(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu sự biến động một số chất có hoạt tính thẩm thấu và enzyme chống oxy hóa của đậu xanh (vigna radiatal ) trong điều kiện gây hạn và phục hồi

Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non .... Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

NGUYỄN THỊ THU VIÊN

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG MỘT SỐ CHẤT CÓ HOẠT TÍNH THẨM THẤU VÀ ENZYME CHỐNG

OXY HÓA CỦA ĐẬU XANH (Vigna radiata L.)

TRONG ĐIỀU KIỆN GÂY HẠN VÀ PHỤC HỒI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Bình Định - Năm 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

NGUYỄN THỊ THU VIÊN

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG MỘT SỐ CHẤT CÓ HOẠT TÍNH THẨM THẤU VÀ ENZYME CHỐNG

OXY HÓA CỦA ĐẬU XANH (Vigna radiata L.)

TRONG ĐIỀU KIỆN GÂY HẠN VÀ PHỤC HỒI

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Người hướng dẫn: TS TRƯƠNG THỊ HUỆ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà tôi đã thực hiện dưới

sự hướng dẫn khoa học của TS Trương Thị Huệ Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kì công trình nào khác

Bình Định, tháng 8 năm 2019

Nguyễn Thị Thu Viên

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi

đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp

đỡ, động viên của bạn bè và đồng nghiệp

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Trương Thị Huệ đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Tự nhiên, các giảng viên đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi và các cán bộ, nhân viên phòng thí nghiệm thực hành đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Bình Định, tháng 8 năm 2019

Người thực hiện

Nguyễn Thị Thu Viên

MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4 Bố cục của luận văn 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây đậu xanh 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại đậu xanh 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây đậu xanh 5

1.1.3 Giá trị sử dụng của cây đậu xanh 6

1.1.3.1 Thành phần dinh dưỡng của đậu xanh 6

1.1.3.2 Giá trị sử dụng của đậu xanh 7

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt nam 7

1.1.4.1 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới 7

1.1.4.2 Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam 8

1.2 Đặc tính chịu hạn của cây đậu xanh 8

1.2.1 Ảnh hưởng của hạn đến cây trồng 8

1.2.2 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn 10

1.3 Vai trò của các hợp chất có hoạt tính thẩm thấu và các enzyme

chống oxy hóa trong việc đánh giá khả năng chịu hạn 13

1.3.1 Vai trò của các hợp chất có hoạt tính thẩm thấu 13

1.3.1.1 Các chất đường tan và vai trò của đường trong cơ chế chống chịu hạn 14

1.3.1.2 Proline và vai trò của proline 15

1.3.1.3 Glycine betaine và vai trò của glycine betaine 17

1.3.1.4 Protein tổng số và vai trò của protein tổng số 18

1.3.2.Vai trò của các enzyme chống oxy hóa trong cơ chế chịu hạn của cây trồng 18

1.3.2.1 Catalase và vai trò của catalase: 19

1.3.2.2 Peroxidase và vai trò của peroxidase: 19

1.4 Tình hình nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây đậu xanh 19

1.4.1 Nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây đậu xanh trên thế giới 19

1.4.2 Nghiên cứu về khả năng chịu hạn trên cây đậu xanh tại Việt Nam 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

2.3 Hóa chất và thiết bị 23

2.3.1 Hóa chất và nguyên liệu khác 24

2.3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 24

2.4 Nội dung nghiên cứu 24

2.5 Phương pháp nghiên cứu 25

2.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 25

2.5.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định 25

2.5.3 Phương pháp xử lý số liệu 29

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 Sự biến động các chất có hoạt tính thẩm thấu trong cây đậu xanh trong điều kiện gây hạn và phục hồi 30

3.1.1 Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi 30

3.1.1.1 Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 30 3.1.1.2 Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 32 3.1.1.3 Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 35

3.1.2 Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi 38

3.1.2.1 Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 38 3.1.2.2 Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 41 3.1.2.3 Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 43

3.1.3 Sự biến động hàm lượng glycine betaine của đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi 46

3.1.3.1 Sự biến động hàm lượng glycine betaine của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 46 3.1.3.2 Sự biến động hàm lượng glycine betaine của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 48 3.1.3.3 Sự biến động hàm lượng glycine betaine của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 51

3.1.4 Sự biến động hàm lượng protein của đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi 53

3.1.4.1 Sự biến động hàm lượng protein của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 53

3.1.4.2 Sự biến động hàm lượng protein của lá đậu xanh trong quá trình

gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 56

3.1.4.3 Sự biến động hàm lượng protein tổng số của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 58

3.2 Sự biến động một số enzyme chống oxy hóa trong cây đậu xanh trong điều kiện gây hạn và phục hồi 61

3.2.1 Hoạt độ enzyme catalase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi 61

3.2.1.1 Sự biến động hoạt độ enzyme catalase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 62

3.2.1.2 Sự biến động hàm lượng enzyme catalase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 64

3.2.1.3 Sự biến động hàm lượng enzyme catalase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 66

3.2.2 Hoạt độ enzyme peroxidase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi 69

3.2.2.1 Sự biến động hoạt độ enzyme peroxidase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 69

3.2.2.2 Sự biến động hoạt độ enzyme peroxidase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 71

3.2.2.3.Sự biến động hoạt độ enzyme peroxidase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 73

KẾT LUẬN 76

ĐỀ NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BADH Betaine Aldehyde Dehydrogenase

LEA Late Embryogenesis Abundant

LTP Lipid Transfer Protein

DANH MỤC BẢNG

Số

2.1 Đặc điểm nông học của các giống đậu xanh nghiên cứu 23

3.1 Hàm lượng đường khử trong lá cây đậu xanh ở giai đoạn

3.7 Hàm lượng glycine betaine trong lá cây đậu xanh ở giai

3.8 Hàm lượng glycine betaine trong lá cây đậu xanh ở giai

3.9 Hàm lượng glycine betaine trong lá cây đậu xanh ở giai

3.10 Hàm lượng protein trong lá cây đậu xanh ở giai đoạn cây

3.13 Hoạt độ enzyme catalase trong lá cây đậu xanh ở giai

3.14 Hoạt độ enzyme catalase trong lá cây đậu xanh ở giai

3.15 Hoạt độ enzyme catalase trong lá cây đậu xanh ở giai

3.16 Hoạt độ enzyme peroxidase trong lá cây đậu xanh ở giai

3.17 Hoạt độ enzyme peroxidase trong lá cây đậu xanh ở giai

3.18 Hoạt độ enzyme peroxidase trong lá cây đậu xanh ở giai

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Số

3.1 Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong

quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 32

3.2 Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong

quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 34

3.3 Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong

quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 37

3.4 Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 40

3.5 Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 43

3.6 Sự biến động hàm lượng proline của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 45

3.7 Sự biến động hàm lượng glycine betaine của lá đậu xanh

trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 48

3.8 Sự biến động hàm lượng glycine betaine của lá đậu xanh

trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 50

3.9 Sự biến động hàm lượng glycine betaine của lá đậu xanh

trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 52

3.10 Sự biến động hàm lượng protein của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 55 3.11 Sự biến động hàm lượng protein của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 57

