(LUẬN văn THẠC sĩ) NGHIÊN cứu PHÂN lập, xác ĐỊNH cấu TRÚC và TÍNH CHẤT PHỔ của hợp CHẤT TÁCH từ cây lá GIANG (aganonerion polymorphum pierre ex spire) THUỘC họ TRÚC đào (apocynaceae) ở BÌNH ĐỊNH

PHAN THỊ KIỀU DUYÊN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT PHỔ CỦA HỢP CHẤT TÁCH TỪ CÂY LÁ GIANG Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire THUỘC HỌ TRÚC ĐÀO Apocynaceae Ở BÌ

PHAN THỊ KIỀU DUYÊN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT PHỔ CỦA HỢP CHẤT TÁCH TỪ CÂY

LÁ GIANG (Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire)

THUỘC HỌ TRÚC ĐÀO (Apocynaceae) Ở BÌNH ĐỊNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Bình Định, 2019

PHAN THỊ KIỀU DUYÊN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT PHỔ CỦA HỢP CHẤT TÁCH TỪ CÂY

LÁ GIANG (Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire)

THUỘC HỌ TRÚC ĐÀO (Apocynaceae) Ở BÌNH ĐỊNH

Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý

Người hướng dẫn 1: TS Diệp Thị Lan Phương Người hướng dẫn 2: TS Nguyễn Lê Tuấn

Bình Định, 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Diệp Thị Lan Phương và TS Nguyễn Lê Tuấn

Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này trung thực và chưa từng công bố dưới bất kỳ hình thức nào

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Học viên

Phan Thị Kiều Duyên

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại Khoa Hóa - Trường Đại học Quy Nhơn Trong thời gian thực hiện luận văn, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo tâm huyết, nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn

bè

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Diệp Thị Lan Phương, TS Nguyễn Lê Tuấn và NCS Hồ Văn Ban đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn tốt nghiêp

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa Hóa, trường Đại học Quy Nhơn đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện luận văn Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn, các anh chị em tập thể lớp Cao học Hóa K20 trường ĐH Quy Nhơn đã luôn hỗ trợ, động viên trong suốt thời gian qua Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Mặc dù đã rất cố gắng trong thời gian thực hiện luận văn, nhưng vì còn hạn chế về kiến thức cũng như thời gian, kinh nghiệm nghiên cứu nên không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ý kiến đóng góp quý báu từ quý thầy cô để luận văn của em được hoàn thiện hơn

Em xin trân trọng cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC HÌNH VII DANH MỤC CÁC BẢNG IX

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Giới thiệu thực vật 5

1.1.1 Giới thiệu về họ Trúc Đào (Apocynaceae) 5

1.1.2 Mô tả về Lá giang (Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire) 5

1.1.3 Công dụng của cây Lá giang trong y học và đời sống 7

1.2 Giới thiệu các lớp chất có trong thực vật 9

1.2.1 Terpene và Terpenoid 9

1.2.2 Steroid 11

1.2.3 Alkaloid 12

1.2.4 Flavonoid 13

1.2.5 Hợp chất phenol 14

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 16

2.1 Phương pháp nghiên cứu 16

2.1.1 Phương pháp chiết 16

2.1.2 Phương pháp định tính các lớp chất có trong lá của cây Lá giang 19

2.1.3 Phương pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết từ lá cây Lá giang 20

2.1.4 Phương pháp sắc ký 21

2.1.5 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất phân lập 25

2.1.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm 27

2.2 Hóa chất và thiết bị 28

2.2.1 Hóa chất 28

2.2.2 Thiết bị 29

2.3 Thực nghiệm 29

2.3.1 Nguyên liệu 29

2.3.2 Đánh giá thành phần cao chiết MeOH từ lá cây Lá giang 30

2.3.3 Đánh giá thành phần cao chiết EA từ lá cây Lá giang 30

2.3.4 Định tính các lớp chất 31

2.3.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết MeOH 32 2.3.6 Nghiên cứu phân lập hợp chất từ cao chiết EA 35

2.3.7 Thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 38

3.2 Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học từ cao chiết MeOH và EA 38

3.3 Định tính các lớp chất chính có trong lá của cây Lá giang 42

3.3.1 Phát hiện triterpenoid 42

3.3.2 Phát hiện alkaloid 43

3.3.3 Phát hiện hợp chất phenol 43

3.3.4 Phát hiện Steroid 44

3.3.5 Phát hiện flavonoid 45

3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh đến hiệu suất thu cao chiết MeOH của lá cây Lá giang 46

3.4.1 Phương pháp ngâm chiết 46

3.4.2 Phương pháp chiết soxhlet 49

3.4.3 Phương pháp chiết siêu âm 51

3.5 Nghiên cứu phân lập hợp chất từ cao chiết ethyl acetate 56

3.6 Xác định cấu trúc và tính chất phổ của chất rắn phân lập 59

3.6.1 Phổ 1H NMR của chất rắn thu được 59

3.6.2 Phổ 13 C NMR của chất rắn thu được 62

3.6.3 Phổ DEPT của chất rắn thu được 64

3.6.4 Phổ MS của chất rắn thu được 65

3.7 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm của cao chiết MeOH 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement

by Polarisation Transfer

Kỹ thuật xác định số proton đính với cacbon

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hoa, lá cây Lá giang 7

Hình 1.2 Một số terpene 10

Hình 1.3 Một số terpenoid 10

Hình 1.4 Bộ khung của steroid 11

Hình 1.5 Một số alkaloid 12

Hình 1.6 Bộ khung của flavonoid 13

Hình 2.1 Thiết bị chiết soxhlet 19

Hình 2.2 Mẫu sắc ký bản mỏng 22

Hình 2.3 Buồng soi UV 29

Hình 2.4 Máy cô quay chân không 29

Hình 2.5 Lá cây Lá giang tươi 29

Hình 2.6 Lá cây Lá giang khô 29

Hình 2.7 Chiết dịch nước với dung môi EA của lá cây Lá giang 31

Hình 2.8 Hệ thống chiết soxhlet dùng trong thí nghiệm 33

Hình 2.9 Thiết bị chiết siêu âm dùng trong thí nghiệm 34

Hình 2.10 Thiết bị sắc ký cột cao EA 35

Hình 2.11 Quy trình tách chiết hợp chất từ lá của cây Lá giang 36

Hình 3.1 Bột lá của cây Lá giang 38

Hình 3.2 Dịch chiết MeOH của lá cây Lá giang 39

Hình 3.3 Cao chiết MeOH của lá cây Lá giang 39

Hình 3.4 Cao chiết EA của lá cây Lá giang 40

Hình 3.5 TLC của cao chiết MeOH hiện UV (a) và hiện màu với Ce(SO4)2 (b) 40

Hình 3.6 TLC của cao chiết EA hiện màu với Ce(SO4)2 41

Hình 3.7 Kết quả định tính triterpenoid bằng thuốc thử Liebermann - Burchard 42

Hình 3.8 Kết quả định tính alkaloid bằng thuốc thử Wagner 43

Hình 3.9 Kết quả định tính các hợp chất phenol bằng thuốc thử FeCl3 44

Hình 3.10 Kết quả định tính Steroid bằng phản ứng Salkowski 45

Hình 3.11 Kết quả định tính các hợp chất Flavonoid 45

Hình 3.12 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột lá cây Lá giang (g) : thể tích MeOH (mL) đến hàm lượng cao chiết MeOH trong ngâm chiết 47

