vi sinh vật, ngày tháng thí nghiệm lên tất

cả các hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy

- Khi lỡ làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp (trường hợp tóc dài)

- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút bằng miệng

- Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các đĩa petri lên nhau

- Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp

- Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí

- Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm

Trang 20

BÀI THỰC HÀNH SỐ 1 CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH

Ống nghiệm: Được sử dụng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh

vật, có nút bằng gòn không thấm nước hay bằng nhựa chịu nhiệt

Hình 1.1: Ống nghiệm (Test –tube)

Đĩa petri: Gồm một nắp lớn và một đáy nhỏ úp lồng vào nhau,

đường kính 8cm, 10cm, 12cm, được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật

Trang 21

Hình 1.2: Đĩa petri

Micropipette (Pipetman): Đây là một pipette cho phép rút một

lượng chất rất chính xác Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, cần sử dụng lượng mẫu thể tích nhỏ (0,1 mL; 1 mL); việc sử dụng micropipette cho phép ta lấy chính xác lượng mẫu cần sử dụng

Hình 1.3: Micropipette

Một số dụng cụ khác:

- Cốc thủy tinh (Beaker)

- Bình tam giác (Erlen)

Trang 22

- Bông gòn không thấm nước

Lưu ý: Cần lau cồn bề mặt tủ cấy trước và sau khi làm việc.

1.1.2.2 Nồi hấp áp lực (Autoclave)

Mục đích: Tiệt trùng dụng cụ, môi trường, tiêu diệt tế bào dinh

dưỡng và bào tử

Trang 23

Cấu tạo:

Hình 1.5: Nồi hấp áp lực (Autoclave) Nguyên lý: Dùng hơi nước bão hòa áp suất cao để tiệt trùng.

Sử dụng:

Bước 1: Cắm nguồn; bật công tắc (bên hông thiết bị; phía tay phải) Bước 2: Gạt cần gạt sang biểu tượng ổ khóa mở, đồng thời dùng tay

mở nắp

Bước 3: Xếp dụng cụ, môi trường cần tiệt trùng vào rổ và đặt vào

trong thiết bị; đậy nắp lại

Bước 4: Kéo cần gạt qua biểu tượng ổ khóa đóng.

Bước 5: Chọn MANUAL (nhiệt độ và thời gian được chọn theo chế

15 phút)

Bước 6: Nếu chọn chương trình khác (xem thêm sách hướng dẫn) Bước 7: Ấn nút Start.

Bước 8: Khi tiệt trùng xong lấy mẫu ra (khi nhiệt độ đạt mức bằng

nhiệt bên ngoài, lúc đó áp suất trở lại bình thường mới mở nắp lấy dụng cụ ra được Áp suất hạ xuống dưới 80 PA và

có tiếng bíp báo hiệu quá trình hấp tiệt trùng đã hoàn tất)

Trang 24

Bước 9: Tắt máy bằng cách ấn nút Stop; đậy nắp (kéo cần gạt qua

vị trí khóa đóng), rút nguồn cắm điện

Lưu ý:

- Nước trong nồi tiệt trùng phải là nước cất

- Kiểm tra mực nước trong nồi, không thấp hơn mức quy định; (mâm

để dụng cụ hấp)

- Thời gian khử trùng tùy thuộc vào thể tích vật muốn khử trùng và dụng cụ

- Cần phải vệ sinh thiết bị sau một thời gian sử dụng

- Không hấp các dụng cụ bằng nhựa sẽ gây chảy và hư hỏng dụng cụ

- Rửa sạch dụng cụ, sấy khô, gói giấy báo, sấy

- Ống nghiệm: Làm nút bông, gói giấy báo, 10 ống/gói

- Đĩa petri: 5-10 đĩa/gói

Trang 25

- Bình tam giác: Làm nút bông, gói giấy báo.

- Khi xếp dụng cụ vào tủ sấy không nên xếp quá khít nhau

- Bật công tắc, khi T0: 120-1800C mới bắt đầu tính thời gian

mở tủ để tránh làm nứt vỡ và ảnh hưởng đến tính vô trùng của dụng cụ

- Sau khi sấy, giấy báo và bông gòn phải có màu hơi vàng, nếu có màu nâu thì bông và giấy đã bị quá nhiệt

- Các dụng cụ đã khử trùng, cất ở chỗ kín, tránh bụi, chỉ bóc giấy báo ngay trước khi sử dụng

Lưu ý: Không sấy các dụng cụ bằng nhựa sẽ gây chảy và hư hỏng

Trang 26

- Điều chỉnh ánh sáng bằng nút vặn bên hông đế kính.