3.12 Sự biến động hàm lượng protein của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 60

3.13 Sự biến động hoạt độ enzyme catalase của lá đậu xanh

trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 63

3.14 Sự biến động enzyme catalase của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 66

3.15 Sự biến động enzyme catalase của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 68

3.16 Sự biến động hoạt độ enzyme peroxidase của lá đậu xanh

trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non 71

3.17 Sự biến động enzyme peroxidase của lá đậu xanh trong

quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa 73 3.18 Sự biến động enzyme peroxidase của lá đậu xanh trong quá

trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây tạo quả 75

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) là một trong những cây

lương thực quan trọng ở nước ta Đậu xanh là cây trồng có thời gian sinh trưởng ngắn nên dễ luân canh với cây trồng khác, có thể tăng vụ để đạt hiệu quả kinh tế Cây đậu xanh được trồng chủ yếu lấy hạt để chế biến thức ăn Hạt đậu xanh chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ, 62,12% hydratcacbon, các loại vitamin A, B1, B2, C và một số nguyên tố khoáng như K,

Na, Mg, P, Fe, Ca… Hạt đậu xanh không chỉ là thực phẩm mà còn là một thứ dược liệu có thể giải độc, thanh nhiệt, chữa bệnh…cho con người Hạt đậu xanh còn là một mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị; hạt đậu xanh được sử dụng để chế biến thành các loại thực phẩm như chè, bánh đậu xanh, bánh nướng, … Ngoài ra, sản phẩm của cây đậu xanh còn được dùng làm thức ăn cho gia súc Trồng đậu xanh còn có tác dụng chống xói mòn, cải tạo đất Hệ

rễ của cây đậu xanh có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Vì vậy, cây đậu xanh không những mang hiệu quả về mặt dinh dưỡng, kinh tế mà còn có tác dụng cải tạo đất

Tuy nhiên, ở nước ta diện tích trồng đậu xanh còn nhỏ lẻ, không tập trung, chủ yếu chỉ là trồng xen canh và luân canh tăng vụ do đó năng suất thấp Việc mở rộng diện tích gieo trồng đậu xanh gặp nhiều khó khăn phụ thuộc vào một số yếu tố như giống, đất đai, thời tiết khí hậu, biện pháp kỹ thuật canh tác…trong đó quan trọng nhất là chưa có những giống có khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi trường đặc biệt là điều kiện hạn

Hiện nay, mưa là nguồn cung cấp nước chủ yếu cho sản xuất đậu xanh, chỉ có một số ít vùng có khả năng chủ động nguồn nước tưới Trong khi đó, lượng mưa ở

nước ta thường phân bố không đều giữa các vùng và các tháng trong năm, đặc biệt lưu lượng mưa ở nước ta có xu hướng giảm dần trong những năm gần đây Do vậy, trong các vụ gieo trồng, cây đậu xanh đều có thể gặp hạn ở những giai đoạn sinh trưởng, phát triển nhất định Nước là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất của cây trồng

Đối với cây trồng, để có thể tồn tại được với điều kiện thiếu nước phải

có những cơ chế thích nghi Một trong những phản ứng thích nghi đó là khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để cạnh tranh nước với môi trường xung quanh, dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hòa tan, protein, axit amin đặc hiệu…Ngoài ra, cây trồng còn có cơ chế tự bảo vệ, hình thành các enzyme chống oxy hóa nhằm loại bỏ các gốc tự do độc hại được tạo ra khi cây gặp stress

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu trên đối tượng đậu xanh đã và đang được tiến hành Đã có các công trình nghiên cứu về chọn tạo giống thích nghi với thời vụ và điều kiện sinh thái, nghiên cứu quy trình trồng và chăm sóc đậu xanh, nghiên cứu phân lập gen cystein liên quan đến khả năng chịu hạn, Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự hình thành các chất bảo vệ của cây đậu xanh trong điều kiện thiếu nước nhằm làm rõ hơn bản chất phản ứng của đậu xanh trong quá trình bị hạn, để từ đó đánh giá khả năng chịu hạn và tìm kiếm các giải pháp nâng cao khả năng chịu hạn của đậu xanh là vấn đề quan trọng đang

cần được nghiên cứu Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu sự biến động một số chất có hoạt tính thẩm thấu và enzyme chống

oxy hóa của đậu xanh (Vigna radiata L.) trong điều kiện gây hạn và phục

hồi”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Phân tích được sự biến động hàm lượng của một số chất có hoạt tính thẩm thấu của đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả

- Xác định được sự biến động hoạt độ một số enzyme chống oxy hóa của đậu xanh trong điều kiện gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non, ra hoa

và tạo quả

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Góp phần bổ sung nguồn tài liệu nghiên cứu về các chất có hoạt tính thẩm thấu và một số enzyme chống oxy hóa của cây đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi

- Kết quả nghiên cứu giúp đánh giá rõ hơn phản ứng của đậu xanh trong quá trình bị hạn, làm cơ sở khoa học cho việc chọn các giống đậu xanh chịu hạn phục vụ cho nhu cầu sản xuất ở những vùng gặp khó khăn về nước tưới, góp phần làm tăng năng suất cây đậu xanh

4 Bố cục của luận văn

MỞ ĐẦU (từ trang 1 đến trang 3)

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU (từ trang 4 đến trang 21)

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU (từ trang 23 đến trang 29)

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN (từ trang 30 đến trang 73) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ (trang 76)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây đậu xanh

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại đậu xanh

Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) có nguồn gốc từ Ấn Độ và

Trung Á, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các nước Đông và Nam Á Hiện nay các nhà khoa học đã tìm thấy tổ tiên của

cây đậu xanh là phân loài Vigna radiata var Sublobata còn mọc hoang dại ở

Mông Cổ Điều đó cho biết Mông Cổ cũng là nơi đã thuần hóa loài cây đậu xanh từ lâu đời [11]

Ở châu Á cây đậu xanh được trồng nhiều ở các quốc gia như: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, Lào, Philippines, Malaysia và Indonesia Sau này cây đậu xanh còn được trồng ở Trung Phi, các vùng khô và nóng ở Nam Âu, phía Đông Bắc châu Úc, Nam Mỹ và miền Nam Hoa Kỳ Ở Việt Nam đậu xanh được trồng khắp cả nước từ Bắc vào Nam Đây là loài cây rau và thực phẩm quan trọng và là một loại đậu có giá trị đặc biệt trong văn hóa ẩm thực Việt Nam

Phân loại khoa học của cây đậu xanh:

- Giới (regnum): Plantae

- Ngành (division): Magnolyophita

- Lớp (class): Magnolyopsida

- Bộ (order): Fabales

- Họ (Familia): Fabaceae

- Chi (genus): Vigna

- Loài (species): V radiata

Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm khoảng

150 loài thuộc 7 chi phụ là Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron; Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus, trong đó đậu xanh là một trong số

16 loài của phân chi Ceratotropi [11]