Hình 3.13 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hàm lượng cao chiết MeOH 49

Hình 3.14 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian đun mẫu đến hàm lượng cao chiết MeOH trong chiết soxhlet 50

Hình 3.15 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột lá cây Lá giang (g) : thể tích MeOH (mL) đến hàm lượng cao chiết MeOH trong chiết siêu âm 52

Hình 3.16 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng cao chiết MeOH trong chiết siêu âm 54

Hình 3.17 Cao chiết EA đã được tẩm silica gel 57

Hình 3.18 Các chất ở phân đoạn 3 57

Hình 3.19 TLC của phân đoạn 3 chạy cột lần thứ nhất 58

Hình 3.20 TLC của chất rắn sạch 58

Hình 3.21 Quy ước đánh số trong công thức của methyl-3,4-dihydroxybenzoate 59

Hình 3.22 Phổ 1H NMR của chất rắn phân lập trong CD3OD 60

Hình 3.23 Phổ 1H NMR của chất rắn phân lập kéo giãn đoạn 7,5 - 6,8 ppm 61 Hình 3.24 Sơ đồ tương tác spin - spin của 3 proton ở C-2, C-5, C-6 61

Hình 3.25 Phổ 13C NMR của chất rắn phân lập trong CD3OD 63

Hình 3.26 Phổ DEPT của chất rắn phân lập trong CD3OD 65

Hình 3.27 Phổ MS của chất rắn phân lập 66

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học và tên thông thường một số hợp chất phenol loại

C6C1, C6C3 14Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột lá cây Lá giang và thể tích MeOH đến hàm lượng cao chiết trong ngâm chiết 47Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hàm lượng cao chiết 48Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đun mẫu đến hàm lượng cao chiết 50Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng bột lá cây Lá giang và thể tích dung môi MeOH đến hàm lượng cao chiết trong chiết siêu âm 52Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng cao chiết 53Bảng 3.6 So sánh các yếu tố ảnh hưởng của cả 3 phương pháp 55Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H NMR của chất rắn thu được và số liệu tham khảo 62Bảng 3.8 Số liệu phổ 13C NMR của chất rắn phân lập và các tài liệu tham khảo 64Bảng 3.9 Kết quả phổ MS của chất rắn phân lập và công thức của mảnh ion 65Bảng 3.10 Kết quả kháng vi khuẩn và nấm của cao chiết MeOH 67

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hiện nay, vấn đề ô nhiễm môi trường đang rất được quan tâm và đưa ra thảo luận ở các diễn đàn trên toàn cầu Ô nhiễm môi trường đã và đang gây ra những ảnh hưởng vô cùng xấu đến sức khỏe con người và sự sinh tồn của động - thực vật trên toàn thế giới Một trong những yếu tố gây ô nhiễm phải

kể đến là việc sử dụng dư thừa thuốc bảo vệ thực vật Việc sử dụng lượng dư thuốc bảo vệ thực vật không chỉ gây ảnh hưởng đến môi trường mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của con người, gây ra nhiều bệnh tật Do đó, xu hướng của con người là hướng đến sử dụng các loại thực phẩm sạch Các loại thuốc điều trị bệnh hiện nay cũng được các nhà khoa học quan tâm là các loại dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, không ô nhiễm, mang lại an toàn cho người sử dụng

Lá giang (Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire) thuộc họ Trúc

Đào (Apocynaceae) còn có tên gọi giang chua, dây dang [1] Nó thuộc loại dây leo, có mủ trắng, thường mọc nơi đất trống, các trảng cây bụi và rất nhiều

ở các rẫy vườn trên núi [8] Loài cây này phân bố ở Đông Dương, Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Campuchia và Việt Nam [8, 14, 22] Ở Việt Nam, cây mọc

ở nhiều nơi thuộc các tỉnh miền Trung và vùng đồng bằng sông Cửu Long Ở Nam Bộ, Lá giang thường mọc hoang ven sông, rạch, trong vườn cây, được dùng làm rau và làm thuốc Lá giang được sử dụng rộng rãi trong các bữa ăn hằng ngày của người dân Việt Nam Hiện nay, Lá giang được trồng chuyên làm nguồn rau sạch, đặc sản ở một số vùng miền, trong đó có Bình Định

Ở Bình Định, Lá giang mọc hoang trên các rẫy núi và cũng được người dân trồng rất nhiều Lá giang có vị chua, nên được dùng để nấu canh chua Canh chua có thể nấu với thịt gà, thịt bò, cá và là đặc sản được ưa thích của người dân Hiện nay, theo tìm hiểu của chúng tôi, cây Lá giang là cây thuộc

đặc trưng riêng vùng miền nên rất ít công trình nghiên cứu về nó, đặc biệt là chưa thấy công trình nào công bố về thành phần hóa học của cây Lá giang

(Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire) Do vậy, việc nghiên cứu phân

lập được hợp chất là đóng góp mới vào thành phần hóa học của cây Lá giang

(Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire) nói riêng và của họ Trúc Đào (Apocynaceae) nói chung Chính vì những lý do trên chúng tôi chọn đề tài:

“Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và tính chất phổ của hợp chất

tách từ cây Lá giang (Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire) thuộc

họ Trúc Đào (Apocynaceae) ở Bình Định”

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập được hợp chất, xác định cấu trúc và tính chất phổ của chất phân

lập được từ lá cây Lá giang (Aganonerion polymorphum)

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu: Hợp chất được phân lập từ lá của cây Lá giang

ở huyện Tuy Phước, Bình Định, Việt Nam

 Phạm vi nghiên cứu: Cấu trúc và tính chất phổ của hợp chất được

phân lập từ lá cây Lá giang

4 Phương pháp nghiên cứu

- Tổng hợp và thu thập tài liệu liên quan đến đề tài

- Phương pháp phân lập: Chiết gián đoạn và chiết liên tục để trích ly hợp chất trong lá cây Lá giang