- Điều chỉnh tụ quang: Đối với vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40 để tụ quang ở đoạn giữa, vật kính x100

- Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính

- Điều chỉnh vật kính lên xuống khi quan sát tiêu bản (Mắt nhìn vào ống kính)

- Mắt nhìn thị kính, tay vặn núm chỉnh thô để đưa vật kính lên cho đến khi nhìn thấy hình ảnh mờ của mẫu vật

- Điều chỉnh núm chỉnh tinh để được hình ảnh rõ nét

1.1.3 Các phương pháp khử trùng dụng cụ

Cơ sở lý thuyết

Vi sinh vật luôn có mặt trong không khí và trên bề mặt phòng thí nghiệm, dụng cụ và các thiết bị Những vi sinh vật này có thể đóng vai trò như một nguồn gây ô nhiễm bên ngoài và gây ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm Khử trùng dụng cụ là một trong những yếu tố quan trọng vì các dụng cụ được sử dụng trực tiếp trong quá trình thí nghiệm với vi sinh vật.Mục đích của việc khử trùng dụng cụ không chỉ là để kiểm soát các chất ô nhiễm gây hại đối với tế bào sinh vật mà còn để ngăn ngừa sự hình thành các quần thể vi sinh không mong muốn, gây ảnh hưởng đến kết quả quan sát và phân tích

Các phương pháp khử trùng dựa trên sự ảnh hưởng của các nhân tố vật lý, hóa học đối với sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật: nhiệt độ, độ

ẩm, ánh sáng, pH; acid, base, muối kim loại, cồn,

Trang 27

Nguyên tắc

Sau khi khử trùng cần đảm bảo:

- Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ và vật phẩm

- Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật

- Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho con người

Phương pháp nhiệt khô

Khử trùng bằng tủ sấy: Được thực hiện trong tủ sấy; xem phần

hướng dẫn sử dụng tủ sấy ở trên

Khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn lửa nóng đỏ: Phương pháp này

dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau khi lấy nút bông ra

Cách thực hiện:

Bước 1: Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến

3 – 4 lần Với các dây mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy

Bước 2: Đợi dụng cụ nguội mới được sử dụng để tránh vỡ và vi

khuẩn không bị tiêu diệt khi lấy giống nuôi cấy

Trang 28

Phương pháp nhiệt ướt:

Đun sôi trong nước: Phương pháp này được sử dụng khi cần khử

trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, kẹp, cốc,

Sử dụng nồi hấp tiệt trùng: Xem phần hướng dẫn cách sử dụng nồi

hấp tiệt trùng

1.1.3.2 Khử trùng bằng phương pháp hóa học

Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để tiêu diệt vi sinh vật:

Phenol: Được sử dụng ở trạng thái dung dịch 2 – 5% Không được

thoa lên da

Ethanol: Thường được sử dụng để khử trùng ngoài da.

Iod: Tác dụng lên hầu hết các vi sinh vật, có thể diệt nấm và virus

Dung dịch iod dùng để khử trùng ngoài da, tẩy uế nước

Clo và các hợp chất của Clo: Hơi Clo nén được dùng khử trùng

nước uống nhưng khó sử dụng nên thường được dùng dưới dạng hợp chất:

1.1.4 Kỹ thuật bao gói dụng cụ

Nguyên tắc:

Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô

Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng cụ trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

Quy trình bao gói dụng cụ:

Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:

- Làm nút bông: Cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipette

- Bao gói: Cho hầu hết các dụng cụ khác: đĩa petri

Quy trình làm nút bông

Bước 1: Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại.

Trang 29

Bước 2: Dùng tay ấn vào giữa cuộn bông.

Bước 3: Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm.

Quy trình bao gói dụng cụ

Với các dụng cụ sau khi làm nút bông cần bao gói phần có nút bông bằng giấy báo để khi khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn Cách làm như sau:

Bước 1: Cắt giấy báo theo hình chữ nhật với kích thước tùy theo

dụng cụ cần bao gói

Bước 2: Quấn quanh phần đầu có nút bông.

Bước 3: Dán chặt lại bằng băng keo.

Yêu cầu:

- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín

- Bao bằng giấy nhôm với dụng cụ hấp ướt

- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô

- Với các dụng cụ như pipette, que trang phải dùng giấy bao kín toàn

Trang 30

1.3 THỰC NGHIỆM

1.3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng và bao gói ống nghiệm

Bước 1: Lau sạch toàn ống nghiệm bằng nước (bằng cồn) và để khô Bước 2: Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại.

Bước 3: Dùng tay ấn vào giữa cuộn bông.

Bước 4: Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống

nghiệm

Bước 5: Sử dụng giấy báo để gói kín toàn bộ dụng cụ.