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây đậu xanh

Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả và hạt

Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới

70 - 100 cm Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến đổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây Tuy nhiên, bộ rễ của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năng chịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém[9]

Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm

Rhizobium Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2 - 3 lá thật và

đạt tối đa khi cây ra hoa rộ Trên mỗi cây có khoảng 10 - 20 nốt sần, tập trung chủ yếu ở cổ rễ Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đường kính dao động từ 4 - 5 mm, so với peroxidase và lạc thì nốt sần của cây đậu xanh ít

và nhỏ hơn Trung bình mỗi vụ, 1 ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng

85 - 107 kg nitơ, làm cho đất tơi xốp hơn

Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo, hình trụ, phân đốt, cao khoảng

40 - 70 cm Thân xanh hoặc tím đỏ tùy thuộc vào giống Trên thân có lông phủ, nhất là ở phần thân non Tốc độ tăng trưởng chiều cao thân từ ngày thứ

20 đến khi ra hoa, quả tương đối ổn định, có thể đạt từ 1-1,5 cm/ngày Đậu xanh thường có 2-4 cành, tùy thuộc ở giống và điều kiện canh tác

Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có 3 lá chét, có lông hai mặt Trên mỗi thân chính có 7-8 lá thật Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên, các lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn Số lượng lá, kích thước, hình

dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc vào giống, đất trồng và thời vụ

Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to ở nách lá Đậu xanh bắt đầu nở hoa khoảng 40-45 ngày sau khi gieo (vụ xuân)

và 30 -35 ngày (vụ hè) Thời gian ra hoa kéo dài, liên tục khoảng 15-40 ngày tùy giống và điều kiện canh tác [5]

Quả đậu xanh có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài 8 - 14 cm, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen Quả xuất hiện 1-2 ngày sau khi hoa nở và đã có độ dài 1-1,5 cm Quả lớn nhanh trong khoảng 5-7 ngày đầu và đạt kích thước tối đa vào khoảng 8-

10 ngày sau khi hoa nở

Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi và có nhiều màu sắc khác nhau như màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng … Trọng lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống, thời vụ

và chế độ canh tác

Đậu xanh là một loại cây thực phẩm ngắn ngày có khả năng thích ứng rộng trên nhiều vùng, miền khác nhau, thời gian sinh trưởng chỉ khoảng 65-70 ngày [11]

1.1.3 Giá trị sử dụng của cây đậu xanh

1.1.3.1 Thành phần dinh dưỡng của đậu xanh

Hạt đậu xanh có thành phần dinh dưỡng cao, chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% gluxit, 12% nước, các vitamin B1, B2, C, PP… các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K … Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn cung cấp đạm dễ tiêu hoá cho con người và một số vật nuôi Trong hạt đậu xanh, protein được chia thành hai nhóm: nhóm protein

đơn giản và nhóm protein phức tạp Trong nhóm protein đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số loại khác Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp axit amin và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt Protein đậu xanh được đánh giá là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủ các axit amin không thay thế Hàm lượng lipit trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp (trung bình khoảng 1,3% nhưng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá phẩm chất và khả năng bảo quản hạt [11], [26]

1.1.3.2 Giá trị sử dụng của đậu xanh

Đậu xanh được sử dụng rộng rãi với nhiều cách chế biến khác nhau

Từ xưa đậu xanh đã được người dân Việt sử dụng trong chế biến các loại bánh truyền thống như bánh chưng, bánh tét, bánh ít hay sử dụng để nấu chè, nấu xôi, nấu cháo, làm rau mầm, làm bột thức ăn cho trẻ sơ sinh, bột đậu xanh hòa tan giải khát Đậu xanh còn được người ta sử dụng như là dược liệu dùng để giải độc, giải nhiệt, bồi bổ sức khỏe Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa Thân, lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi

Cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo đất Hệ rễ đậu xanh có các nốt

sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium có khả năng cố định

nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [13]

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt nam

1.1.4.1 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp LHQ ( FAOSTAT ), tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới ngày càng tăng về năng suất và diện tích trồng trọt Đặc biệt, trong những năm gần đây do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật tăng nhanh đã làm thúc đẩy việc sản xuất đậu xanh trên thế giới

Năm 1994 diện tích trồng đậu xanh của toàn thế giới là 1.021.030 ha

và sản lượng là 6.918.021 tấn đến năm 2017 thì diện tích trồng là 1.579.971

ha và sản lượng là 24.221.252 tấn Đậu xanh được trồng khắp nơi trên thế giới trong đó phổ biến nhất là châu Á, chiếm 88% tổng diện tích trồng đậu xanh trên thế giới, rồi đến châu Âu chiếm 6,1 %, châu Phi chiếm 3,6 %, Châu Mỹ chiếm 2,1%, châu Đại Dương 0,3% [42]

1.1.4.2 Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam

Đậu xanh là một trong ba loại cây đậu đỗ chính: lạc, peroxidase, đậu xanh Đậu xanh của nước ta sản xuất ra chủ yếu để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước như làm rau, làm bánh Các sản phẩm làm từ đậu xanh rất phong phú, nhưng hiện nay chỉ có một số ít sản phẩm có chất lượng ổn định và có thương hiệu lâu năm trên thị trường

Trồng đậu xanh đã trở thành tập quán ở nhiều vùng Gần đây, do có những giống mới có năng suất cao, do nhu cầu thâm canh, cải tạo đất ngày càng cao, cho nên đậu xanh đang được phát triển rộng trong các cơ cấu cây trồng ở nhiều tỉnh trên địa bàn cả nước Từ năm 1991 - 1995 năng suất sản xuất đậu xanh bình quân đạt khoảng 5,5 - 12 tạ/ha Từ 1996 - 2000 năng suất dao động trong khoảng 15 - 20 tạ/ha Đến năm 2000, Việt Nam có diện tích và sản lượng đậu xanh đứng thứ 6 trên thế giới

Ngày nay, đậu xanh có xu hướng tăng về diện tích và sản lượng do nhu cầu sử dụng Để đạt được kết quả tốt cần có các phương pháp lai tạo, chọn ra các giống mới có năng suất cao, chống chịu được với các điều kiện khắc

nghiệt của môi trường [23]

1.2 Đặc tính chịu hạn của cây đậu xanh

1.2.1 Ảnh hưởng của hạn đến cây trồng

Môi trường khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực đến cây trồng ở tất cả các cấp độ, từ hình thái, cấu trúc tới phân tử và ở tất cả các giai

đoạn phát triển Để đối phó với điều kiện hạn hán, cây trồng sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nước, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác nhau như giữ không để mất nước hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước thông qua những biến đổi về hình thái, duy trì áp suất nội bào

Sự đáp ứng chống chịu stress hạn của cây trồng được thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp với sự tham gia của hàng loạt các yếu tố [22]