- Phương pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thucao chiết MeOH từ Lá giang

- Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và nấm của cao chiết MeOH

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Việc định tính các lớp chất nhằm tìm hiểu sơ bộ các lớp chất có trong Lá giang từ đó định hướng việc chiết tách phân lập chất sau này

Việc phân lập và xác định được cấu trúc hợp chất là một đóng góp mới

về thành phần hóa học của Lá giang, tạo cơ sở cho các nghiên cứu sau này Vì vậy, đề tài có ý nghĩa khoa học Ngoài ra, việc phân tích cấu trúc phổ của hợp chất và việc định tính các lớp chất có thể giúp cho việc giảng dạy, học tập và thực hành môn Hóa học các hợp chất thiên nhiên, môn Phương pháp phổ

6 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài

Hiện nay, trên thế giới và trong nước đã có nhiều nghiên cứu và công bố

về cây thuộc họ Trúc Đào Tuy nhiên, theo tìm hiểu của chúng tôi, hiện chưa

thấy có công bố nào về phân lập hợp chất của cây Lá Giang (Aganonerion

polymorphum) Các công trình nghiên cứu về họ Trúc Đào có thể kể đến như

sau:

a Nghiên cứu trong nước

Từ lá cây Trúc Đào, lần đầu tiên Đỗ Tất Lợi đã phân lập được hợp chất oleandrin vào năm 1955 đến năm 2006, tác giả đã nghiên cứu và công bố có 4 glycoside có trong lá Trúc Đào: Oleandrin, neriin, neriantin, adynerin [5]

Từ năm 2011 đến 2016, nhóm tác giả Nguyễn Tiến Vững đã nghiên cứu phân lập được rất nhiều hợp chất có trong lá, vỏ và hoa của cây Trúc Đào Đặc biệt, theo công bố vào năm 2016 đã tách được 4 hợp chất từ vỏ thân cây Trúc Đào như: Acid 3β,27-dihydroxyurs-12-en-28-oic, neriasid, oleandrin và β-sitosterol [2, 3, 4, 9, 10]

b Nghiên cứu ngoài nước

Hiện nay, trên thế giới, theo tìm hiểu của chúng tôi có khoảng 253 công trình nghiên cứu về họ Trúc Đào Các công trình nghiên cứu liên quan đến phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học có thể kể đến như sau:

Năm 1953, Goutarel, R và Janot, M M lần đầu tiên đã phân lập được Ibolutein từ dịch chiết của iboga (họ Apocynaceae) [16]

Năm 1975, Szostak, H Szostak, H và Kowalewski, Z đã phân lập được

5 flavonoid từ lá của cây Vinca minor L thuộc họ Trúc Đào: Kaempferol rhamnogluco-7-glucoside (A), kaempferol 3-rhamnogluco-7-galactoside (B), quercetin 3-rutino-7-glucoside (D), quercetin 3-rhamnogluco-7-glucoside (E), isorhamnethin glucorhamnoside (C) [29]

3-Theo Y học cổ truyền ở Thái Lan, đã kết hợp 17 loại cây thuộc họ Trúc Đào với 16 loại kháng sinh thông thường để chống lại các vi khuẩn Gram (-)

(Acinetobacter baumannii) [26] Các nghiên cứu về dịch chiết ethanol và dịch

nước của vỏ cây Alstonia boonei (họ Apocynaceae) có hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, hạ sốt, giảm đau [12, 24]

Theo Shiyuan Wen và cộng sự (2016), có 109 Cardenolides - một loại steroid được tách từ các chi Nerium, Thevetia, Cerbera, Apocynum và Strophanthus thuộc họ Apocynaceae có khả năng chống ung thư [27]

Mới đây nhất, năm 2019, Krengel, F và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống ung thư của các alkaloid: Ibogamine, Voacangine và Ibogaine được chiết xuất và chuyển hóa từ 2 loài Tabernaemontana (họ Apocynaceae) [20]

Từ các kết quả cho thấy có nhiều loài thuộc họ Trúc Đào rất có tiềm năng

trong đời sống Loài Aganonerion polymorphum là loài cây mang đặc trưng

riêng vùng miền, do vậy, theo tìm hiểu của chúng tôi, chưa tìm thấy công trình nào công bố về thành phần hóa học và hoạt tính của nó Do đó, đề tài là cơ sở định hướng để tìm hiểu và tiến hành phân lập các hợp chất thuộc loại cây này

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu thực vật

1.1.1 Giới thiệu về họ Trúc Đào (Apocynaceae)

Họ Trúc Đào thường là cây gỗ, bụi, phần lớn là dây leo hoặc cỏ Cây có nhựa mủ trắng, lá đơn, nguyên, mọc đối hay mọc vòng, không lá kèm (ít khi mọc cách) Họ Trúc Đào là họ lớn với hơn 2000 loài và gần 200 chi, phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ở Trung Quốc, có khoảng 44 chi

và 145 loài, trong đó chỉ có 1 chi và 38 loài là đặc hữu, được phân bố chủ yếu phía nam và tây nam Trung Quốc [21] Ở nước ta, hiện biết được 50 chi, 170 loài, trong đó có nhiều cây có ý nghĩa vì chứa alkaloid và glycoside làm thuốc chữa bệnh tim và huyết áp cao [17, 35] Thành phần hóa học trong các cây thuộc họ Trúc Đào rất phong phú gồm polyphenol, saponin, flavonoid, sterol, coumarin, tamin, alkaloid, glycoside,… [17, 31, 34], và rất nhiều chất có hoa ̣t tính khác

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu tìm ra các hợp chất ở các loài khác nhau thuộc họ Trúc Đào có khả năng trị bệnh: Làm thuốc giảm đau, thuốc hạ sốt, chống oxy hóa, chống viêm, chống loét, chống viêm tiết niệu, chống sốt rét, chống đông máu, chống co thắt, kháng khuẩn, hạ đường huyết, chống ung thư, chống HIV… [11, 13, 15, 18, 23, 32, 33]

1.1.2 Mô tả về Lá giang (Aganonerion polymorphum Pierre ex Spire)

Cây Lá giang là cây mọc hoang dại ở ven rừng, ven suối, ven sông trong các quần hệ thứ sinh, có khi gặp ở nương rẫy, đồi cây bụi, nơi có nhiều ánh sáng, họ dây leo có mủ trắng, lá đơn, hình trứng mọc đối, có vị chua dịu Thân cây Lá giang là loại dây leo dài 1,5 - 4 m, nhẵn, có ít nhựa mủ trắng Thân bò trên cây sống hoặc cây chết hoặc thảm thực vật xanh Hoa ra vào khoảng tháng năm âm lịch, màu đỏ hoặc trắng, xếp 2 - 5 cái một thành chùm

ngắn, nhiều noãn Hoa màu trắng phớt hồng, khi quả già tách ra mỗi hạt có túm lông nhờ gió phát tán bay đi mọc cây non, cây thường mọc quấn phủ