Bước 7: Đặt dụng cụ đã bao gói vào tủ sấy trong 30 phút ở 1000C

1.3.2 Thí nghiệm 2: Khử trùng và bao gói đĩa petri

Bước 1: Lau sạch toàn bộ đĩa petri bằng nước (bằng cồn) và để khô Bước 2: Đậy nắp và đáy petri lại.

Bước 3: Sử dụng giấy báo để gói kín toàn bộ dụng cụ.

Bước 5: Đặt dụng cụ đã bao gói vào tủ sấy trong 30 phút ở 1000C

1.4 CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1: Nêu cấu tạo và cách sử dụng nồi hấp tiệt trùng; tủ sấy;

kính hiển vi

Câu 2: Trình bày nguyên tắc khử trùng.

Câu 3: Nêu các phương pháp khử trùng.

Câu 4: Trình bày nguyên tắc và phương pháp bao gói dụng cụ 1.5 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO

1 (phần phụ lục)

Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học

Trang 31

BÀI THỰC HÀNH SỐ 2 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Mục tiêu bài thực hành số 2: Sau khi học xong bài này, sinh viên có

khả năng:

• Trình bày được các loại môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật

• Trình bày được nguyên tắc khử trùng môi trường dinh dưỡng

• Thực hiện được môi trường thạch nghiêng, thạch đứng trong ống nghiệm

• Pha chế được môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật

sự ổn định độ pH của môi trường

Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng:

- Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết

- Có độ pH thích hợp

- Có độ nhớt nhất định

- Không chứa các yếu tố độc hại

- Hoàn toàn vô trùng

2.1.2 Phân loại môi trường dinh dưỡng

Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường

2.1.2.1 Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc

Môi trường tự nhiên: Có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như:

Trang 32

trứng, sữa, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám Thành phần hóa học của loại môi trường không được xác định chính xác do sự không ổn định của sản phẩm tự nhiên.

Môi trường tổng hợp: Chứa các chất hóa học mà thành phần của

chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác

Môi trường bán tổng hợp: Chứa cả các chất hóa học lẫn các sản

phẩm tự nhiên

2.1.2.2 Căn cứ theo tính chất lý học

Môi trường lỏng: Thành phần môi trường này không chứa agar và

thường được sử dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật

Môi trường đặc: Chứa 1,5 – 2% agar hoặc 10 – 20% gelatin Môi

trường này được sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý của

vi sinh vật và nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường bán lỏng: Chỉ chứa 0,3 – 0,7% agar Môi trường này

dùng để quan sát sự di chuyển của vi sinh vật

2.1.2.3 Căn cứ vào công dụng

Môi trường cơ bản: Thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật khác nhau

phát triển

Môi trường chọn lọc: Là môi trường đảm bảo cho sự phát triển ưu

thế của một loài hay một nhóm loài vi sinh vật xác định nào đó dựa trên thành phần đặc trưng của môi trường

2.1.3 Điều chỉnh độ pH của môi trường

Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường, sử dụng HCl 10% hay NaOH 10% Ngoài ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4,

H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3

Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta sử dụng máy đo pH (pH – meter) Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho độ chính xác cao

Trang 33

2.1.4 Phân phối môi trường vào dụng cụ

Môi trường được phân phối vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác Trình tự phân phối gồm các bước sau:

Bước 1: Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua

phễu thuỷ tinh vào các dụng cụ

Bước 2: Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường.

Bước 3: Tay phải kẹp nút bông và kéo ra.

Bước 4: Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ, hơ miệng dụng cụ

dưới ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông lại

Lưu ý:

- Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì

lượng môi trường cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm

- Đối với bình cầu hay bình tam giác: Lượng môi trường được phân

phối chiếm 1/2 - 1/3 thể tích của bình

- Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc

2.1.4.1 Làm thạch nghiêng, thạch đứng

Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi

trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc Sau khi phân phối 1/4 thể tích môi trường vào ống nghiệm, nhẹ nhàng đặt nghiêng ống nghiệm 1

Làm thạch đứng: Đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch

đứng vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc

2.1.4.2 Phân phối môi trường vào đĩa petri

Toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy

vô trùng hoặc dưới ngọn lửa đèn cồn

Trang 34

Bước 1: Hé mở nắp đĩa petri dưới ngọn lửa đèn cồn, từ từ đổ môi

trường vào đĩa sao cho thể tích tràn 2/3 đĩa sau đó xoay nhẹ cho toàn bộ môi trường trải đều trên bề mặt đĩa

Bước 2: Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để

hạn chế sự nhiễm khuẩn

Bước 3: Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm

Thông thường cứ 1/4 lít môi trường có thể phân phối được

22 - 25 đĩa petri

Bước 4: Sau khi đổ môi trường vào đĩa petri, 1 - 2 ngày sau, kiểm

tra lại xem môi trường có bị nhiễm khuẩn không rồi mới

Hình 2.1: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm

2.1.5 Bảo quản và kiểm tra môi trường

Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác

Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người

loại bỏ các ống có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu

Trang 35

2.1.6 Các phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng

2.1.6.1 Nguyên tắc

Khử trùng môi trường dinh dưỡng nhằm mục đích: Tiêu diệt toàn bộ

vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường; tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy chính xác

Do đó, khi khử trùng môi trường phải đảm bảo một số điều kiện như sau:

- Không làm biến tính môi trường

- Sau khi khử trùng, trong môi trường không sản sinh ra các chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy

- Phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng

- Bảo đảm an toàn đối với người sử dụng

2.1.6.2 Một số phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng

Phương pháp khử trùng được sử dụng chủ yếu để khử trùng môi trường là dùng nồi hấp tiệt trùng (Autoclave).Thời gian tiệt trùng phụ thuộc vào khối lượng môi trường đem đi tiệt trùng, thường kéo dài từ 20 –

sẽ có những điều kiện khử trùng khác nhau

Trang 36

Bước 2: Khuấy cho tan hỗn hợp sau đó thêm lượng nước theo yêu

cầu Đưa vào bình tam giác, sau đó đậy lại bằng nút bông

và bọc giấy bạc

Bước 3: Hấp tiệt trùng ở 1210C; 15 phút

Bước 4: Lấy môi trường ra khỏi máy hấp tiệt trùng và để nguội tới

Lưu ý: Nếu thạch bị nguội và đông tụ thì phải cho vào lò vi sóng để

hâm nóng thạch và tiếp tục thực hành thí nghiệm

Trang 37

2.4.2 Thí nghiệm 2: Phân phối môi trường vào ống nghiệm (thạch đứng, thạch nghiêng)

Bước 3: Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ (1/2 ống), hơ miệng

dụng cụ dưới ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông của dụng

cụ chứa môi trường và ống nghiệm

Bước 4: Nhẹ nhàng đặt ống nghiệm thạch đứng vào khay đựng

Bước 3: Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ (1/3 ống), hơ miệng

dụng cụ dưới ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông của dụng

cụ chứa môi trường và ống nghiệm

Bước 4: Nhẹ nhàng đặt nghiêng ống nghiệm thạch nghiêng 1 góc

200 - 300

Bước 5: Để thạch đông lại rồi cho vào thiết bị nuôi cấy vi sinh vật.

2.5 CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1: Liệt kê các loại môi trường dựa trên: Thành phần và nguồn

Trang 38

2.6 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO

2 (phần phụ lục)

Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học

Trang 39

BÀI THỰC HÀNH SỐ 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT

Mục tiêu bài thực hành số 3: Sau khi học xong bài này, sinh viên có

khả năng:

• Trình bày được khái niệm phân lập vi sinh vật

• Trình bày được các phương pháp phân lập vi sinh vật

• Thực hiện được phương pháp cấy ria phân lập vi sinh vật

3.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT

3.1.1 Khái niệm

Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Vi sinh vật

ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu.Trong tự nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết

Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật; nuôi cấy các tế bào

trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau

3.1.2 Kỹ thuật phân lập vi sinh vật thuần khiết

Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau:

Bước 1: Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật

ban đầu

Bước 2: Phân lập vi sinh vật thuần khiết.

Bước 3: Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc.

Trang 40

Trong bài thí nghiệm này, người học sẽ được thực hành kỹ thuật tách riêng rẽ các khuẩn lạc từ quần thể vi sinh vật trên môi trường phân lập Mỗi khuẩn lạc tượng trưng cho một cụm sinh khối của vi khuẩn có thể nhìn thấy được bằng mắt thường và phát triển trên bề mặt thạch Sau khi đã tách được các khuẩn lạc riêng lẻ, chúng sẽ được cấy chuyền trong điều kiện vô trùng vào môi trường thạch dinh dưỡng để tạo ra các vi sinh vật thuần khiết

và duy trì nguồn giống

Kỹ thuật tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên môi trường phân lập

Kỹ thuật pha loãng mẫu

Khi mẫu vi sinh vật đậm đặc, ta cần pha loãng để dễ dàng xác định

số lượng vi sinh vật Ta pha loãng theo sơ đồ sau:

Phương pháp pha loãng vi sinh vật

Kỹ thuật cấy ria

dinh dưỡng là kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri Sự lặp đi lặp lại của các đường nét cấy ria khiến cho mật độ vi khuẩn giảm dần và có nhiều vi khuẩn bị loại

bỏ cho đến khi các VSV riêng biệt được lắng đọng trên môi trường thạch

Định dạng
Số trang	87
Dung lượng	3,71 MB