Nước là điều kiện quan trọng cho sự nảy mầm Nước tham gia vào quá trình trao đổi chất, các phản ứng sinh hoá trong tế bào, là nguồn nguyên liệu của nhiều phản ứng Nước đảm bảo cho cây tồn tại và phát triển Hạt khô có hàm lượng nước từ 10 - 14% thì không nảy mầm Nhờ lực hút trương nước của keo nguyên sinh mà hạt hút được nước và khi hàm lượng nước bằng 50 - 70% khối lượng hạt thì các hoạt động sống tăng lên mạnh mẽ và phôi phát động sinh trưởng hay nảy mầm Hạn làm thay đổi hệ thống keo nguyên sinh chất như tăng độ nhớt chất nguyên sinh, làm chậm các hoạt động sống, giảm mức độ phân tán, khả năng thủy hoá và tính đàn hồi của keo nguyên sinh chất [48]

Quá trình quang hợp bị ức chế khi thiếu nước Do khí khổng đóng nên thiếu CO2, lục lạp có thể bị phân huỷ, ức chế tổng hợp diệp lục, lá bị héo và khô chết, sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắt nghẽn Quá trình hô hấp ban đầu sẽ tăng, về sau giảm hô hấp nhanh, hiệu quả sử dụng năng lượng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh nhiệt là

chính Từ hoạt động tổng hợp là chủ yếu khi đủ nước chuyển hướng sang

phân giải khi thiếu nước Quá trình phân giải quan trọng nhất là phân giải protein và axit nucleic, kết quả là giải phóng và tích luỹ NH3 gây độc cho cây

và có thể làm cây chết [43]

Hạn làm mất cân bằng nước trong cây, lượng nước thoát ra lớn hơn

lượng nước hấp thu vào cây, làm cho cây bị héo Hạn dẫn đến một số biến đổi trong mô và tế bào như làm biến tính và kết tủa protein, làm tăng độ lỏng của lipit màng, mở xoắn các acid nucleic Hạn cũng phá hoại hệ thống quang hóa

II trên màng thylacoid Ảnh hưởng của hạn trước hết là gây ra sự mất nước của tế bào và mô, tiếp theo là hệ nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến

tế bào và mô bị tổn thương và chết Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo trồng [23]

Hạn làm cho quá trình sinh trưởng và phát triển bị kìm hãm, ức chế ra hoa, tạo quả Khi gặp hạn, hạt phấn không nảy mầm, ống phấn không sinh trưởng được, sự thụ tinh không xảy ra và hạt sẽ bị lép, giảm năng suất nhiều [19] Như vậy, ảnh hưởng cực đoan của hạn ở bất cứ giai đoạn sinh trưởng nào của cây trồng cũng ảnh hưởng đến các yếu tố cấu thành năng suất và làm

giảm năng suất của cây trồng [4]

Do vậy tính chịu hạn của cây trồng và vấn đề chống chịu hạn thường xuyên được quan tâm

1.2.2 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn

Thực vật có khả năng ngăn ngừa thương tổn khi bị tổn thương gọi là tính chống chịu Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh,… Khi các nhân tố này vượt quá giới hạn sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, dẫn đến giảm năng suất Để chống lại khô hạn thực vật có những biến đổi về sinh lý, sinh hoá nhằm không để mất nước

Khả năng duy trì chức năng của bộ máy quang hợp dưới điều kiện hạn

có ý nghĩa quan trọng với khả năng chịu hạn Cây phản ứng với sự thiếu hụt nước bằng cách đóng khí khổng nhanh chóng để hạn chế sự mất nước do quá trình thoát hơi nước, hệ quả là sự khuếch tán CO2 qua lá bị hạn chế (Ahmed et

al., 2002; Flexas et al., 2006; Lawlor và Tezara, 2009) [26], [37], [32]

Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Ahmed et al (2002) [26] cho biết, khi bị

hạn làm giảm lượng CO2 hấp thu qua lá và giảm hàm lượng nước trong lá Hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và hàm lượng diệp lục tổng số ở các loài hướng sáng bị giảm dưới điều kiện hạn hán Sự suy giảm hàm lượng diệp lục tổng số làm hạn chế khả năng quang hợp của thực vật, do đó làm giảm sản lượng của quá trình quang hợp Hàm lượng diệp lục giảm trong điều kiện hạn được giải thích chủ yếu là do lục lạp bị phá hủy dưới tác động của sự tích lũy

các gốc tự do trong tế bào (Mafakheri et al., 2010) [39] Hassanzadeh et al

(2009) [34] đã đề nghị, có thể dựa vào hàm lượng diệp lục b và diệp lục tổng

số để tuyển chọn giống chịu hạn và có năng suất cao

Một trong những xu hướng điển hình để thực vật chống lại hạn là dựa vào khả năng làm tăng ASTT tế bào, tăng tính đàn hồi của màng tế bào cũng như giảm kích thước tế bào Trên phương diện hóa sinh, cây trồng xảy ra nhiều biến đổi nhằm chống lại hạn hán như giảm tổng hợp protein và các axit nucleic, tăng hàm lượng proline, tăng nồng độ các chất hòa tan Ngoài ra, cây trồng còn chống lại sự khô hạn bằng cách giữ không để mất nước hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu nước thông qua những sự biến đổi về cấu trúc và hình thái như: rễ to, khỏe, dài, có khả năng xuyên sâu; giảm diện tích lá; rút ngắn chu kỳ sống… Cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng, khi ở giai đoạn cây non chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ chưa phát triển đầy đủ

Tính chống chịu của đậu xanh nói riêng và tính chống chịu của cây trồng nói chung rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lý, hoá sinh và do nhiều gen quy định Đã có nhiều cơ chế liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

đã được biết đến như: vai trò của bộ rễ, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế protease, các gen điều

khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA, LTP, PLC ) [1]

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính của tế bào khi bị mất nước do hạn, nóng, lạnh Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp rễ cây nhận được một lượng nước rất nhỏ còn lại trong đất Các chất

và các gen tương ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để cạnh tranh nước với môi trường xung quanh bao gồm: ion K+; các axit amin như proline, estonine; các chất đường như sucrose, fructant, manitol, pinitol

và các chất khác như glycine betain, β- alanin betain Các chất này có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm (ASTT) có liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của tế bào

rễ cây đối với đất Bằng cơ chế như vậy, thực vật có thể vượt qua tình trạng hạn cục bộ Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được những phân tử nước có rất ít trong đất Khi

tế bào bị mất nước dần dần các chất hòa tan sẽ được tích lũy trong tế bào chất nhằm chống lại việc giảm tiềm năng nước và tăng khả năng giữ nước của nguyên sinh chất Các chất hòa tan có liên quan bao gồm các loại đường, các axit hữu cơ, các loại axit amin, các loại rượu đa chức hay các ion (chủ yếu là ion K+) Các chất có hoạt tính thẩm thấu có khả năng giữ và lấy nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, ngoài ra còn có thể thay thế vị trí của nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với protein và lipit màng, ngăn chặn sự phá hủy màng [8]

Một số công trình nghiên cứu về cơ chế chịu hạn của cây trồng đã cho thấy vai trò của một số chất có hoạt tính thẩm thấu đối với khả năng tăng cường tính chống chịu ở điều kiện cực đoan [8]