Lá có màu xanh lục, phiến mỏng, hình trái xoan ngọn giáo, đầu nhọn sắc, gốc hình tim hoặc tù ở gốc, mặt trên có màu sáng hơn, dài 3,5 - 10 cm, rộng 2 - 5

cm, có mủ trắng, vị chua dịu Quả gồm hai quả đại hình dải, thẳng hay cong,

rẽ đôi, màu đen nhạt, khía rãnh dọc Hạt dài 3 - 4 mm, màu nâu, thuôn, có chùm lông mềm màu hung ở đỉnh Lá giang có nguồn gốc từ vùng Đông Nam

Á và được sử dụng trong y học và làm thực phẩm Đây là loài dây leo thường sống ven sông rạch thuộc vùng Đông Nam Á, lá được dùng để nấu canh chua Loài cây này phân bố ở Trung Quốc, Lào, Campuchia và Việt Nam Ở Việt Nam, cây mọc ở nhiều nơi thuộc các tỉnh miền Trung và vùng đồng bằng sông Cửu Long Ở Nam Bộ, Lá giang thường mọc hoang ven sông, rạch, trong vườn cây, được dùng làm rau và làm thuốc Hiện nay dây giang được trồng chuyên làm nguồn rau sạch đặc sản ở một số hộ nông dân [30, 36]

Lá giang còn có tên gọi khác: Cây giang chua, dây giang

Tên tiếng Anh: Sour-soup creeper, River-leaf creeper

Tên khoa học: Aganonerion polymorphum Pierre

Phân loại thực vật

+ Bộ (ordo): Long đởm (Gentianales);

+ Họ (familia): Trúc Đào (Apocynaceae);

+ Phân họ (subfamilia): Trúc Đào (Apocynoideae);

+ Tông (tribus): Trúc Đào (Apocyneae);

+ Chi (genus): Lá giang (Aganonerion);

+ Loài (species): Aganonerion polymorphum

 Thành phần hóa học

Trong 100 g lá có 85,3 g nước; 3,5 g protein; 3,5 g glucid; 0,6 mg carotein; 26 mg vitamin C Là một loài cây có dược tính cao, chất saponin trong Lá giang có tính kháng sinh với các chủng khuẩn Salmonalla typhi và Klebsiella

Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong Lá giang có nhiều Saponin, flavonoid, sterol, coumarin, tamin, chất béo, acid hữu cơ và 12 nguyên tố vi lượng [36, 37]

Hiện nay, thành phần hóa học của Lá giang (Aganonerion) chưa được công bố cả trong nước và trên thế giới Vì vâ ̣y, viê ̣c nghiên cứu này của đề tài

sẽ đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hoá ho ̣c của chúng

Hình 1.1 Hoa, lá cây Lá giang

1.1.3 Công dụng của cây Lá giang trong y học và đời sống

Lá cây Lá giang dùng làm rau sống: Đọt và lá non được dùng để ăn sống hay bóp gỏi, có vị chua nhẹ rất hợp khầu vị

Lá cây Lá giang dùng để xào: Đọt và lá non được dùng để xào với thịt trâu, bò, gà, vịt…

Lá cây Lá giang dùng để nấu canh chua, nhúng lẩu: Đọt và lá non được dùng để nấu canh chua với cá đồng, tôm, cua và để nhúng lẩu chua ăn rất hấp dẫn

Nước ép lá cây Lá giang dùng để giải nhiệt, giải độc: Người ta cho là cây

Lá giang có tác dụng giải nhiệt tốt Cũng có thể giã nát, lấy nước uống Có nơi người ta dung lá cây Lá giang giã lẫn với lá khoai lang, chế nước uống chữa ngộ độc sắn (mì)

Theo Đông y, lá cây Lá giang có vị chua, tính mát; vào kinh can; có tác dụng thanh nhiệt, tiêu viêm, sát khuẩn, chỉ khát Thân cây có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, chỉ khát, bài thạch Lá giang là cây thuốc dân gian, dùng chữa ăn uống không tiêu, bụng đầy trướng, đau dạ dày, đau nhức xương khớp Dùng ngoài chữa mụn nhọt, lở ngứa ngoài da Dùng làm thực phẩm có vị chua khi chế biến các món ăn (cá, thịt) Thân Lá giang làm thuốc chữa sỏi tiết niệu, viêm đường tiết niệu, viêm thận mạn tính Đặc biệt,

nó còn có tác dụng chữa viêm đường tiết niệu, có sỏi, viêm thận mạn tính, viêm ruột, phong thấp, sưng tấy Về mặt sinh học, ở vùng Bắc Thái Lan đã nghiên cứu cao lỏng Lá giang được chiết xuất không thấy có độc tính, có tác dụng ức chế 9 loại vi khuẩn, tiêu viêm cấp tính cả khi uống và tiêm [25, 31, 36]

* Một số bài thuốc từ Lá giang theo y học cổ truyền ở Việt Nam:

- Chữa viêm đường tiết niệu và có sỏi: Thân Lá giang (hoặc lá) từ 100 g đến 200 g, sắc uống nhiều lần trong ngày, uống với liệu trình 15 ngày hoặc thân lá giang 10 - 20 g, hãm uống thay trà

- Chữa ăn không tiêu, bụng trướng đầy: Lá giang 30 - 50 g, sắc uống Đơn thuốc này uống liên tục chữa được sỏi và viêm đường tiết niệu

- Chữa đau nhức xương khớp, đau dạ dày: Rễ hoặc lá 20 - 40 g, sắc uống; thường kết hợp với một số vị thuốc trị đau khác

- Chữa mụn nhọt, lở ngứa ngoài da, vết thương: Lá tươi rửa sạch, giã nát, đắp lên vết thương

- Bổ hư tổn, khu phong trừ thấp, cường kiện cân cốt; phòng chữa viêm đường tiết niệu với các triệu chứng đái dắt, đái buốt: Cá chuồn 3 - 5 con, Lá giang 100 g Cá chuồn bỏ vảy, chặt vây, cắt làm 2 - 3 khúc; lá được rửa sạch,

vò giập Nước đun sôi, cho cá vào, sau đó cho lá và bột canh (muối, mì chính), có thể thêm nắm gạo làm tăng phần đậm đặc của nồi canh Khi bắc ra cho thêm trái ớt đập giập