Ở mức độ phân tử, phản ứng của thực vật với điều kiện thiếu nước đã cho thấy những thay đổi trong biểu hiện gen Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học vẫn chưa xác định được gen điều khiển tính chịu hạn, mà chỉ xác định được các gen liên quan đến tính chịu hạn (Trần Thị Thanh Huyền, 2011) [7]

Khả năng chịu hạn ở cây trồng do nhiều gen qui định, trong đó có gen LEA (Late embryogenesis Abundant) Protein LEA là những protein hòa tan, chịu nhiệt thường gặp nhất, sinh ra khi tế bào bị mất nước và được khẳng định liên quan đến khả năng chịu hạn, sự phát triển phôi và cảm ứng ABA ở thực vật (Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs., 2006) [20]

Gen chaperonin liên quan đến tính chịu nóng, chịu hạn ở thực vật Chaperonin còn gọi là chất môi giới phân tử, có hoạt tính ATPase Chúng giúp cho việc tạo không gian đúng của protein trong khung actin và tubulin tế bào chất Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành thoi vô sắc của giai đoạn phân bào, đặc biệt là thời kỳ phát triển mầm từ hạt (Chu Hoàng Mậu và cs., 2008) [16]

LTP (Lipid transfer protein) có khả năng tổng hợp ra protein, thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid tới màng Vai trò của LTP là tham gia vào cấu tạo lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng lại những thay đổi của môi trường Khi stress hạn, LTP được tăng cường tổng hợp ở lớp ngoại bì, làm thực vật giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài (Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs., 2011) [22]

1.3 Vai trò của các hợp chất có hoạt tính thẩm thấu và các enzyme chống oxy hóa trong việc đánh giá khả năng chịu hạn

1.3.1 Vai trò của các hợp chất có hoạt tính thẩm thấu

1.3.1.1 Các chất đường tan và vai trò của đường trong cơ chế chống chịu hạn

Đường tan là một trong những chất tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào Enzyme α-amylase là enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và polysacharide… Chúng phân giải các liên kết 1,4-glucozit ở giữa chuỗi mạch polysacharide tạo thành các đextrin phân tử thấp

Sự tăng hoạt độ α-amylase sẽ làm tăng hàm lượng đường tan do đó làm tăng

áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây trồng

Đường khử bao gồm các loại monosaccarit như fructose, glucose, galactose, xylose… ảnh hưởng đến khả năng giữ nước của tế bào Trong đó fructose là một chất giữ nước tuyệt vời trong một thời gian dài, kể cả khi độ

ẩm tương đối thấp Vì vậy, hàm lượng đường khử trong cây cũng là một chỉ tiêu phản ánh khả năng giữ nước của tế bào do nó có vai trò trong điều chỉnh

áp suất thẩm thấu trong dịch bào Đường khử thuộc các chất có hoạt tính thẩm thấu, giúp tăng cường khả năng giữ nước cho tế bào, tăng khả năng chống chịu của cây đối với các điều kiện bất lợi của môi trường Vì thế sự tổng hợp

và tích lũy đường là một trong những phản ứng của cây với điều kiện ngoại cảnh bất lợi Theo nghiên cứu của nhiều tác giả cho biết, hàm lượng đường tan trong cây liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu như chịu hạn, chịu lạnh, (Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự, 2002) [12]

Glucose, fructose tăng lên một lượng lớn trong tế bào khi gặp yếu tố cực đoan Chúng tương tác với màng tế bào, hình thành cầu nối hydro giữa gốc hydroxyl của đường với nhóm phospholipid Bằng cách này chúng thay thế vị trí nước trong màng tế bào Sự có mặt của chúng trong nguyên sinh chất còn có khả năng bảo vệ các phức enzyme khác Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự thay đổi và tăng cường áp suất thẩm thấu, ổn định pH

cho tế bào Trong các loại polysaccharide, glucan (tinh bột) có khả năng chống chịu yếu nhất, fructan (polyfructose) trung bình, họ rafinose là có khả năng tốt nhất Khi gặp hạn, các polysaccharide nhanh chóng thủy phân thành monosaccharide, góp phần điều chỉnh áp suất thẩm thấu Sau đó, các monosaccharide lại chuyển về trạng thái polysaccharide [10]

1.3.1.2 Proline và vai trò của proline

Proline là một axit amin ưa nước, có khối lượng phân tử nhỏ, được tổng hợp từ glutamin nhờ sự xúc tác của enzyme delta-1-pyrroline-5-carboxylate sythetase (P5CS) Axit amin này được tích lũy nhiều ở lá cây của nhiều loài thực vật, mô lá, mô phân sinh chóp rễ thực vật và ở hạt phấn khi thực vật bị mất nước [45]

Proline thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu, chúng có khối lượng phân tử nhỏ, các hợp chất này có chung tính chất là không tích điện ở

pH trung tính và có khả năng hòa tan tốt trong nước, không độc khi có nồng

độ cao và làm ổn định cấu trúc của các phân tử protein [46] Khi cây gặp stress, proline tự do có hiệu ứng sinh học đa năng, không chỉ trong chức năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu mà còn có tác động bảo vệ hàng loạt enzyme trong điều kiện biến tính (nhiệt độ cao, nồng độ muối cao…), bên cạnh đó nó còn thể hiện khả năng bảo vệ gián tiếp protein và màng khỏi tổn thương Proline còn được xem như một dạng dự trữ nitơ khi gặp stress, proline còn là nguồn cung cấp năng lượng và đương lượng khử

Phân tử proline có cấu trúc vòng (pirolidin), cấu trúc này tạo cho proline một hình dáng vững chắc hơn so với các axit amin khác Trong điều kiện stress phi sinh học, thực vật có xu hướng sản sinh proline, proline đóng

vai trò như một chất điều hòa thẩm thấu, một chất chống oxy hóa và là một

phân tử tín hiệu (Yaish, 2015) [46]

Theo Chu Hoàng Mậu và Hà Tiến Sỹ [15], khi nghiên cứu một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Cao Bằng đã cho rằng tính chịu hạn của cây đậu tương liên quan đến hàm lượng proline và protein Khi gặp hạn cây đậu tương giảm tổng hợp protein và tăng cường tổng hợp proline Sự gia tăng hàm lượng proline và giảm hàm lượng protein của các giống đậu tương sau khi gây hạn đã chứng tỏ các cây đậu tương có phản ứng một cách tích cực trước sự thay đổi của điều kiện môi trường

Proline được tổng hợp từ L-glutamate nhờ sự xúc tác của enzyme pyrrolin-cacboxilat-synthetase (P5CS), enzyme này được điều hòa bởi proline thông qua cơ chế ức chế ngược Thực vật chịu stress nước, sự điều hòa ngược này đã biến mất và đây có thể là nguyên nhân làm tăng sự tích lũy proline dưới các điều kiện stress

δ-Ở Việt Nam, đã có một số tác giả nghiên cứu về vai trò của proline đối với khả năng chịu hạn của nhiều loại cây trồng cũng cho kết quả khả quan Tác giả Nguyễn Hữu Cường (2003) [2], bằng việc xử lý lạnh, mặn, hạn trên các giống lúa đã cho thấy có mối tương quan thuận giữa tính chống chịu của cây với hàm lượng proline gia tăng của các giống lúa nghiên cứu Tác giả Đinh Thị Phòng (2001) khi xử lí hạn, hàm lượng proline đều tăng lên, mức độ tăng lên ở các giống khác nhau là khác nhau, những giống chịu hạn tốt tăng 9 lần sau khi xử lí hạn 8 ngày [18]

Như vậy, proline có ảnh hưởng lớn tới tính chịu hạn ở thực vật và cây trồng nói riêng Những nghiên cứu về proline trên đối tượng lúa, đậu xanh, cà chua, cây thuốc lá… cho thấy sự tương quan thuận giữa gia tăng hàm lượng proline với tính chống chịu sự thiếu nước, stress muối… Do đó có thể xem axit amin này như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật, hay sự tích lũy proline là biểu hiện của phản ứng thích nghi của thực vật với điều

kiện cung cấp nước khó khăn Do đó cần đi sâu nghiên cứu về vai trò của proline đối với cây đậu xanh, từ đó có những nhận định khách quan về khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh, đây là một vấn đề có ý nghĩa thực tiễn

to lớn

1.3.1.3 Glycine betaine và vai trò của glycine betaine

Glycine betain (GB) là một hợp chất amin bậc 4, sản phẩm của quá trình oxy hóa choline trong quá trình tổng hợp methionine Ở thực vật bậc cao, glycine betaine được tổng hợp trong lục lạp thông qua con đường: Choline → betaine aldehyde → glycine betaine nhờ vào sự xúc tác của 2 enzyme lần lượt là choline monooxxygenase và betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) [28]

Cùng với proline, glycine betain cũng được biết đến là một trong những chất có vai trò quan trọng trong điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi như khô hạn, mặn, lạnh, (Sakamoto và Murata, 2002) [44].Các nghiên cứu cho thấy tăng hàm lượng glycine betain trong cây có thể gia tăng khả năng chịu hạn của thực vật

Glycine betaine bảo vệ cây bằng cách duy trì cân bằng nước giữa tế bào

và môi trường, ổn định các đại phân tử, điều chỉnh và duy trì màng thylacoid, đảm bảo hiệu quả quang hợp dưới điều kiện khô hạn và nồng độ muối cao (Yang et al., 2005) [47] Trong tự nhiên, rau bina, ngô, củ cải đường và lúa mạch, nhanh chóng tích lũy glycine betaine khi cây bị tác động bởi môi trường hạn hán, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp Glycine betaine giúp chống lại tác dụng phụ gây ra bởi các yếu tố phi sinh học, ngăn ngừa sự biến tính và mất hoạt tính của protein Nó có vai trò bảo vệ màng tế bào của lá, bảo

vệ các thành phần của bộ máy quang hợp, bảo vệ ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) và hệ sắc tố quang hợp

Glycine betaine cũng tham gia vào việc bảo vệ cơ quan sinh sản, bảo vệ

bộ máy quang hợp và giải độc các ROS trong stress do các nhân tố môi trường ở thực vật, đồng thời kích hoạt một số gen liên quan đến chống chịu và bảo vệ màng tế bào ở thực vật Glycine betaine cũng liên quan đến việc bảo

vệ cấu trúc bậc bốn của protein bởi các áp lực gây ra bởi các tác động từ môi trường Glycine betaine được tổng hợp nhằm bảo vệ bộ máy quang hợp bằng cách ổn định hoạt động của các protein sửa chữa [35]

1.3.1.4 Protein tổng số và vai trò của protein tổng số

Những thay đổi trong biểu hiện protein, sự tích lũy và tổng hợp các protein đã được quan sát thấy ở lá cây trong điều kiện khô hạn trong suốt thời gian phát triển (Chen T.H và cộng sự, 2002) [30] Sự thay đổi protein trong điều kiện stress hạn xảy ra cả về số lượng và chất lượng Trong điều kiện khô hạn, ngoài sự suy giảm hàm lượng của một số protein đồng thời cũng diễn ra quá trình tổng hợp các protein mới

Protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) có vai trò cơ bản trong việc bảo vệ cây chống lại stress phi sinh học (Zhang cộng sự, 2015) [49] Các protein này chiếm 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này Nói chung, sự tổng hợp của các protein có trọng lượng phân tử thấp tăng khi cây sinh trưởng trong điều kiện stress khô hạn

1.3.2 Vai trò của các enzyme chống oxy hóa trong cơ chế chịu hạn của cây trồng

Hạn hán dẫn đến tích lũy nhiều gốc oxy phản ứng (reactive oxygen species-ROS), được tạo ra chủ yếu trong lục lạp và trong ty thể, gây ra sự oxy hóa mạnh Các phân tử ROS bao gồm superoxide anion (O2*-), hydro peroxide

H2O2, gốc hydro peroxide tự do (OH*) và gốc pehydroxyl tự do (O2H*) Cây trồng chịu hạn có một số cơ chế tự bảo vệ tránh tác hại của stress oxy hóa

Cây có mức độ chống oxy hóa cao thì khả năng chịu đựng tốt hơn và đề kháng với tổn thương oxy hóa nhiều hơn (Parida và Das, 2005) [41] Để hạn chế những thiệt hại do stress “oxy hóa”, thực vật có những cơ chế kiểm soát, điều chỉnh hàm lượng ROS phù hợp, trong đó có sự tham gia của các enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) và ascorbate peroxidase (APX) (Maffei và cs., 2007; Ahmad và cs., 2008) [25] Các enzyme này vừa duy trì sinh tổng hợp ROS để tăng cường khả năng chống chịu trước tác động từ môi trường ngoài, đồng thời kiểm soát, giảm thiểu độc tính của ROS đối với các yếu tố cấu trúc và quá trình sống diễn ra bên trong tế bào Các loài thực vật khác nhau có những cơ chế bảo vệ không giống nhau và tùy điều kiện chống chịu mà hình thành các chất bảo vệ khác nhau [40]

1.3.2.1 Catalase và vai trò của catalase:

Catalase (CAT) xúc tác cho phản ứng chuyển hóa H2O2 thành H2O và

O2 Mỗi phân tử của nó chứa 4 nhóm hem Catalase đa dạng ở nhiều loại thực vật khác nhau, thậm chí trong cùng một loài Các izozyme đều là tetramer có khối lượng phân tử 220 kDa, ví dụ catalase của ngô có 3 izozyme: cat 1, cat 2, cat 3 Catalase là một enzyme quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi bị oxy hóa

bởi các loại oxy phản ứng [25]

1.3.2.2 Peroxidase và vai trò của peroxidase:

Peroxidases (POD) là một tập hợp gồm nhiều enzyme chống ôxy hóa

có chức năng giải độc peroxide Enzyme peroxidase rất phổ biến trong cơ thể động vật và thực vật, đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa Một số POD xúc tác biến đổi H2O2 và loại khả năng gây độc của H2O2, bảo vệ tế bào

và cơ thể thực vật trước tác động của điều kiện bất lợi [38]