- Chữa viêm bàng quang bằng canh gà Lá giang (công dụng thanh nhiệt giải độc dùng cho các trường hợp lao thương khí huyết, phong hàn thấp tý; sản hậu băng huyết, huyết trắng, hội chứng lỵ xuất huyết, trĩ xuất huyết, suy nhược cơ thể): Gà 600 g, Lá giang 100 g, gia vị vừa đủ Gà rửa sạch, để ráo chặt miếng; Lá giang rửa sạch Cho thịt gà cùng 1 lít nước, đun sôi, vớt bọt, thêm mắm và gia vị vừa ăn Khi thịt gà chín mềm, cho lá đã vò nát vào, đun sôi; trước khi bắc ra thêm ít rau thơm vừa ăn

Cần lưu ý: Lá giang vị chua, có chứa acid tartric, không dùng Lá giang chữa bệnh khi đang bị đợt đau khớp do gút cấp vì có thể tăng lắng đọng acid gây đau tăng, không dùng chữa sỏi thận do lắng đọng acid vì uống dài ngày thì nước tiểu thiên về acid sỏi lớn thêm, không nên nấu canh lá giang ở nồi nhôm, nồi kim loại, nếu có nấu thì múc ra ăn ngay, nếu để lâu chất chua lá giang có thể ăn mòn kim loại gây độc [36]

1.2 Giới thiệu các lớp chất có trong thực vật

Các nhóm chất thường gặp trong thiên nhiên có trong thực vật, động vật,

vi sinh vật như: Lipid, acid amin, protein, carbohydrate, terpene, terpenoid, steroid, alkaloid, flavonoid, hợp chất phenol, tanin, [6, 7]

1.2.1 Terpene và Terpenoid

Terpen là tên gọi của một nhóm hydrocarbon, đa số không no thường có công thức chung (C5H8)n (n  2), hay gặp trong giới thực vật, nhất là trong các tinh dầu thảo mộc như tinh dầu thông, cam, sả, hoa hồng,

Terpene có cấu trúc hóa học dựa trên cơ sở các phân tử isoprene liên kết lại với nhau

-myrcen

-pinen -pinen Limonen

-caroten Hình 1.2 Một số terpene

Terpenoid là dẫn xuất chứa oxy của terpene do có các nhóm chức như hydroxyl, carbonyl, ester, carboxyl,

Hình 1.3 Một số terpenoid

Terpene và terpenoid tập trung nhiều ở các bộ phận khác nhau của cây như lá, thân, hoa, quả, rễ,… Nói chung, terpene và terpenoid thường có trong tinh dầu của thực vật

* Các thuốc thử đặc trưng để định tính terpenoid là các phản ứng như:

Liebermann - Burchard, Rosenhelm, Rosenthaler, Nolier

* Cách chiết tách terpenoid ra khỏi thực vật: Hầu hết các terpenoid là

những hợp chất ít phân cực, có tính thân dầu nên tan tốt trong ether dầu hỏa, hexane, diethyl ether, chloroform

Không có phương pháp đặc trưng nào chỉ để tách riêng terpenoid ra khỏi bột cây Sử dụng các dung môi hữu cơ nêu trên để tách chúng ra khỏi cây và tiếp theo sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột để tách riêng các hợp chất

1.2.2 Steroid

Steroid là những hợp chất có bộ khung 4 vòng của cyclopenta[a]phenantren với 3 vòng 6 cạnh và 1 vòng 5 cạnh Kí hiệu chữ cái

ở các vòng và quy luật đánh số các nguyên tử trong hợp chất steroid như sau:

+ 4 vòng trong bộ khung steroid được kí hiệu bằng các chữ cái in A, B,

C, D

+ Các nguyên tử carbon được đánh số theo thứ tự từ vòng

ABCD

Hình 1.4 Bộ khung của steroid

Steroid được tách chiết từ tủy sống và mật của động vật có sừng, từ dịch

thuỷ phân kiềm của sự lên men, từ dầu thực vật, mỡ động vật, từ chất thải của

công nghiệp giấy, từ loài thực vật khác nhau hoặc tổng hợp từ các nguyên liệu

không phải nguồn gốc thiên nhiên

* Các thuốc thử đặc trưng để định tính steroid là các phản ứng như:

Liebermann - Burchard, Rosenthaler, Salkowski, Komarowsky, Nolier

* Cách chiết tách ra steroid khỏi thực vật: Hầu hết các steroid là

hydrocarbon có mang một số nhóm chức hydroxy (-OH), acetyl (-OAc), ether

(-O-), carbonyl (C=O, ester hoặc acid carboxylic), nối đôi (-C=C-) nên nói

chung chúng là những hợp chất có tính ít phân cực nên tan tốt trong ether dầu

hỏa, hexane, diethyl ether, chloroform ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng

kết hợp với các phân tử đường để tạo thành các glycoside

Không có phương pháp đặc trưng nào chỉ để tách riêng steroid ra khỏi bột cây Sử dụng các dung môi hữu cơ nêu trên để tách chúng ra khỏi cây và tiếp theo sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột để tách riêng các hợp chất

1.2.3 Alkaloid

Alkaloid nhóm hợp chất hữu cơ thiên nhiên chứa nitrogen, thường có nguồn gốc thực vật Có nhiều trong các cây họ Cà, họ Thuốc phiện, vv Alkaloid là những kiềm yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; đa số alkaloid là chất rắn, không màu, một số ít ở thể lỏng, tan trong ethanol, không tan hoặc ít tan trong nước Việc chiết xuất alkaloid cần phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những dung dịch kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh

Alkaloid gồm có alkaloid không chứa dị vòng nitrogen và alkaloid có chứa dị vòng nitrogen (pyrrolidine, pyridine, pyperidine, quinoline, isoquinoline )

Hình 1.5 Một số alkaloid

* Các thuốc thử thông dụng để định tính alkaloid là: Thuốc thử Mayer,

Dragendorff, Wagner Ngoài ra, có thể dùng thuốc thử khác để phát hiện các alkaloid đặc thù như thuốc thử Iodoplatinate dùng để phát hiện alkaloid có nitrogen trong vòng dị hoàn)

* Cách chiết tách alkaloid ra khỏi thực vật: Có 2 phương pháp để chiết

tách cũng như sơ chế các alkaloid ra khỏi bột cây khô

- Chiết tách alkaoid bằng dung môi hữu cơ: Bột cây được tẩm với dung dịch kiềm để chuyển đổi alkaoid ở dạng muối trở thành dạng base tự do, kế tiếp, bột cây tẩm này được chiết với một trong các dung môi hữu cơ như: Benzene, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate Và tiếp theo sử dụng các

kỹ thuật sắc ký cột, kết tinh để tách riêng các hợp chất

- Chiết tách alkaoid bằng dung dịch nước acid: Bột cây được chiết với methanol, đây là dung môi rất tốt có thể chiết hết tất cả các alkaloid ở dạng base tự do, alkaloid ở dạng muối, dạng glycoside - là những alkaloid phân cực mạnh, sau đó hòa với dung dịch acid loãng để tạo alkaloid dạng muối acetate, tan trong nước, chiết với một trong các dung môi hữu cơ chloroform, diethyl ether nhằm loại bỏ những hợp chất hữu cơ khác và tiếp theo sử dụng các phương pháp tinh chế (kết tinh trong dung môi) để tách được hợp chất

1.2.4 Flavonoid

Flavonoid (bắt nguồn từ tiếng Latin flavus nghĩa là màu vàng, màu của

flavonoid trong tự nhiên) là nhóm hợp chất phenolic đa vòng, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật Phần lớn các flavonoid có màu vàng, một số có màu xanh, tím, đỏ và cũng có một số flavonoid lại không có màu

Flavonoid có cấu tạo cơ bản là diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzene nối với nhau qua một dây có 3 nguyên tử carbon, nên thường được gọi là C6-

C3-C6 Một số trường hợp flavonoid có mạch 3 nguyên tử carbon hở, đa số mạch 3 nguyên tử carbon đóng vòng tạo nên dị vòng chứa oxy

Hình 1.6 Bộ khung của flavonoid

* Các thuốc thử để định tính sự hiện diện của flavonoid: Có thể dùng

thuốc thử khác nhau để phát hiện các flavonoid như dùng H2SO4 đậm đặc, dùng NaOH/ethanol 1%, dùng AlCl3/ethanol 1%, dùng acetate chì pha bão hòa với nước, dùng phản ứng Cyanidin của Wilstatter

* Cách chiết tách flavonoid ra khỏi thực vật: Không có một phương

pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan Các flavonoid glycoside thường dễ tan trong các dung môi phân cực Các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực Các dẫn xuất của flavon, flavonol có nhóm -OH tự do ở vị trí C-7 tan được trong dung dịch kiềm loãng Dựa trên cơ sở này có thể chọn dung môi chiết thích hợp

OCH3 OH OCH3 Acid sinapic Acid syrigic

OH OH OH Acid trihydrocinamic Acid galic

Phenylpropanoid là nhóm những hợp chất có bộ khung cơ bản gồm vòng

benzene liên kết trực tiếp với một dây có 3 carbon (C6C3) Hầu hết các hợp

chất này đều có hoạt tính sinh học

Phenylpropanoid cũng là thành phần của tinh dầu Số lượng tinh dầu loại

này trong tự nhiên không nhiều và phổ biến bằng tinh dầu terpenoid nhưng

chúng có giá trị kinh tế cao và có nhiều ứng dụng cho cuộc sống

* Các thuốc thử đặc trưng để định tính sự hiện diện của hợp chất

phenol: Để phát hiện các loại hợp chất phenol có thể sử dụng những thuốc thử

chung và có những thuốc thử riêng cho từng loại như: Dung dịch 4-nitroaniline, thuốc thử FeCl3, thuốc thử Millon… hoặc dùng vaniline, HCl

để phát hiện catechol, dùng acetate magnesium để phát hiện ra quinon, dùng

gelatine để phát hiện ra tanin…

* Các phương pháp chiết tách hợp chất phenol ra khỏi cây: Hợp chất

phenol có tính phân cực từ trung bình đến mạnh, tùy theo hợp chất có mang ít

hoặc nhiều nhóm chức hydroxy, carboxyl… Vì vậy, muốn chiết tách các hợp

chất này ra khỏi bột cây, cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần

như benzene, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, ethanol…

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ

THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp chiết

Chiết là phương pháp tách chất từ hỗn hợp bằng dung môi thích hợp Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh

Chiết trong hệ chất lỏng - lỏng: Nguyên tắc căn bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng không hòa tan vào nhau Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K

a b b

C

K =C

Ca là nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng

Cb là nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng

Mục đích của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ tinh chế hóa một hợp chất nào đó Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này

có hằng số phân bố lớn còn các tạp chất bản cũng như các chất khác có cấu trúc không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó

2.1.1.1 Phương pháp chiết gián đoạn (ngâm chiết)

Ngâm chiết là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình ngâm chiết là một dung

dịch của các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết Có ba quá rình quan trọng đồng thời cùng xảy ra trong ngâm chiết là: + Sự hòa tan của chất tan vào dung môi;

+ Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi;

+ Sự dịch chuyển các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật

Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, thời gian, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu ) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình ngâm chiết

Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp

Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol ) thì phải sử dụng các dung môi phân cực

Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpene

và steroid tự do ) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm, ngoài ra còn có thể dùng các dung môi khác để nghiên cứu như methanol, acetone, dichloromethan, hexane

2.1.1.2 Phương pháp chiết siêu âm

Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (16 - 20 kHz) Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc hay sóng nén, nghĩa là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo phương cùng với phương truyền của sóng

Các thông số của quá trình siêu âm:

Tần số là số dao động phần tử thực hiện được trong 1 giây, (Hz)

Biên độ biểu thị mức độ thay đổi áp suất (so với áp suất cân bằng của môi trường) trong quá trình dao động

Cường độ là năng lượng mà sóng siêu âm truyền trong một đơn vị thời gian qua một đơn vị diện tích đặt vuông góc với phương truyền âm Công thức tính:

P I S



Trong đó: P là công suất của nguồn âm (W)

S là diện tích miền truyền âm (m2)

Mức cường độ âm là đại lượng được tính bởi công thức:

Trong đó: I là cường độ âm tại điểm cần tính

I0 là cường độ âm chuẩn (âm ứng với tần số f = 1000 Hz) có giá trị là: 10 - 12 W/m2

+ Thiết bị sóng siêu âm

Thiết bị phát sóng siêu âm cũng phải gồm có 3 phần tối cần thiết sau:

Bộ phận chuyển phần lớn điện năng thành dòng điện xoay chiều tần số cao để vận hành bộ phận biến đổi

Bộ phận biến đổi chuyển dòng điện xoay chiều tần số cao thành những dao động Phần lớn thiết bị phát sóng siêu âm ngày nay sử dụng kỹ thuật áp điện Hình dạng và kích thước của bộ phận này phụ thuộc vào tần số làm việc,

bộ phận 20 kHz có chiều dài gấp đôi bộ phận 40 kHz Năng lượng qua bộ biến đổi sẽ chuyển ngược lại thành bình phương tần số dao động, vì vậy thiết

bị năng lượng cao tần số thấp được chú trọng Bộ phận biến đổi nối với hệ thống truyền sóng thông qua một thiết bị phụ