1.4 Tình hình nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây đậu xanh

1.4.1 Nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây đậu xanh trên thế giới

Có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn

và phân lập gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh trên thế gới nhằm chọn tạo ra các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt

Chen và cộng sự (2004) [31] đã tiến hành phân lập 3 gen Hsc70 ở đậu xanh là VrHsc70 - 1, VrHsc70 - 2, VrHsc70 - 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọn tạo giống đậu xanh có khả năng chịu hạn, chịu nóng

Theo Sadeghipour (2008) [43], khi bị hạn bất kể ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng hay sinh thực đều làm giảm các yếu tố cấu thành năng suất đậu xanh và năng suất hạt, tuy nhiên hạn ở giai đoạn nở hoa và hình thành quả ảnh hưởng đến năng suất hạt nghiêm trọng hơn so với các giai đoạn khác Khô hạn nếu xảy ra ở thời kỳ ra hoa (xuất hiện hoa đầu tiên đến 75% số quả non được hình thành) làm giảm số quả/cây, số hạt/quả và năng suất hạt, nếu gặp hạn ở thời kỳ quả mẩy (75% quả non đến quả chín) làm giảm đáng kể khối lượng 1000 hạt

Ranawake và cộng sự (2011) [42] nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn đối với sinh trưởng và năng suất của đậu xanh thấy rằng điều kiện hạn ảnh hưởng đáng kể đến chiều dài rễ, số rễ, chiều cao cây, trọng lượng khô, nụ hoa

Ranawake và cộng sự (2011) [42] chỉ ra rằng đối với cây đậu xanh, hạn hán xảy ra trong thời kỳ quả mẩy (6 tuần sau khi gieo) bị ảnh hưởng nghiêm trọng hơn so với khi bị hạn ở thời kỳ cây con (3 tuần sau khi gieo) và thời kỳ quả chín (8 tuần sau khi gieo)

Kumar và cộng sự (2013) [36] đã chỉ ra rằng, thiếu nước làm giảm diện tích lá, tốc độ sinh trưởng, sự tăng trưởng bộ rễ, số lượng nốt sần, cường độ quang hợp, hàm lượng chlorophyl và carotenoit, khả năng ra hoa và hình thành quả, khả năng tích lũy chất khô và năng suất hạt Các giống đậu xanh (Pusa Baisakhi và MH-1 K-24) nhạy cảm với khô hạn cho thấy có sự giảm mạnh các chỉ tiêu sinh lý nêu trên và phục hồi chậm cường độ quang hợp

Yin Z và cộng sự (2015) đã nghiên cứu khả năng ảnh hưởng của gây hạn nhân tạo bằng etylen glycol đến đậu xanh giai đoạn ra hoa và thấy rằng

các chỉ số hóa sinh như hoạt động của các enzyme superoxide dismutase, peroxidase, hàm lượng malondialdehyde và hàm lượng ABA có liên quan đến

khả năng chịu hạn của đậu xanh [48]

1.4.2 Nghiên cứu về khả năng chịu hạn trên cây đậu xanh ở Việt Nam

Chu Hoàng Mậu (2001) [14] bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm đã tạo được 2 dòng đậu xanh MX1103 và TX16012 có năng suất cao,

ổn định và có khả năng chịu hạn tốt Tác giả cũng đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng protein, thành phần và hàm lượng các axit amin trong hạt các giống đậu xanh đột biến và giống gốc để đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh Kết quả cho thấy hạt của giống đậu xanh đột biến MX103 có hàm lượng protein là 20,58%, cao hơn so với các giống còn lại, hàm lượng axit amin của các giống đậu xanh đột biến cũng cao hơn các giống đối chứng

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cộng sự (2006) [ 20] khi phân lập và đọc trình tự gen mã hóa protein LEA của 4 giống đậu xanh KP11, MN93, 263 và KPS1 có khả năng chịu hạn khác nhau cho biết gen LEA của 4 giống đậu xanh nghiên cứu dài khoảng 516 - 520 nucleotide gồm 2 exon và 1 intron, đoạn mã hóa protein dài 339 nucleotid, so sánh trình tự nucleotid của gen LEA giữa 4 giống đậu xanh nêu trên cho thấy có độ tương đồng cao (95,9 – 99,6%), so sánh mức độ protein cho thấy trình tự axit amin của chúng sai khác rất ít

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Chu Hoàng Mậu (2010) [21] đã nghiên cứu về gen mã hóa cystatin phân lập từ hai giống có khả năng chịu hạn cao (KP11 và KPS1) và hai giống chịu hạn kém (MN93, 263) cho biết, trình tự nucleotide của gen cystatin của bốn giống đậu xanh thể hiện sự khác nhau mặc dù trình tự axit amin không khác biệt nhau và không khác với trình tự có

nghiên cứu đã chỉ ra 2 giống đậu xanh ĐX22 và ĐXVN5 có khả năng chịu hạn tốt hơn ở giai đoạn mọc mầm so với các giống khác

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cộng sự (2011) [22] cho rằng, gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN2 đều có kích thước 351 bp, chuỗi polypeptide được tổng hợp từ gen LTP gồm 116 amino acid Khi so sánh với trình tự nucleotide của gen LTP đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã số AY300807, trình tự nucleotide của gen LTP ở hai mẫu nghiên cứu có độ tương đồng 98,8% Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein từ 97,4% - 98,2

Vũ Ngọc Thắng và cộng sự (2012) [24] đã đánh giá khả năng chịu hạn của 2 giống đậu xanh ĐX22 và ĐXVN5 ở 3 thời kỳ bắt đầu ra hoa, ra hoa rộ, quả vào chắc trong điều kiện chậu vại, sử dụng đất phù sa sông Hồng, kết quả nghiên cứu cho thấy nếu hạn ở thời kỳ bắt đầu ra hoa cây có khả năng phục hồi tốt hơn và ảnh hưởng giảm năng suất nhẹ hơn ở các giai đoạn sau Sự suy giảm năng suất mạnh nhất khi thiếu nước ở thời kỳ quả mẩy, giống ĐX22 có khả năng chịu hạn tốt hơn giống ĐXVN5 Kết quả nghiên cứu này đã góp phần xác định phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn của đậu xanh phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở nước ta

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các giống đậu xanh được dùng trong nghiên cứu bao gồm ĐX 044 được Trường Đại học Nông nghiệp I chọn lọc cá thể từ giống VC 2768A Giống

ĐX 208 được tuyển chọn từ giống địa phương ở miền Nam nước ta và NTB.02 được Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung

bộ tuyển chọn từ các dòng giống nhập nội

Bảng 2.1 Đặc điểm nông học của các giống đậu xanh nghiên cứu

Thời gian

sinh trưởng 75 - 80 ngày 70 - 75 ngày 85 - 90 ngày

Chống đổ, chống bệnh vàng lá, đốm lá

Kháng bệnh héo rũ, chống

đổ tốt

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 07 năm 2019

- Địa điểm: Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý-Hóa sinh và vườn Sinh học trường thuộc Khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Quy Nhơn