Hệ thống truyền sóng sẽ truyền những dao động vào trong lòng chất lỏng Trong thiết bị phát sóng siêu âm dạng bể, bộ phận biến đổi được gắn ở đáy bể và truyền trực tiếp dao động vào chất lỏng trong bồn Tuy nhiên, đối với thiết bị năng lượng cao (thiết bị dạng thanh/que) dao động được khuyếch đại và truyền vào môi trường lỏng nhờ thiết bị trung gian gắn với bộ phận biến đổi Theo thời gian, đầu của bộ phận trung gian này có thể bị mòn và bị giảm chiều dài cần thiết vì vậy người ta phải lắp đầu có thể tháo gỡ được

2.1.1.3 Phương pháp chiết soxhlet

Thiết bị dùng trong phương pháp chiết soxhlet được thể hiện trong Hình 2.1 Chiết soxhlet là quá trình chiết hồi lưu bằng các dung môi hữu cơ như ether ethylic, acetone, dichloromethan Chất cần chiết thường là những chất ít phân cực, vì vậy mà nó tan dễ dàng trong các dung môi hữu cơ Khi dung môi hữu cơ đi qua chất cần chiết (thực phẩm chẳng hạn) thì các chất này

sẽ tách ra và hóa hơi theo dung môi ở nhiệt độ cao Quá trình cứ diễn ra như vậy cho đến khi nào trong thực phẩm không còn chất béo nữa Tiếp đó đuổi hết dung môi hữu cơ còn lại là chất cần chiết

Hình 2.1 Thiết bị chiết soxhlet

2.1.2 Phương pháp định tính các lớp chất có trong lá của cây Lá giang

Xác định được các lớp chất có thể có trong cây Lá giang bằng phương pháp định tính, sử dụng các thuốc thử tương ứng các lớp chất [6]

2.1.3 Phương pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết từ lá cây Lá giang

Mặc dù các phương pháp xử lý có ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu suất thu cao chiết từ lá của cây Lá giang Tuy nhiên, trong quá trình trích ly có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết từ lá của cây Lá giang như: Nguyên liệu, dung môi, thời gian trích ly

+ Nguyên liệu

Kích thước của nguyên liệu: Mức độ phá vỡ của nguyên liệu ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết Kích thước nguyên liệu càng nhỏ thì bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi càng lớn, do đó hiệu suất thu cao chiết sẽ tăng lên Rõ ràng rằng, khi nguyên liệu càng nhỏ thì quá trình thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu sẽ nhanh hơn Ngoài ra, kích cỡ và hình dạng thích hợp, quá trình chuyển động của các phân tử trong dung môi sẽ dễ dàng hơn + Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi

Với khối lượng nguyên liệu ban đầu cố định, khi lượng dung môi ngày càng tăng lên, quá trình trích ly sẽ diễn ra nhanh chóng và lượng chất còn lại trong bã sẽ giảm Tuy nhiên nếu lượng dung môi quá lớn cũng không làm tăng sự thẩm thấu của dung môi và nguyên liệu, khi lượng dung môi đạt tới một thể tích nhất định thì hiệu suất cao chiết thu được sẽ không thay đổi, nếu tiếp tục tăng thể tích dung môi lên nữa thì chúng ta sẽ làm cho dung môi bị hao phí

+ Thời gian trích ly

Thời gian trích ly càng dài thì hiệu suất thu cao chiết sẽ càng cao vì thời gian tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng dài Tuy nhiên càng về sau thì chất trong bã càng giảm Do vậy nếu kéo dài thời gian trích ly thì hiệu suất thu cao chiết cũng không tăng được bao nhiêu mà làm cho chúng ta tốn kém

về mặt thời gian

2.1.4 Phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa trên sự phân bố không đồng đều của chúng giữa hai pha, một pha không chuyển động (gọi là pha tĩnh) và một pha chuyển động (gọi là pha động) [6]

2.1.4.1 Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)

Sắc ký bản mỏng gồm pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, pha tĩnh là chất hấp phụ (thường là siliaca gel hoặc nhôm oxit) được tráng thành lớp mỏng trên tấm nhôm hoặc kính Khi pha động chuyển động trên pha tĩnh kéo các chất di chuyển với những tốc độ khác nhau làm chúng dịch chuyển những đoạn đường khác nhau, sự khác nhau này đặc trưng bằng giá trị Rf

* Các bước thực hiện sắc ký bản mỏng

- Sắc ký lớp mỏ ng được thực hiện với bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), dày 0,25 mm, được cắt với chiều rộng thích hợp, dùng bút chì kẻ nhẹ một đường ngang cách mép dưới (tuyến xuất phát) khoảng 1cm, mép trên (tuyến dung môi) khoảng 0,2 - 0,3 cm Bản mỏng phải được sấy khô trước khi dùng

- Cho dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp vào bình triển khai sắc ký, đặt vào đó một mẫu giấy lọc rồi đậy kín bình, để yên ít phút đến khi dung môi trong bình ổn định

- Mẫu chất được pha loãng trong dung môi thích hợp, dùng mao quản nhỏ đưa chất lên bản mỏng sao cho vết chấm nhỏ và tròn ở tuyến xuất phát

- Dùng máy sấy sấy nhẹ để đuổi hết dung môi khỏi vệt chấm rồi đặt bản mỏng thẳng đứng hoặc lệch 75o so với phương nằm ngang vào bình triển khai sắc ký, chú ý sao cho dung môi trong bình triển khai nằm dưới vạch xuất phát

và đi lên đều Tiến hành triển khai sắc ký đến khi dung môi chạm đến vạch mép trên thì lấy bản mỏng ra

- Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và

365 nm hoặc dù ng thuốc hiện là dung di ̣ch ceri sulfat trong acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

Hình 2.2 Mẫu sắc ký bản mỏng

Cách tính: Rf =

0

LL(1) : Tuyến dung môi; (2): Vạch xuất phát

L : là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vệt

L0 : là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tuyến dung môi

2.1.4.2 Sắc ký cột (Column chromatography - CC)

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường là các hạt có kích thước lớn (50 - 150 µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt ở phía trên Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần phía dưới cột, được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn

ra cột Sắc ký cột có ưu điểm là các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với lượng lớn mẫu chất

- Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly

Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau

Với hai phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lượng phân tử lớn

sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên

di chuyển chậm hơn so với phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu trong cột hơn so với vài phân tử có tính phân cực nhưng có trọng lượng phân tử nhỏ Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng

để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp Sau khi chọn hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn Bởi vì silica gel tráng trên bản mỏng có kích cỡ nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên bằng áp lực lớn nên có độ chặt khít cao Trong khi đó, silica gel được dùng trong sắc ký cột với cỡ hạt lớn hơn lại được nạp vào ở

áp suất thường nên có tính lỏng lẻo hơn

Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì:

Chất hấp thu phải lớn hơn 25 - 50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký Chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ: Chiều cao chất hấp thu : đường kính trong của cột vào khoảng (10 : 1)

- Nạp chất hấp thu vào cột

Muốn tách riêng các hợp chất trong hỗn hợp một cách có hiệu quả nhất, chất hấp thu phải được nạp trong cột một cách đồng nhất để hạn chế những dãy xéo, bất thường

Kích cỡ hạt giữ vai trò quan trọng: Trong sắc ký cột hở, dung môi chảy

ra khỏi cột nhờ trọng lực, cho nên nếu sử dụng hạt hấp thu có kích cỡ hạt quá mịn, cột sẽ quá chặt, dung môi không thể chảy ra khỏi cột Để có thể có một vận tốc chảy có thể chấp nhận được, kích cỡ hạt chất hấp thu phải > 150 µm

* Nạp mẫu chất ở dạng bột khô

Nếu mẫu chất không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly,

Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột), thấm ướt phần bột silica gel Cho một lớp cát dày khoảng 3 - 6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột Cuối cùng cho dung môi vào đầy vào cột để bắt đầu giải ly

Giải ly cột: Việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một

số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung môi có lực mạnh hơn Trong suốt quá trình sắc ký, cần thay nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần (độ phân cực tăng dần) để có thể đuổi hết các cấu tử khác ra khỏi cột

Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm: Thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào dung môi cũ đang sử dụng

Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột Điều này được giải thích do alumin hoặc silica gel khi được xáo trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi, hơi sinh

ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột Cột gãy làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu, vì thế không tách tốt chất được

Vận tốc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp thu) cũng không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuyếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấu quá trình tách Thường thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly là khoảng 5 - 50 giọt/phút hoặc 1 - 2 cm/phút

Theo dõi quá trình giải ly cột: Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu,

quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau, đang tách xa nhau ra Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly ra khỏi cột Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau

Phương pháp thông dụng nhất lấy dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự Dung dịch trong những lọ hứng này sẽ được sắc ký trên cùng một bản mỏng Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn Đuổi dung môi ở áp suất thấp các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó

2.1.5 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất phân lập

Phương pháp chung để xác đi ̣nh cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác đi ̣nh giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại Chất tinh khiết sau khi phân lập được xác định các hằng số vật lý như: Màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, sau đó tiến hành ghi các phổ như:

2.1.5.1 Phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp MS đối với các hợp chất hữu cơ là

sự bắn phá các phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương,

hoặc phá vỡ các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử mang năng lượng cao:

Năng lượng bắn phá phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV, sự phá vỡ này phụ thuộc cấu tạo chất, phương pháp và năng lượng bắn phá  quá trình ion hóa Ion phân tử có số khối (m/z) kí hiệu là M+ Có nhiều phương pháp ion hóa khác nhau như va chạm electron, ion hóa proton, ion hóa trường, bắn phá ion, bắn phá nguyên tử nhanh Phương pháp phổ khối chính là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng chất đó

2.1.5.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1 H NMR, 13 C NMR, DEPT

Nguyên tắc: Cơ sở vật lí của cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên từ tính của hạt nhân: Tất cả các hạt nhân đều mang điện tích, một số hạt nhân có điện tích chuyển động quay xung quanh trục hạt nhân, chuyển động quay của điện tích này sinh momen từ (lưỡng cực) µ dọc theo trục hạt nhân Biểu thức của momen từ hạt nhân:

µ = γ.p

Trong đó: µ momen từ hạt nhân

γ tỉ số hồi chuyển, phụ thuộc vào bản chất hạt nhân

I: Số lượng tử spin hạt nhân

 µ = 0 (không tồn tại momen từ) khi I = 0

Do đó chỉ các hạt nhân có số khối (A) lẻ hay số hiệu nguyên tử (Z) lẻ có spin hạt nhân I ≠ 0, có thể cho hiện tượng NMR

Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin I ≠ 0 (thường là số spin I lẻ ( 1H,

13C, ) ở trạng thái cơ bản trong 1 từ trường ngoài (Bo), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo 2 hướng: Thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa 2 trạng thái này với 1 tỉ lệ xác định của 2 trạng thái (ở đây tạo ra 2I + 1 mức năng lượng của hạt nhân, cân bằng số hạt nhân ở mức năng lượng cao và ở trạng thái cơ bản), nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường) Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó

2.1.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm

a Hoạt tính kháng vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh

Hoa ̣t tính kháng vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh được thực hiê ̣n dựa trên phương pháp dãy nồng đô ̣ trên môi trường lỏng Đây là phương pháp thử hoa ̣t tính kháng vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh và nấm nhằm đánh giá mức đô ̣ kháng vi khuẩn

ma ̣nh yếu của các mẫu thử thông qua các giá tri ̣ thể hiê ̣n hoa ̣t tính là MIC (minimum inhibitor concentration - nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50% inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50%), MBC (minimum bactericidal concentration - nồng độ tối thiểu diê ̣t khuẩn)

b Các chủng vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh

Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm đi ̣nh gây bê ̣nh ở người:

- Bacillus subtilis (ATCC 6633): Là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bê ̣nh

- Staphylococcus aureus (ATCC 13709): Cầu khuẩn gram (+) gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm ho ̣ng, nhiễm trùng có mủ trên da và các

cơ quan nô ̣i ta ̣ng

- Lactobacillus fermentum (N-4): Vi khuẩn gram (+), là loa ̣i vi khuẩn đường ruô ̣t lên men có ích, thường có mă ̣t trong hê ̣ tiêu hóa của người và

- Salmonella enterica: Vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruô ̣t ở người và đô ̣ng vâ ̣t

- Candida albicans (ATCC 10231): Là nấm men, thường gây bê ̣nh tưa lưỡi ở trẻ em và các bê ̣nh phu ̣ khoa

c Môi trường nuôi cấy

MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabourand - 2% dextrose broth) và SA (Sabourand - 4% dextrose agar) cho nấm

2.2.2 Thiết bị

- Đèn soi tử ngoại CM - 24 gồm đèn hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Máy cô quay chân không EYELA N - 1200AV - WD Nhật Bản

- Bể siêu âm Elmasonic S 30H

- Phổ khối lượng được đo trên máy LC-MS-Trap-SL tại Viện Hóa học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR, 13C NMR, DEPT, được đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR Spectromter, BRUCKER 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.5 Lá cây Lá giang tươi Hình 2.6 Lá cây Lá giang khô