2.3 Hóa chất và thiết bị

2.3.1 Hóa chất và nguyên liệu khác

Thuốc thử Bradford, coomassie brlliant blue R-250, BSA, toluen, ninhydrin được mua từ Biobasic (Canada); glycine betaine chuẩn, proline chuẩn được mua từ Sigma (Mỹ); ethanol, methanol, β-mercaptoethanol, tris-base, guaiacol, 1,2 dichloroethane được mua từ Merck (Đức) và một số hóa chất khác

2.3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Một số thiết bị chính dùng trong nghiên cứu bao gồm máy ly tâm lạnh

(Mikro 22R- Hattich, Đức), máy lắc ngang (Eppendorf, Đức), máy đo pH (Orion, USA), máy đo độ ẩm Takemura DM-15 (Nhật Bản), tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản), máy đo quang phổ (Pharmacia LKB - Ultraspec, Denmark), máy khuấy từ, pipetman các loại (Gilson), tủ sấy (Anh), cân điện tử (Đức),

Một số dụng cụ khác như bếp điện, đầu côn các loại, ống eppeendorf, ống falcon 50 ml, 15 ml; ống đong 10 ml và 100 ml, 250 ml; bình tam giác 50

ml, bình định mức 50 ml, chày, cối sứ, cối thủy tinh, găng tay, khẩu trang chống độc

2.4 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện gây hạn nhân tạo và phục hồi đến hàm lượng protein tổng số, hàm lượng proline, hàm lượng glycine betaine

và hàm lượng đường khử của lá đậu xanh ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả

- Xác định hoạt độ một số enzyme chống oxy hóa như catalase, peroxidase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

(1) Thời kỳ cây non:

Thí nghiệm gây hạn nhân tạo được tiến hành theo phương pháp của

Lê Trần Bình [1] Số lượng cây/chậu là 15 cây, mỗi công thức lặp lại 3 lần

Hạt đậu nảy mầm được gieo trong chậu trồng cây chứa cát sạch Cây được đảm bảo chế độ chăm sóc thông thường bằng cách bổ sung dung dịch dinh dưỡng Knop, đến ngày thứ 7 sau khi gieo, cây có 3 lá thật, gây héo lô thí nghiệm bằng cách không tưới nước và cách li với nước, lô đối chứng tưới nước bình thường Sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày gây hạn thì tiến hành thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu Ở giai đoạn phục hồi, lô thí nghiệm gây hạn 5 ngày được tưới nước phục hồi sao cho ẩm độ đất luôn được duy trì từ 75 – 80% Ẩm độ đất được kiểm tra bằng máy đo độ ẩm Takemura DM-15 (Nhật Bản), sau đó tiến hành thu mẫu lá và phân tích vào các thời điểm sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày phục hồi

(2) Thời kỳ cây ra hoa, tạo quả:

Cây được chăm sóc bình thường đến thời điểm cây đậu xanh bắt đầu ra hoa đầu tiên thì tiến hành gây hạn Sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày hạn thì thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu Ở giai đoạn phục hồi, lô thí nghiệm gây hạn 5 ngày được tưới nước phục hồi sao cho ẩm độ đất luôn được duy trì từ 75 – 80% và tiến hành thu mẫu lá và phân tích vào các thời điểm sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày phục hồi Ở giai đoạn cây tạo quả, cách thức gây hạn và phục hồi cũng tương tự như giai đoạn ra hoa Thời điểm bắt đầu gây hạn và phục hồi là giai đoạn chuẩn bị hình thành quả non

2.5.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định

2.5.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng proline

Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp Bates (1973)

[29]

+ Nguyên tắc: Khi proline phản ứng với thuốc thử ninhydrin ở nhiệt độ cao, proline bị oxi hóa còn ninhydrin bị khử tạo thành dixeto oxihindriden Sản phẩm tiếp tục phản ứng với một phần tử ninhydrin thứ hai tạo thành hợp chất có màu vàng da cam Hỗn hợp phản ứng được tách chiết bằng dung dịch toluen, so màu ở bước sóng 520 nm Đối chiếu với đồ thị chuẩn proline, xác định được hàm lượng proline trong mẫu thí nghiệm và tính toán theo trọng lượng tươi như sau:

C : nồng độ proline (µg/ml)

V : thể tích dung môi chiết (ml)

P : trọng lượng mẫu phân tích (g) + Cách làm: Cân 0,5 g mẫu nghiền trong 10 ml axit sulphosalisilic 3% Lọc và lấy 2 ml dịch lọc, thêm vào dịch lọc 2 ml ninhydrin và 2 ml axit axetic lạnh, để ở 100oC trong 1 giờ Kết thúc phản ứng ở điều kiện lạnh (ngăn đá) Hỗn hợp được tách chiết bằng 4 ml toluen, trộn mạnh trong 15-20 s, hợp chất màu được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 520 nm Xác định hàm lượng proline dựa vào đồ thị proline chuẩn

2.5.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng glycine betaine

Hàm lượng glycine betaine được xác định theo phương pháp của

Grieve và Grattan (1983) [33]

+ Nguyên tắc: phương pháp phân tích glycine betaine bằng Kali triiod (KI-I2) dựa trên hợp chất amoni bậc 4 bị kết tủa bởi iod để tạo thành phức

chất periodide Phức chất periodide sau đó được chiết xuất bằng dichloroethan và dịch này hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 365 nm

1,2-+ Cách tiến hành: Lấy 0,5 g mẫu nghiền trong 5 ml nước cất Sau đó, ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 15 phút Lấy 1 ml dịch chiết, bổ sung thêm 1

ml H2SO4 2N Chuyển hỗn hợp này vào cốc thủy tinh, bổ sung thêm 0,2 ml dung dịch Kali triiod, toàn bộ hỗn hợp này được làm lạnh bằng đá khoảng 90 phút trên máy lắc Sau đó bổ sung 2 ml nước cất và 20 ml 1,2-dichloroethan vào hỗn hợp trên Bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365 nm Xác định hàm lượng proline dựa vào đồ thị glycine betain chuẩn

2.5.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử

Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp Betrand [3] + Nguyên tắc: Phương pháp này cho phép định lượng đường khử chính xác trong khoảng từ 1-40 mg Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm, các đường khử (glucose, fructose, mantose, ) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit (Cu2+ → Cu1+ ), kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ

gạch, qua đó tính được lượng đường khử

+ Cách tiến hành: Nghiền kỹ 5 g mẫu với 20 ml nước cất Chuyển hỗn hợp trên vào bình định mức và dẫn nước tới vạch 100ml Lấy 5 ml dịch chiết cho vào bình nón và thêm 20 ml thuốc thử Đun sôi hỗn hợp bên bếp cho đến khi thấy có kết tủa được tạo thành có màu đỏ gạch (Cu2O) Rửa tủa bằng nước nóng cho đến khi hết kềm Hòa tan tủa bằng Fe2(SO4)3 và chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N

2.5.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (1976) [17]

+ Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue (CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung