khả năng sinh kháng sinh kháng vi sinh vật từ xạ khuẩn

khả năng sinh kháng sinh kháng vi sinh vật từ xạ khuẩn

ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

========000========

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN

ðỀ TÀI KHCN ðẶC BIỆT CẤP ðẠI HỌC QUỐC GIA

Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật

và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn

Mã số: QG 09 48

Chủ trì ñề tài: TS Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học

Hà Nội, năm 2011

CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.8 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 30

3.1 ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở

3.3 Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 35 3.4 Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate 36

3.5 ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 42

3.5.1 ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces 42

3.5.2 Giải trình tự rDNA 16S ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea 44

3.6 Sàng lọc khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 45 3.7 Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 46

3.7.2 Phân tích HPLC dịch nuôi chiết trong ethyl acetate

PHẦN I BÁO CÁO TÓM TẮT

1 Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh

vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn

2 Mã số: QG.09.48

3 Thời gian thực hiện: 2 năm (2009 - 2011)

4 Cấp quản lý: ðại học Quốc gia Hà nội

5 Chủ trì ñề tài: TS Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ðHQGHN ðiện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: quyennhm@vnu.edu.vn

6 Cán bộ tham gia: - TS Nguyễn Quỳnh Uyển

- TS ðinh Thúy Hằng

- CN Lê Phương Chung

- ThS Phan Thị Hà

- CN Lê Hồng Anh

7 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam Các chất kháng sinh do các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng

Cụ thể là:

- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng

- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao

- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược

- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao

- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của chất chiết từ dịch nuôi của một số chủng có tiềm năng

- Phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi của các chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư làm cơ sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó

8 Các kết quả ñạt ñược

8.1 Kết quả về mặt khoa học

- 424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ñất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu thập tại vườn Quốc gia ñã ñược phân loại (bằng quan sát hình thái kết hợp với ñọc

trình tự gene rDNA 16S) cho thấy gần 70% thuộc chi Streptomyces, còn lại thuộc

nhóm xạ khuẩn hiếm Các chi xạ khuẩn hiếm có tỷ lệ cao trong bộ sưu tập này là

Micromonospora (hơn 7% trong tổng số 424 chủng), Nonomuraea (4%) và Nocardia

(gần 3%)

- 424 chủng xạ khuẩn này ñã ñược sàng lọc hoạt tính kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm

ñịnh ñại diện cho 3 nhóm vi sinh vật lớn là vi khuẩn (Gram âm: Escherichia coli, Gram dương: Micrococcus luteus), nấm men (Candida albicans) và nấm sợi (Fusarium oxysporium)

- 115 chủng trong số 424 chủng nói trên ñã biểu hiện hoạt tính kháng ít nhất một trong bốn vi sinh vật kiểm ñịnh

- Với 115 chủng có hoạt tính này có 2 chủng (A1073, A1393) kháng cả 4 chủng vi sinh vật kiểm ñịnh, 7 chủng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470) kháng với 3 chủng kiểm ñịnh, 8 chủng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427

và A444) có hoạt tính kháng 2 vi sinh vật kiểm ñịnh Xét về ñối tượng bị kháng thì 14

chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram âm (E coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn Gram dương (M luteus); 11 chủng có hoạt tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn; 12 chủng

có hoạt tính kháng nấm sợi (F oxysporium) và chỉ 6 chủng có hoạt tính kháng nấm men (C albicans) Như vậy tổng cộng có 17 chủng có hoạt tính kháng ít nhất 2 vi sinh

vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo ðiều thú vị là 17 chủng

này chỉ thuộc 2 chi Streptomyces (10 chủng) và Nonomuraea (7 chủng)

- 17 chủng ñã ñược nuôi cấy thu dịch nuôi và dịch nuôi ñã ñược chiết bằng ethyl acetate

ñể thu các hợp chất có hoạt tính sinh học Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate (từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg (chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444)

So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng A396)

- Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân tích sắc ký bản mỏng (TLC) ñể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin và với dịch nuôi của chủng ñối chứng sinh anthracycline (A16) Số băng thu ñược sau sắc ký dao ñộng từ 1 ñến 4 băng Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ

có 2 băng, 4 chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390, A1022) cho phổ 4 băng So với các kháng sinh chuẩn thì thấy chất chiết từ dịch nuôi của chủng A396 là có băng tương ứng với chloramphenicol; chất chiết từ dịch nuôi chủng A45 và A410 có băng trùng với băng của erythromycin, không có mẫu nào có băng tương ñồng với các băng của kháng sinh kitasamycin So với dịch nuôi của chủng ñối chứng sinh anthracycline, các mẫu A1018 và A1022 có phổ sắc ký rất gần với ñối chứng này

- Các chất tan trong ethyl acetate của 17 chủng lựa chọn ñược ñược tiếp tục phân tích qua sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các ñiều kiện sắc ký như với các kháng sinh chuẩn Kết quả cho thấy ngoài chủng A396 có ñỉnh tương tự với ñỉnh thu ñược từ chloramphenicol, tất cả các mẫu còn lại không tìm thấy mối tương quan nào so với các kháng sinh ñối chứng

- Một trong những nghiên cứu nữa ñược thực hiện với 17 chủng chọn lọc ñược là thực hiện thử nghiệm biến ñổi màu phụ thuộc pH ðây là phép thử ñặc hiệu ñối với các chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline Qua ñó nhận thấy có hai chủng có biểu hiện dương tính với phép thử này là A1018 và A1073

- Như vậy với các bước nghiên cứu liên quan, từ 17 chủng có hoạt tính kháng sinh tương ñối cao, 3 chủng ñược lựa chọn thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư người là A1018 (có phổ TLC và phản ứng ñổi màu pH tương tự chủng ñối chứng), A1022 (có phổ TLC tương tự ñối chứng) và A1073 (phản ứng ñổi màu pH)

- Bằng thử nghiệm với ba dòng tế bào ung thư người là ung thư gan, phổi và cơ vân tim, các hợp chất chiết từ dịch nuôi của cả ba chủng chọn lọc ñược của ñề tài ñều có tác dụng dương tính với cả ba dòng tế bào ung thư So sánh về chỉ số IC50 (nồng ñộ gây chết 50% tế bào ung thư, tức chỉ số này càng nhỏ thì hiệu quả gây ñộc tế bào càng lớn) thì thấy trong ba mẫu nghiên cứu chất chiết từ dịch chiết của chủng A1073 có chỉ số này thấp nhất và thấp gần bằng ñối chứng dương (một trong những chất có khả năng

diệt tế bào) của phép thử; thấp bằng so với chủng ñối chứng sinh anthracycline và thấp hơn ñáng kể so với hai chủng còn lại ðây là một trong những kết quả nổi bật nhất của

ñề tài, làm tiền ñề cho các hướng nghiên cứu tiếp theo

- Chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 3 chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư nói trên ñã ñược phân tích HPLC với cùng một ñiều kiện sắc ký với các ñối tượng tương tự hiện ñang ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử, Trung tâm công nghệ sinh học quốc tế, ðại học Tổng hợp Osaka Qua phân tích kết quả sau sắc ký các chất chiết ñược từ dịch nuôi chủng A1018 cho 8 ñỉnh khác nhau, từ chủng A1022 cho 5 ñỉnh khác nhau và chủng A1073 cho 6 ñỉnh khác nhau Các dữ liệu liên quan hiện ñang ñược so sánh phân tích với cơ sở dữ liệu hiện có tại cơ sở nói trên nhằm tìm kiếm bản chất của các chất ñó ðây là một kết quả thể hiện sự hợp tác quốc tế của ñề tài

8.2 Kết quả ñào tạo

ðề tài ñã góp phần ñào tạo 01 Thạc sỹ chuyên ngành công nghệ sinh học thuộc chương trình ñào tạo liên kết quốc tế với ðại học Liege, Vương quốc Bỉ với tên ñề tài là:

“Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam” Học viên Nguyễn Phương Chung ñã bảo vệ thành công luận văn với kết quả

xuất sắc trước Hội ñồng ngày 24 tháng 2 năm 2011

8.3 Bài báo

Kết quả của ñề tài ñã ñược ñúc kết thành 02 bài báo:

• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam Tạp chí Công nghệ sinh học (ñã nhận ñăng)

• Bước ñầu nghiên cứu sàng lọc kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn thu thập ở vườn Quốc gia Cát Bà, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, ðại học Quốc gia Hà Nội (ñã nhận ñăng)

9 Tình hình sử dụng kinh phí

- Tổng kinh phí của ñề tài ñược duyệt: 100.000.000 VNð

- Tổng kinh phí của ñề tài ñã quyết toán: 100.011.400 VNð, bao gồm các mục:

+ Chi phí thuê mướn: 40.000.000

+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 49.084.000

+ Photo tài liệu, văn phòng phẩm: 4.235.000

+ Hội họp: 1.500.000

+ Thông tin liên lạc: 442.000

+ Chi khác (lệ phí của ñơn vị DT): 4.750.000

Xác nhận của cơ quan Chủ trì ñề tài

Xác nhận của ðại học Quốc gia

SUMMARY

1 Project title: Investigation and study some substances which have antibiotic

activities against microorganisms and cancer cell lines from actinomycetes

2 Code: QG.09.48

3 Duration: 2009 – 2011

4 Organizer: Institute of Microbiology and Biotechnology,

Vietnam National University, Hanoi (VNUH)

5 Project leader: Dr Nguyen Huynh Minh Quyen

6 Key participants: Dr Nguyễn Quỳnh Uyển

Dr ðinh Thúy Hằng BSc Lê Phương Chung MSc Phan Thị Hà BSc Lê Hồng Anh

7 Objectives and study contents

Objective: This project was carried out to study biodiversity and to screen antibiotics from

actinomycete strains collected from a national park with high biodiversity in Vietnam, named Catba National Park The antibiotics produced by these strains were studied further in order to find out their nature

Study contents:

• Isolating actinomycete strains from soil and litter samples on Catba island (Hai Phong) and then evaluating their biodiversity

• Screening the strains possessing high antibiotic activities

• Primary extracting the antibiotics from these strains

• Studying the properties of these antibiotics by use thin layer chromatography (TLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC)

• Classifying and identifying the strains possessing high antibiotic activities by use their morphology and the sequences of 16S rDNA gene

• Testing cytotoxic activity of some potential strains

• HPLC analyses of the extracts from the strains capable of producing anticancer agents to obtain data base in order to study their nature

8 The obtained results

• 424 actinomycete strains, including 353 strains from soil and 71 strains form litter samples, were collected at Cat Ba island and then were classified As the result through their observation morphology and the sequences of 16S rDNA gene, the

genus Streptomyces occupied about 70%, the rare actinomycetes were the rest Among the latter, Micromonospora occupied more than 7%, Nonomuraea appeared about 4% and Nocardia was 3% in total

• 424 above strains were screened their antibiotic activity against 4 tested

microorganisms, representative for bacteria (Negative Bacterium: Escherichia coli; Positive Bacterium: Micrococcus luteus), yeast (Candida albicans) and fungi (Fusarium oxysporium)

• Of 424 strains above, 115 strains out were shown antimicrobial activity against at least one of the 4 testes microrganisms

• Among these 115 strains, 2 strains (A1073, A1393) were shown activity against all

of the 4 tested microrganisms, 7 strains (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470) against 3, 8 strains (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427 và A444) against 2 testes microrganisms Regarding the tested microorganisms, 14 strains were shown inhibitory activity to Negative bacterium

(E coli), 14 strains were shown inhibitory activity to Positive bacterium (M luteus); 11 strains were shown activity against both of these; 12 strains were shown activity against fungi (F oxysporium) and just only 6 strains were shown activity against yeast (C albicans) In general, 17 strains in total possessing activity

against at least 2 tested microoragnisms were selected for further study

Interestingly, 17 these strains jsut belonged to 2 genus Streptomyces (10 strains) and Nonomuraea (7 strains)

• 17 strains were cultured to get their cultured broths and the cultured broths were extracted by ethyl acetate in order to obtain bioactive compounds The yeild of extracted substances soluble in ethyl acetate (from 1 liter cultured broth) was variable from 30mg (strains A154) to 2152mg (strains A444) In comparison with their respective dry mass, extracted subtances occupied from 0,51% (strains A154)

to 14,89% (strains A396)

• The substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 17 actinomycete strains were analysed by thin layer chromatography (TLC) to compare their profile with that of three standard antibiotics (chloramphenicol, kitasamycin,

erythromycin) and the cultured broth of control strain, capable of producing anthracycline (A16) The bands obtained after chromatography were varied from 1

to 4 bands 8 strains (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) were shown 1 band, 3 strains (A396, A444, A1018) were shown 2 bands, 4 strains (A45, A1041, A1043, A1470) - 3 bands and 2 strains (A390, A1022) - 4 bands In comparison with the standard antibiotics, the substances extracted from the cultured broth of strain A396 were shown the similar band to chloramphenicol; substances extracted from the cultured broth of the strains A45 and A410 were shown the same band of erythromycin, none of them were shown the band similar

to the bands of antibiotic kitasamycin In comparison with cultured broth of control strain producing anthracycline, samples A1018 and A1022 were shown the chromatography profile very close with this of the control

• The substances soluble in ethyl acetate of the 17 selected strains were analysed by high performance pressure chromatography (HPLC) in the same condition as that

of the standard antibiotics Except strain A396, which was shown the peak similar

to that of chloramphenicol, the rest of the samples were not shown any connection with the control antibiotics

• Furthermore 17 selected strains tested to change the colour based on the enviromental pH This is a specific test for strains producing antibiotic of group anthracycline Two strains A1018 and A1073 were shown positive results in this test

• 3 strains out of 17 strains above (A1018 (the TLC profile and change the coulour based on pH were similar to that of the control strain), A1022 (TLC profile is similar to that of the control) and A1073 (change the coulour based on pH)) with relatively high antibiotic activity, were selected to test cytotoxicity against human cancer cell lines Crude extracts of three strains above exhibited significant cytotoxic activity against hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human cell lines

• By testing with hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human cell lines, the substances extracted from the cultured broths of three selected strains exhibited positive results against all of these cell lines By the comparison of IC50 value (i.e., the concetration of agents kills 50% cancer cells in number, which means the smaller this value is, the higher the cytotoxicity is), the substance

extracted from strain A1073 was shown the lowest value and this value is very close to that of the positive control of this test This value is also as low as that of the control strain producing anthracycline and significant lower in comparison with the rest of the two strains This is one of the outstanding results of the project and this provides the base to develop further research

• Substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 3 strains above were analysed by HPLC at the same chromatography condition for similar subjects at Molecular Microbiology Lab, International Center for Biotechnology, Osaka University HPLC analyses of ethyl acetate crude extracts of the three strains A1022, A1018 revealed relatively high complexity, possessing 5 peaks, 8 peaks and 6 peaks, respectively Their data base is going to compare with that available

at this Lab in order to find out the nature of these substances This is one of

international collaboration of the project

All of the results above resulted in 02 publications:

• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam Journal of Biotechnology (accepted)

• Primary screening anticancer antibiotic from actinomycetes isolated at Cát Bà National Park, Journal of Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam National Unversity, Hanoi(accepted)

Xác nhận của cơ quan Chủ trì ñề tài

Xác nhận của ðại học Quốc gia

PHẦN II BÁO CÁO TỔNG KẾT

GIẢI THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

DNA: Deoxyribonucleic acid

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

HPLC: High-performance liquid chromatography

rDNA 16 S: gene 16S của DNA ribosome

TE: ñệm có 10mM Tris-HCl và 1mM EDTA, pH8,0

TLC: Thin layer Chromatography

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ðỀ TÀI

1 Chủ trì: TS Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Danh mục bảng

Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Bảng 2.1 điều kiện phân tắch HPLC của các chất chuẩn

Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ựược

Bảng 3.2 Hoạt tắnh kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược

Bảng 3.3 Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược

Bảng 3.4 Tổng kết kết quả phân tắch HPLC chất chiết từ các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược

Bảng 3.5 Các ựặc ựiểm nhận dạng của 10 chủng thuộc chi Streptomyces

Bảng 3.6 Kết quả xác ựịnh hoạt tắnh gây ựộc tế bào

Bảng 3.7 Tổng kết kết quả phân tắch HPLC chất chiết từ 3 chủng có hoạt tắnh gây ựộc

tế bào ung thư

Danh mục hình

Hình 1.1 Kháng sinh ựược phát hiện qua các năm

Hình 1.2 Sự tiến hóa của penicillin G

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của daunorumycin (DNR) và idarumycin (IDA)

Hình 3.1 đánh giá hoạt tắnh kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn

Hình 3.2 Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược

Hình 3.3 Phổ HPLC của chloramphenicol (A) và chất chiết từ chủng A396 (B)

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc một số chủng Streptomyces

Hình 3.5 Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces

Hình 3.6 Cây chủng loại phát sinh trình tự rDNA 16S cho thấy vị trắ của 7 chủng xạ

khuẩn hiếm trong chi Nonomuraea

Hình 3.7 Sự thay ựổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng A1018 và A1073 Hình 3.8 Sắc ký ựồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1018

Hình 3.9 Sắc ký ựồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1022

Hình 3.10 Sắc ký ựồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1073

MỞ ðẦU

Sức khỏe luôn là một trong những vấn ñề ñược chú trọng nhất trong mỗi quốc gia Mặc dù các thành tựu có ñược trong ngành hoá dược ñã ñem lại sự phong phú về chủng loại dược phẩm, nhưng việc tìm kiếm và sử dụng trực tiếp các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị các bệnh nan y vẫn luôn là hướng ñược quan tâm hiện nay Trong một tổng kết về các loại dược phẩm hiện ñang lưu hành trên thế giới, Newman

và cộng sự (2003) ñã cho biết từ năm 1981 ñến năm 2002 trong tổng số 868 loại thuốc ñược phép ñưa vào sử dụng thì có ñến 58% là có nguồn gốc tự nhiên ðặc biệt con số này

là 62% ñối với thuốc dùng trong ñiều trị bệnh ung thư

Với nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú và ña dạng, Việt nam có cơ sở ñể phát triển ngành công nghệ sinh học theo hướng ứng dụng y-dược này ðây cũng là một bài toán ñặt ra cho ngành dược nước nhà trước tình hình thuốc nhập ngoại chiếm vị trí áp ñảo trên thị trường và trong các bệnh viện lớn ðể cung cấp nguồn nguyên liệu hỗ trợ cho ngành dược, các nghiên cứu về ñặc tính sinh học từ vi sinh vật có tác dụng chữa trị bệnh cần phải ñược chú trọng, nhằm tạo tiền ñề cho việc phát triển dược phẩm mới với tính năng ñiều trị cao và ít tác dụng phụ không mong muốn Sự suy thoái môi trường sống ở Việt nam hiện nay là nguyên nhân dẫn ñến ña dạng hoá các tác nhân gây bệnh Các bệnh viêm nhiễm và bệnh ung thư hiện ñang là ñối tượng cần thiết ñể các nhà nghiên cứu ñặt mục tiêu tìm kiếm các chất có công dụng ức chế từ nguồn vi sinh vật nội ñịa

Thay ñổi khí hậu, ô nhiễm môi trường sống là những yếu tố gây tác ñộng trực tiếp ñến sức khỏe của con người Theo dự báo toàn cầu, tại một số vùng trên thế giới, trong ñó

có Việt nam, tỷ lệ người mắc bệnh viêm nhiễm thông thường hay các bệnh nguy hiểm như ung thư, tim mạch ngày càng gia tăng (Ashutosh K., 2008; Goodfellow M., 1998)

Do vậy, việc nghiên cứu ñể tìm kiếm các chất có hoạt tính chữa trị bệnh từ các nguồn gốc

tự nhiên là một trong những hướng nghiên cứu trọng tâm của ngành công nghệ sinh học tại nhiều quốc gia, ñặc biệt ở các nước phát triển ðể nắm bắt ñược những kỹ thuật tiên tiến trong lĩnh vực này và từng bước hoà nhập với sự phát triển chung, ñồng thời ñể ñáp ứng nhu cầu trong việc bảo vệ sức khoẻ cộng ñồng, Việt nam cần chú trọng khai thác nguồn ña dạng vi sinh vật của mình làm nguyên liệu ñể phát triển dược phẩm Vì lẽ ñó chúng tôi ñã ñề xuất và ñã ñược ðại học quốc gia Hà Nội phê duyệt thực hiện ñề tài:

“ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng

tế bào ung thư từ xạ khuẩn”

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 Kháng sinh

1.1.1 Khái niệm chung

Theo ñịnh nghĩa truyền thống thì kháng sinh (còn ñược gọi là trụ sinh) là những

chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách ñặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp ñộ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn Theo ñịnh nghĩa hiện nay, kháng sinh ñược hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vật sinh ra và ở nồng ñộ thấp chúng có thể kìm hãm sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt (các) vi sinh vật khác (Nduka, 2007)

Hiện nay các chất có hoạt tính sinh học có khả năng diệt khuẩn gồm các chất kháng sinh truyền thống, các sản phẩm trao ñổi chất như các acid lactic do các vi khuẩn lactic sinh ra, các chất phân giải như lysozyme, các loại ngoại ñộc tố có bản chất protein, các bacteriocin… Các “vũ khí sinh học” này ñược quan tâm ñặc biệt do tính ña dạng và

cả do chúng có nhiều trong tự nhiên (Margaret & Milind, 2007)

Thực, ñộng vật bậc cao cũng có khả năng sinh “kháng sinh” tuy nhiên các hợp chất này nằm ngoài ñịnh nghĩa nói trên Tương tự như vậy, mặc dù cũng do vi sinh vật sinh ra nhưng bacteriocin cũng không ñược coi là kháng sinh không chỉ vì chúng có khối lượng phân tử không lớn như các chất kháng sinh thông thường khác mà còn do chúng chủ yếu ảnh hưởng ñến các vi sinh vật gần với vi sinh vật sản sinh ra bacteriocin So với bacteriocin, các chất kháng sinh ña dạng về bản chất hóa học và tấn công các vi sinh vật không có quan hệ họ hàng ðiểm khác biệt quan trọng nữa là trong khi thông tin di truyền của các chất kháng sinh thường nằm trên một vài gen thì bacteriocin chỉ cần gen ñơn (Nduka, 2007) ðến nay ñã có khoảng 16.500 kháng sinh ñược phát hiện từ vi sinh vật, và hàng năm hàng chục kháng sinh mới ñược phát hiện (Hopwood, 2007)

1.1.2 Lịch sử phát triển kháng sinh

Kháng sinh là thuốc ñược con người dùng chủ yếu ñể chống các bệnh truyền nhiễm Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần rất lớn trong các bệnh của con người và ñộng vật Cho ñến nửa sau của thế kỷ 19 người ta ñã phát hiện ra rằng vi sinh vật chính là thủ phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm Do ñó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi sinh vật gây bệnh ñã ñược phát triển thành liệu pháp ñiều trị chính

Vào năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh này ñã ñược dùng trong ñiều trị vào những năm 1940 Ngay sau ñó penicillin ñã trở thành một kháng sinh nổi tiềng vì ñã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh thế giới II (Saga & Yamaguchi, 2008)

Từ những năm 1940 ñến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới ñược xác ñịnh hầu hết từ xạ khuẩn, và ñó trở thành thời kỳ vàng son của hóa liệu pháp kháng sinh (Hình 1.1)

Hình 1.1 Kháng sinh ñược phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007)

Năm 1944, streptomycin ñược phát hiện từ vi khuẩn ñất Streptomyces griseus Sau

ñó ñến chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thuộc nhóm macrolide và glycopeptide (tức vancomycin) ñược phát hiện từ vi khuẩn ñất Các kháng sinh tổng hợp như nalidixic acid, thuốc chống vi sinh vật có bản chất quinolone ñã ñược tạo ra vào năm

1962 Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu ñược phổ kháng vi sinh vật rộng hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn ví dụ như các kháng sinh β-lactam Lớp β-lactam gồm penicillin, cephem, carbapenem và monobactam Penicillin ban ñầu có tác dụng hiệu

quả lên vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus Sau ñó, S aureus sinh ra các

enzyme phân giải penicillin- penicillinase, nên người ta phát triển methicillin Bên cạnh

ñó, ñể mở rộng phổ tác dụng của ampicillin (là kháng sinh chống vi khuẩn Gram âm

Enterobacteriaceae) người ta ñã phát triển ñược piperacillin có thể kháng ñược cả Pseudomonas aeruginosa (Hình 1.2)

Hình 1.2 Sự tiến hóa của penicillin G (Saga et al, 2008)

Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong ñiều trị ở thế kỷ 20 ñã làm giảm ñáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn Tuy nhiên từ 1980 số kháng sinh mới ñược ñưa vào ñiều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn Bên cạnh ñó, một hiện trạng ñáng báo ñộng là ngày càng tăng các vi sinh vật gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn phải ñược khắc phục bằng việc phát hiện ra các thuốc mới Tuy nhiên vi sinh vật càng ngày càng nhanh kháng thuốc và tốc ñộ ñó lại nhanh hơn tốc ñộ tạo ñược thuốc mới của con người

Do vậy, các nghiên cứu cần phải tập trung vào làm thế nào ñể vượt qua tính kháng thuốc kháng sinh cũng như phát hiện các kháng sinh mới có các cơ chế hoạt ñộng khác nhau (Fred, 2006)

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Có một số phương pháp phân loại kháng sinh Một trong những phương pháp ñó là dựa vào kiểu hoạt ñộng tức là kháng sinh ñó tác ñộng lên vách tế bào, kìm hãm protein… Tuy nhiên có khi một kháng sinh lại có nhiều cơ chế ñồng thời cùng tác ñộng nên cách phân loại này khó áp dụng Một số trường hợp kháng sinh ñược phân loại dựa trên vi sinh vật sản sinh ra kháng sinh ñó Nhưng khi ñó có trường hợp một vi sinh vật có thể sinh ra

một số kháng sinh như Streptomyces sp có thể sinh penicillin N và cephalosporin Ngược

lại một kháng sinh cũng có thể do nhiều vi sinh vật sinh ra Kháng sinh cũng ñã ñược phân loại dựa theo con ñường sinh tổng hợp Phổ tác ñộng cũng ñược dung, ví dụ như tác

ựộng lên vi khuẩn, nấm, nguyên sinh ựộng vậtẦ Tuy nhiên một loại/nhóm kháng sinh

như aminoglycoside lại có thể có phổ tác dụng khác nhau (Nduka, 2007; Tortora et al,

2010)

Cách phân loại nêu dưới ựây là dựa trên cấu trúc hóa học của kháng sinh và theo

ựó kháng sinh ựược phân thành 13 nhóm (Bảng 1.1) (Nduka, 2007)

Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học

a Aminoglycoside là nhóm các kháng sinh mà các ựường amino ựược liên kết bằng

liên kết glycoside Streptomycin và gentamicin là các vắ dụ ựiển hình của nhóm này Streptomycin vẫn còn là thuốc thay thế trong ựiều trị bệnh lao, nhưng do sự phát triển tắnh kháng thuốc nhanh chóng và các ảnh hưởng ựộc hại nghiêm trọng ựã làm hạn chế việc sử dụng kháng sinh này Các aminoglycoside kìm hãm tổng hợp protein ở nhiều vi khuẩn Gram âm và một số vi khẩn Gram dương đôi khi chúng ựược dùng kết hợp với penicillin

Thành viên của nhóm này thường có xu hướng ñộc hơn các nhóm kháng sinh khác

(Tortora et al, 2010)

b Beta-lactam là các kháng sinh ñã ñược sử dụng rất nhiều và rất quan trọng trong ñiều trị như penicillin, cephalosphorin cũng như các loại tương ñối mới như cephamycin,

nocardicin, thienamycin và clavulanic acid (Nduka, 2007)

Penicillin là chất diệt khuẩn, kìm hãm sự tạo thành vách tế bào Có 4 loại penicillin: penicillin-G phổ hẹp, ampicillin và các chất tương tự, các penicillin kháng penicillinase

và các penicillin phổ rộng có thể kháng các vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas Các penicillin-G kháng hiệu quả các chủng Gram dương như Streptococcus, Staphylococcus,

và một số vi khuẩn Gram âm như Meningococcus Penicillin-G ñược dùng ñể ñiều trị các

bệnh như giang mai, lậu, viêm màng não, lao và bệnh ghẻ cóc (yaws) Penicillin V có hoạt ñộng tương tự nhưng hiệu lực thấp hơn Ampicillin và amoxicillin có tác dụng tương

tự penicillin-G nhưng có phổ tác dụng rộng hơn bao gồm cả một số vi khuẩn Gram âm

(Tortora et al, 2010)

c Chloramphenicol kìm hãm sự sinh trưởng của nhiều vi khuẩn Gram dương và âm,

ñây là kháng sinh phổ rộng ñầu tiên ñược sử dụng trong ñiều trị Chloramphenicol ñược

sản xuất từ nuôi cấy vi khuẩn ñất Streptomyces venezuelae Chloramphenicol kìm hãm

sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gây nhiễu hoạt tính xúc tác của transferase của ribosome trong pha kéo dài của phiên mã Do phân tử lượng thấp, kháng sinh này có thể thâm nhập vào nhiều vùng của cơ thể mà các loại thuốc khác không thể thâm nhập ñược Tuy nhiên, chloramphenicol có các ảnh hưởng bất lợi, trong ñó quan trọng nhất là kìm hãm hoạt ñộng của tủy xương do ñó ảnh hưởng ñến sự tạo thành tế bào

peptidyl-máu (Creighton, 1999; Nduka, 2007)

d Macrolide là nhóm các kháng sinh ñược ñặt tên do có mặt vòng macrocyclic lactone

trong phân tử Macrolide ñược dùng nhiều nhất trong ñiều trị là erythromycin Kiểu hoạt ñộng của nó là kìm hãm tổng hợp protein Erythromycin có tác dụng hiệu quả lên các cầu khuẩn Gram dương và thường ñược dùng ñể thay thế penicillin trong các bệnh nhiễm

Streptococcus và Pneumococcus Macrolide còn ñược dùng trong ñiều trị bệnh bạch hầu

và nhiễm trùng huyết (bacteremia) Tác dụng phụ của nhóm kháng sinh này có thể gồm nôn, mửa và tiêu chảy, ñôi khi gây suy giảm thính giác (Nduka, 2007)

e Tetracycline là nhóm kháng sinh phổ tương ñối gần nhau do Streptomyces spp sinh ra

Tetracycline ảnh hưởng tới sự gắn tRNA mang amino acid vào ribosome ở tiểu ñơn vị 30S của ribosome 70S do ñó ngăn cản sự bổ sung amino acid vào chuỗi polypeptide ñang

tổng hợp Tetracycline là các kháng sinh phổ rộng kháng các Streptococcus, Bacillus

Gram âm, rickettsia (gây sốt thương hàn) và Spirochetes (gây bệnh giang mai) Các kháng

sinh này cũng ựược dùng ựể ựiều trị nhiễm trùng ựường tiết niệu và viêm cuống phổi Nhờ phổ tác dụng rộng, tetracycline ựôi khi làm thay ựổi cân bằng hệ vi khuẩn nội sinh thông thường ựược duy trì/kiểm soát bởi hệ miễn dịch của cơ thể, dẫn ựến việc nhiễm khuẩn thứ cấp vắ dụ như ở hệ tiêu hóa hay âm ựạo Việc sử dụng tetracycline hiện nay còn

bị hạn chế do sự tăng tắnh kháng của các chủng vi khuẩn (Nduka, 2007)

1.1.4 Kháng sinh kháng ung thư (Anti-tumor antibiotics)

Ở sinh vật bậc cao mỗi tế bào có chức năng nhất ựịnh ựược thực hiện trong mối tương tác/liên hệ với các tế bào khác đôi khi, tế bào mất liên hệ với các tế bào xung quanh và phân chia một cách không ngừng ựể tạo thành cấu trúc gọi là khối u hay ung thư Ung thư ựược ựiều trị bằng một trong ba liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp gồm phẫu thuật ựể loại bỏ khối u, chiếu xạ ựể phá hủy chọn lọc các tế bào ung thư hoặc hóa trị Nhiều chất hóa học dùng trong hóa trị liệu ung thư là các sản phẩm thứ cấp do vi sinh vật

sinh ra do ựó ựược gọi là kháng sinh chống/kháng khối u (Nduka, 2007; Carlos et al,

2009) Một số nhóm kháng sinh ựã ựược dùng trong ựiều trị ung thư có thể kể ựến là anthracycline, actinomycin và bleomycin

Anthracycline ựược sử dụng rộng rãi trong ựiều trị ung thư như ung thư máu, ung thư bạch huyết, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư

vú, ung thư bàng quang (Gewirtz, 1999) Một số

chủng ựược cho là sinh anthracycline là

Streptomyces coeruleorubidus hoặc

Streptomyces peucetius Nhóm kháng sinh này

cho ựến nay ựược ghi nhận gồm daunorubicin

(DNR), doxorubicin, epirubicin và idarumycin

(IDA) (Hình 1.3) Daunorubicin và adriamycin

gắn vào các cặp base do ựó kìm hãm tổng hợp

RNA và DNA Mithramycin và chromomycin

A3 (là các actinomycin), kìm hãm tổng hợp

RNA phụ thuộc DNA Bleomycin tương tác và

làm ựứt gãy DNA (Nduka, 2007; Carlos et al,

2009)

1.1.5 Nhu cầu phát triển kháng sinh mới

Một trong các thành tựu của y học hiện

ựại là phát triển các chất kháng sinh và các chất

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của

daunorumycin (DNR) và

idarumycin (IDA)

kháng vi sinh vật khác Tuy nhiên, rõ ràng là các vi sinh vật ñã và ñang phát triển tính kháng với các kháng sinh hiện có bằng các ñột biến mới hoặc thay ñổi thông tin di truyền

(Arnold et al, 2009) Cần phải có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi

khuẩn kháng thuốc, ñặc biệt là các hợp chất chống khối u và vật ký sinh (anti-parasitic) Tuy nhiên việc tìm kiếm các kháng sinh chống ung thư khó hơn nhiều so với các chất kháng khuẩn hay kháng nấm về mặt phương pháp và biểu hiện (interpretation) (Nduka, 2007) Hơn nữa còn cần các kháng sinh mới cho nông nghiệp ñể làm thuốc chữa bệnh cho cây trồng và vật nuôi vì các bệnh ñó sẽ ảnh hưởng ñến con người thông qua chuỗi thức ăn

1.2 Xạ khuẩn

1.2.1 Các ñặc ñiểm chung

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất ña dạng trong ñó ña số sinh trưởng hiếu khí

và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Tên xạ khuẩn –actinomycete- bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và ban ñầu xạ khuẩn ñược coi là nấm nhỏ vì chúng sinh trưởng giống với nấm Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở

cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất (Ashutosh, 2008) ða số xạ khuẩn sinh bào tử, bào tử rất khác nhau về hình dạng và kích

thước ðây là một trong những ñặc ñiểm ñể phân loại

Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA ða số xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong ñất, nước và xác thực vật Xạ khuẩn ñóng vai trò về mặt sinh thái quan trọng trong vòng tuần hoàn tự nhiên Chúng phân hủy

và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong ñất Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp chất liên quan ñến lignin bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose và hemicellulose và các peroxidase ngoại bào

(Pasti et al., 1990; Mason et al., 2001) Các chủng xạ khuẩn cũng xuất hiện trong môi

trường giàu hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu nhiệt (thermophilic) (Steger, 2006), và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứa mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn ñịnh, ñặc trưng (Seong

et al., 1999, Goodfellow et al., 1996)

Nhìn chung, nhiệt ñộ ôn hòa 25-30°C và pH trung tính là các ñiều kiện tối ưu cho

xạ khuẩn phát triển Mặc dầu vậy, nhiều loài ñã ñược phân lập ở các môi trường khắc

nghiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh ñược phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt ñộ 0°C (Chen et al., 2005) và Nocardiopsis alkaliphila ñược phân lập từ ñất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH 9.5-10 (Hozzein et al., 2004)

Về mặt phân loại, lớp xạ khuẩn có 5 phân lớp, 6 bộ trong ñó bộ ñược nhắc ñến

nhiều nhất (có giá trị trong y học và kinh tế) là bộ Actinomycetales Bộ Actinomycetales

có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi (http://en.wikipedia.org/wiki/Actinobacteria)

Xạ khuẩn thường ñược chia thành hai loại: Streptomyces và không phải Streptomyces (non-Streptomyces) Chi xạ khuẩn ñược biết nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500 loài, tất cả ñều có GC cao (69–73 %) trong DNA Streptomyces ñặc biệt

nhiều trong ñất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều phức các chất hữu cơ bằng các enzyme ngoại bào Thực tế, mùi mốc ñặc trưng của nhiều loại ñất liên quan ñến sự sản sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi gọi là geosmin (http://science.howstuffworks.com/question479.htm) Một phần rất lớn các chất kháng

sinh ñược sự dụng hiệu quả trong ñiều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces trong ñó

ñược biết ñến nhiều nhất là streptomycin, erythromycin và tetracycline (Stuart, 2005)

1.2.2 Xạ khuẩn và các chất thứ sinh

Xạ khuẩn ñược ñặc biệt quan tâm là do khả năng sinh ra các hợp chất thứ sinh có giá trị ứng dụng cao Trong các hợp chất tự nhiên do vi sinh vật sinh ra ñã ñược công bố

sử dụng trên toàn thế giới thì 45% ñược sinh ra từ xạ khuẩn, 38% từ nấm và 17% từ vi

khuẩn ñơn bào (Arnold et al, 2009) Hai phần ba kháng sinh ñã biết ñược sinh ra bởi xạ khuẩn chủ yếu từ các loài Streptomyces (Miyadoh, 1997) Các hợp chất kháng sinh khác

nhau của xạ khuẩn ñã ñược nghiên cứu ñặc ñiểm gồm aminoglycoside, anthracyclin, glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide,

actinomycin và tetracycline (Goodfellow et al., 1988) Các hợp chất này ñã ñược sử dụng

thành công làm thuốc giệt cỏ, thuốc chống ung thư, thuốc, các chất ñiều hòa miễn dịch và

các chất chống ký sinh trùng (Thomson et al, 1995)

1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam

Ở Việt Nam xạ khuẩn ñã ñược quan tâm nghiên cứu khá nhiều trong ñó các nghiên cứu tập trung vào ñặc ñiểm sinh học (Biền Văn Minh, 2000-2004), tối ưu hóa môi trường nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998, Lê Gia Hy, 1994…), khả năng sinh kháng sinh kháng các vi sinh vật gây bệnh thực vật (như vi khuẩn héo lá, nấm thực vật, nấm ñạo ôn, nấm thối cổ rễ…) (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs, 1992, 1994, 2005), kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện (Nguyễn Phú Hùng và cs, 2009) Ngoài ra còn có công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần nhằm nâng cao hiệu quả sinh kháng sinh của xạ khuẩn (Vi Thị ðoan Chính, 2000), hay sản xuất kháng sinh b-lactam (Lê Gia

Hy và Phạm Thị Bích Hợp, 2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số xạ

khuẩn (Lại Thúy Hiền và cs., 1998), nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh (Lê Gia Hy và cs, 2005)

Cho ñến nay chưa thấy công trình nào ñề cập ñến kháng sinh kháng ung thư có nguồn gốc từ xạ khuẩn ở Việt Nam

1.4 Nội dung và mục ñích của nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam Các chất kháng sinh do các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng

Cụ thể là:

- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng

- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao

- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược

- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao

- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của dịch chiết từ dịch nuôi của một số chủng có tiềm năng

- Phân tích HPLC chất chiết từ các chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư làm cơ

sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó

CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu

Các chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu ñất và rác thu thập từ Cát Bà năm 2008 là ñối tượng nghiên cứu của ñề tài này

Chủng xạ khuẩn Nonomuraea roseoviolacea có ký hiệu A16 do National Institute

of Technology and Evaluation (NITE, Nhật Bản) cung cấp ñược dùng làm ñối chứng như

xạ khuẩn sinh anthracycline trong các phân tích sắc ký và ñộc tố tế bào

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất ñược sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật ñều là những hóa chất có tiêu chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn như Merck (ðức), Sigma (Mỹ) Hoá chất và một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer (Hàn Quốc), Fermentas (ðức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ), BioRad (Mỹ) cung cấp Các hóa chất dùng cho HPLC ñạt tiêu chuẩn cho phân tích này

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Nghiên cứu ñược thực hiện chủ yếu tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – ðại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hoá phân tích ñạt tiêu chuẩn quốc tế

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn

Hai phương pháp phân lập ñã ñược sử dụng trong ñề tài là phương pháp sấy khô

(Nonomura et al, 1969) và phương pháp ly tâm-hoàn ẩm (rehydration–centrifugation) (Hayakawa et al, 2000)

Trong phương pháp sấy khô, các mẫu ñất và rác ñược làm khô ở nhiệt ñộ phòng trong 5-7 ngày rồi xử lý ở nhiệt ñộ 90 – 110 0C trong 10 – 30 phút ñể loại bỏ các vi khuẩn không sinh bào tử (hầu hết các bào tử xạ khuẩn không chết ở ñiều kiện này) Tiếp theo, các mẫu ñược trải lên môi trường HV (môi trường thạch có humic acid và vitamin: humid acid 1 g, CaCO3 0,02 g; FeSO4.7H2O 0,01 g; KCl 1,71 g; MgSO4.7H2O 0,05 g; Na2HPO4

0,5 g, cycloheximine 50 mg, nalidixic acid 20 mg, kabicidine 14 mg, thạch 18 g, H2O 1 L,

pH 7,2) và nuôi ở 28 – 300C trong 7 ñến 14 ngày Các khuẩn lạc xạ khuẩn với hình thái khác nhau ñược nhặt và chuyển sang môi trường YS (môi trường thạch chứa dịch chiết

nấm men và tinh bột: glucose 10 g, cao nấm men 2 g, thạch 17 g, H2O 1 L, pH 7,0) ñể tạo sinh khối tế bào nhiều hơn

Phương pháp ly tâm-hoàn ẩm (RC) là một phương pháp phân lập ñặc hiệu với xạ khuẩn ñộng Các bước tiến hành như sau:

− Lấy 0.5 g mẫu ñất và rác ñã ñược phơi khô cho vào bình tam giác 100 ml, nhẹ nhàng thêm 50 ml ñệm phosphate 10 mM (pH = 7) chứa 10% dịch chiết ñất (trộn

500 g ñất với 500 ml nước cất trong bình tam giác, khử trùng ở 121°C trong 30 phút, lọc hai lần, khử trùng và bảo quản ở 4°C)

− ðậy bình bằng giấy nhôm và nuôi ở 30°C trong 90 phút ñể giải phóng các ñộng bào

tử (motile zoospores)

− Chuyển 8 ml dịch nổi vào ống falcon 15 ml, ly tâm ở nhiệt ñộ phòng trong 20 phút

ở 1,500 g ñể loại bỏ các xạ khuẩn không ñộng ðể các ống ổn ñịnh trong 30 phút

− Lấy 1 ml dịch nổi rồi pha loãng bậc 2 bằng nước sạch ñã khử trùng, lấy 0,2 ml của các bậc pha loãng 10-2, 10-3 và 10-4 cho lên ñĩa môi trường thạch HV và nuôi ở 28 –

30°C trong 2 – 3 tuần ñể tạo khuẩn lạc

− Nhặt các khuẩn lạc ñược tạo thành và chuyển vào ñĩa môi trường thạch HV mới ñể thuần khiết lần thứ hai rồi chuyển sang môi trường thạch YS ñể tạo sinh khối

Tất cả các chủng xạ khuẩn phân lập bằng hai phương pháp nói trên ñều ñược lưu giữ

ở -80°C trong dung dịch glycerol 20% tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (Vietnam Type Culture Collection-VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ðại học Quốc gia Hà Nội

2.2.2 Các vi sinh vật kiểm ñịnh

Bốn chủng vi sinh vật do VTCC cung cấp, gồm Micrococcus luteus (có ký hiệu VTCC-B-644), Escherichia coli (VTCC-B-428), Candida albicans (VTCC-Y-674) và Fusarium oxysporium (VTCC-F-239) ñược sử dụng làm ñích ñể sàng lọc hoạt tính kháng

vi sinh vật Các chủng này ñược nuôi trong các môi trường dinh dưỡng thích hợp, cụ thể

là môi trường Mueller-Hinton (MHA: cao thịt 0,3%; casein thủy phân 1,75%; tinh bột

0,15%; pH 7,4) ñối với E coli và M luteus, môi trường cao nấm men/malt (YM; glucose 1%, peptone 0,5%; cao nấm men 0,3%; cao malt 0,3%) ñối với C albicans và F oxysporum Việc nuôi cấy ñược tiến hành trong ñiều kiện lắc ở 37 °C ñối với E coli và

M luteus hoặc 30°C ñối với C albicans và F oxysporum

2.2.3 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh

Trước tiên, tất cả các chủng xạ khuẩn ñược hoạt hóa trong ñĩa môi trường YS ở

30°C trong 3–4 ngày Sau ñó các chủng ñược nuôi trong môi trường ñậu tương lỏng (tinh bột 25 g, bột ñậu tương 15 g, cao nấm men 1 g, CaCO3 4 g, nước cất 1 L, pH 6,2) ở 30°C trong 3 ngày có lắc với tốc ñộ 100 vòng/phút Sau thời gian nuôi cấy, dịch nuôi ñược ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 15 phút Dịch nổi thu ñược ñược dùng ñể ñánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật Có hai bước ñánh giá hoạt tính:

a Phương pháp thỏi thạch

Các mảnh thạch có ñường kính 5 mm ñược cắt từ ñĩa môi trường YS có chủng xạ khuẩn mọc rất tốt ñược ñặt lên bề mặt các ñĩa thạch trước ñó ñã ñược cấy vi sinh vật kiểm ñịnh và nuôi trong ñiều kiện thích hợp trong 2 ngày Hiệu quả kìm hãm ñược ñánh giá thông qua sự tạo thành các vùng kìm hãm quanh mảnh thạch có xạ khuẩn và hoạt tính ñược ño bằng ñường kính của các vùng này (Ichikawa T và cộng sự, 1971)

b Phương pháp khuếch tán dịch nuôi

Các giếng nhỏ ñược ñục trên các ñĩa thạch rắn trước ñó vừa ñược cấy vi sinh vật kiểm ñịnh Nhỏ khoảng 25 µ l dịch nuôi ñã ly tâm vào các giếng và nuôi trong 2 ngày dưới các ñiều kiện thích hợp với vi sinh vật kiểm ñịnh Hoạt tính kháng sinh ñược ñánh giá thông qua các vòng kìm hãm ñược tạo thành quanh giếng Các thí nghiệm ñược lặp lại hai lần và dịch môi trường ban ñầu ñã khử trùng ñược dùng làm ñối chứng âm (Alex Y l T., Hai M.T 2006)

2.2.4 Chiết bằng ethyl acetate

Dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn trong môi trường ñậu tương lỏng sau ly tâm (ở 8000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt ñộ phòng) loại bỏ tế bào ñược tách chiết theo mô

tả của Guoliang Yin và cộng sự với một số thay ñổi cho phù hợp (Guoliang Yin và cs, 2010) Bốn thể tích ethyl acetate ñược thêm vào rồi ñược lắc kỹ trong 1 giờ Phần hòa tan ñược thu lại bằng bình chiết sau ñó ñược bổ sung sulfate natri sao cho có nồng ñộ là 5 g.L-1 Dung môi ñược loại bỏ bằng máy loại dung môi Phần cắn thu ñược sẽ ñược xử lý tùy theo mục ñích thí nghiệm tiếp theo

ðể tiến hành sắc ký, phần cắn sẽ ñược hòa tan trong chloroform (Westley J.W., và cs., 1979).Tuy nhiên trước khi tiến hành sắc ký, dịch chiết thô trong chloroform sẽ ñược kiểm tra lại hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp ñã mô tả 2.2.3.b với chloroform

là chứng âm

ðối với phép thử ñộc tố tế bào cắn ñược thu lại ở dạng rắn Việc tiến hành xử lý tiếp theo ñược tuân thủ theo quy trình mô tả ở 2.2.7

2.2.5 Sắc ký các chất chiết thu ñược

2.2.5.1 Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)

Phân tích TLC ñược tiến hành trên bản Silica Gel G (20 x 10 cm) với hệ dung môi chloroform : methanol (90:10) Chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin dịch chiết thô của anthracyclines (do chủng A16 sinh ra) ñược dùng làm chuẩn so sánh Các băng ñược hiển thị bằng tia UV (bước sóng 254 và 366 nm) hoặc bằng phun sulfuric acid (H2SO4) 10% và cố ñịnh ở 120 °C trong 5-10 phút (Irena C., 2010, Matook S M., Fumio H., 2005)

2.2.5.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

a Sắc ký so sánh với các kháng sinh chuẩn

Phân tích này ñược tiến hành trên hệ thống Agilent 1100 series HPLC (Mỹ) với cột C18 Synchropak RP-4 (250 mm × 4.6 mm, ID 11704457 Agilent, Mỹ) và UV detector Dung dịch các kháng sinh chuẩn (chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin) ñặc ñược pha trong methanol ở nồng ñộ 1 mg.ml−1 và bảo quản ở 4 °C trong tối Nồng ñộ và ñiều kiện sắc ký áp dụng cho các chất chuẩn thay ñổi tùy theo bản chất hóa học của chúng và ñược nêu cụ thể ở bảng 2.1

Bảng 2.1 ðiều kiện phân tích HPLC của các chất chuẩn

Kháng sinh Bản chất hóa học ðiều kiện phân tích

Tài liệu tham khảo

Chloramphenicol

Công thức:

C11H12Cl2N2O5 MW: 323.132

Pha mang: 25% acetonitril (pH 6)

Vận tốc: 1 ml min

−1

Nhiệt ñộ cột: 30 °C Bước sóng: 270 nm

Jeffrey R.K

Pha mang: acetonitril (25%) : phosphate buffer (0.05M, pH 6.3) = 3 : 7 (vol:vol)

Vận tốc: 1 ml min

−1

Nhiệt ñộ cột: 35 °C Bước sóng: 200 nm

Stubbs C., et al (1985)

Nhiệt ñộ cột: 40 °C Bước sóng: 232 nm

Horie M., et.al

(1996); Leo M L

Pha mang: Dung môi A (0.1%

formic acid trong nước) : Dung môi B(0.1% formic acid trong acetonitril) = 70 : 30 (vol:vol)

Vận tốc: 1 ml min

−1

Nhiệt ñộ cột: 30 °C Bước sóng: 480 nm

Kristof

M

(2009), Young

S.R., et

al., 2001

Các mẫu ñược phân tích với mỗi chuẩn trong cùng ñiều kiện Trước khi cho mẫu cột ñược rửa bằng ñệm cho ñến khi cân bằng Thể tích mẫu là 10 µl

b Sắc ký phân tích trên các bước sóng khác nhau

Phân tích ñược tiến hành trên hệ thống tự ñộng Agilent 1200 series HPLC (Mỹ) với DAD detector với các ñiều kiện: cột: Varian, Microsorb MV 100C18, 100mm x 4.6 mm, kích thước hạt 3 µm; pha ñộng : 0,15 % KH2PO4 (pH 3,5) và acetonitril (CH3CN) có gradient (0 - 3 phút: 15 %, 3 - 6 phút: 40 %, 6 - 12 phút: 40 %, 12 - 19 phút: 45 %, 19 -

22 phút: 85 %, 22 - 29 phút: 85 %, 29 - 32 phút: 15 %); vận tốc: 1,2 ml/phút; nhiệt ñộ lò cột: 30 'C; bước sóng: UV/VIS 190 - 600 nm (khoảng cách 2 nm) Các mẫu chất chiết ñược hòa tan trong DMSO Phần nghiên cứu này ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật phân tử, Trung tâm Công nghệ sinh học quốc tế (International Centre of Biotechnology-ICBiotech), ðại học Tổng hợp Osaka, Nhật Bản

2.2.6 Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline

Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn ñược sàng lọc bằng phép thử màu Bản chất của phép thử như sau: Do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo hóa học, các anthracycline thay ñổi màu sắc tùy theo pH của môi trường, cụ thể là có màu

da cam ở pH acid và màu tím khi ở pH base ðặc tính này ñược dùng ñể sơ bộ sàng lọc

các chủng sinh anthracycline trong số các chủng xạ khuẩn phân lập ñược (Trease G E., Evans W C., 1996)

Cách tiến hành như sau: ñục 2 giếng nhỏ trên ñĩa thạch trước ñó ñã ñược nuôi xạ khuẩn (khoảng 4 – 5 ngày tuổi) Nhỏ vào mỗi giếng 25 µl HCl (1N) hoặc NaOH (2N) Quan sát màu quanh giếng sau 10 – 20 phút

2.2.7 Phép thử ñộc tế bào

Khả năng gây ñộc tế bào của các chất chiết ñược từ dịch nuôi xạ khuẩn ñược xác ñịnh theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự (1993) hiện ñang ñược áp dụng tại Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia (Hoa Kỳ) và trường Dược, ðại học Illinois, Chicago (Hoa Kỳ) Phép thử ñược thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Cụ thể là:

Ba dòng tế bào ung thư của người gồm ung thư gan (hepatocellular carcinoma, G2), ung thư phổi (lung cancer, Lu) và ung thư cơ vân tim (rhabdosarcoma, RD) ñược

Hep-dùng ñể sàng lọc hoạt tính gây ñộc tế bào bằng phép thử Sulforhodamine B (SRB assay) Các dòng tế bào này ñược cho vào ñĩa 96 giếng (mỗi giếng chứa 2x103 tế bào) rồi cho chất cần thử (ở ñây là chất chiết từ dịch nuôi xạ khuẩn như ñã mô tả ở 2.2.4 với các nồng ñộ pha theo thang 10) hòa tan trong DMSO Sau ñó các ñĩa ñược nuôi trong tủ CO2

ở 37 ºC trong 7 ngày Vào ngày thứ 3 môi trường nuôi ñược thay mới Tỷ lệ phần trăm sống sót của tế bào ñược hiện thị màu bằng SRB (sulforhodamine B) và ñược ñọc bằng máy ñọc ELISA (ELISA reader) ở bước sóng 495 nm

Hoạt tính gây ñộc tế bào ñược tính bằng phần trăm ức chế khi so sánh mật ñộ quang học của giếng ñược xử lý với mẫu nghiên cứu và chứng âm (DMSO) Nồng ñộ ức chế 50% (IC50) ñược suy ra từ ñường cong phát triển tế bào và nồng ñộ chất thử (phần trăm sống sót so với nồng ñộ chất thử)

2.2.8 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn

a Qua ñặc ñiểm hình thái

Các ñặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn ñược quan sát sau hai tuần nuôi ở các ñiều kiện như ñã mô tả Các ñặc ñiểm hiển vi như hệ sợi cơ chất, hình thái sợi khí sinh, cấu trúc chuỗi bào tử ñược quan sát dưới kính hiển vi phản pha (Carl-Zeiss) có nối máy ảnh

và phần mềm chụp ảnh Atlas hình thái xạ khuẩn (Gernot, 1997) và Sổ tay nhận dạng xạ khuẩn (Identification Manual of Actinomycetes) (Miyadoh et al, 2001) ñược dùng ñể

tham khảo về ñặc ñiểm phân loại

b Bằng sinh học phân tử

Tách chiết DNA

DNA genome của các chủng xạ khuẩn ñược tách chiết theo phương pháp ñã ñược Marmur (1961) và Saito (1963) mô tả với một số cải tiến Cụ thể là, nuôi xạ khuẩn trong môi trường YS lỏng trong 3 ngày ở 30°C và thu tế bào bằng ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút Tế bào sau khi ñã ñồng nhất (bằng que nhựa vô trùng, rửa bằng 2 ml ñệm

1
TE 2 – 3 lần và hòa tan lại trong 0.5 ml EDTA 5 mM, pH 8) bị phá vỡ bằng xử lý với lysozyme (50 µl có nồng ñộ 40 mg.ml−1) ở 37°C qua ñêm, rồi ñược xử lý với SDS (50 µl

có nồng ñộ 20%) và proteinase K (50 µl có nồng ñộ 4 mg.ml−1) ở 55°C trong 1 giờ DNA ñược chiết bằng bổ sung một thể tích tương ñương hỗn hợp phenol:chloroform:isoamine alcohol = 25:24:1 (PCI), trộn và ly tâm ở 15000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C Bước chiết này ñược lặp lại 3 lần DNA nhiễm sắc thể ñược kết tủa bằng 2 thể tích 2-propanol

lạnh, rồi làm khô bằng ethanol 70% ở nhiệt ñộ phòng và hòa tan trong 100 µl nước cất

Phản ứng PCR, giải trình tự và phân tích cây chủng loại phát sinh

Gene rDNA 16S ñược khuếch ñại bằng cặp primer:

27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)

1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)

Hỗn hợp phản ứng (50 µl) gồm 5 µl ñệm (0.2 M Tris-HCl pH 8.3, 0.25 M KCl, 20

mM MgCl2), 20 nM mỗi loại deoxynucleotide, 50 pM mỗi loại primer, 2.5 U Taq DNA

polymerase, và 1 µl DNA khuôn (nồng ñộ khoảng 10-20 ng) Chu trình PCR gồm 5 phút sốc nhiệt ở 95°C, tiếp ñến là 30 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, và 72°C trong 1 phút, cuối cùng là 72°C trong 7 phút Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel agarose, cắt và tinh sạch băng DNA bằng kit QIAquick gel extraction (Qiagen), và ñọc trình tự bằng máy tự ñộng ABI 3110 Avant Appied Biosystems sequencer

Trình tự gen sau ñó ñược phân tích so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện ñã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search So sánh tương ñồng với các trình tự liên quan ñược thực hiện bằng phần

mềm CLUSTAL_X, phiên bản 1.8 (Thompson et al., 1997) Cây phân loại ñược dựng

theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), trong ñó ñịnh dạng cây ñược tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh ña chiều (Felsenstein, 1985)

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở Vườn Quốc gia Cát Bà

Việt Nam với hơn 1.700 km bờ biển trải từ bắc xuống nam với rất nhiều ñảo có mức ña dạng sinh học cao Một số ñảo của Việt Nam ñã ñược công nhận là vườn quốc gia

ñể bảo tồn và phát triển bền vững nguồn gene sinh học Trong khi hệ thực vật và ñộng vật

ở các vườn quốc gia của Việt Nam ñã ñược quan tâm nghiên cứu về mức ñộ ña dạng rất nhiều thì vi sinh vật chưa ñược quan tâm ñúng mức cho dù vi sinh vật ñóng vai trò chủ ñạo trong sự phát triển của công nghệ sinh học Hiện vẫn còn ít các nghiên cứu liên quan ñến sự ña dạng cũng như khả năng ứng dụng của hệ vi sinh vật ở các vườn quốc gia này

Trong số các ñảo của Việt Nam, Cát Bà là ñảo lớn nhất của Vịnh Hạ Long, di sản thiên nhiên thế giới ðảo hiện có 620 loài thực vật bậc cao, 32 loài ñộng vật có vú, 69 loài chim và 20 loài bò sát Cũng tương tự như hầu hết các khu bảo tồn ở Việt Nam, Vườn quốc gia Cát Bà chưa ñược nghiên cứu về mức ñộ ña dạng và tiềm năng sử dụng của vi sinh vật

Nhằm góp phần nghiên cứu về nhóm xạ khuẩn có ở ñảo Cát Bà, ñề tài ñã tiến hành phân lập xạ khuẩn theo hai phương pháp khác nhau như ñã mô ở chương II Qua ñó ñã phân lập ñược 424 chủng xạ khuẩn từ các mẫu ñất và lá cây mục thu tại Cát Bà Trong số

424 chủng ñó, 353 chủng (83.25%) phân lập ñược từ ñất và 71 chủng (16.75%) từ mẫu lá cây mục

Tiếp theo, các chủng xạ khuẩn phân lập ñược ñã ñược phân loại theo hình thái ñể

phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn hiếm) (Bảng 3.1) ðể

ñịnh loại chính xác hơn nhóm xạ khuẩn hiếm phương pháp ñọc trình tự một phần rDNA 16S (khoảng 900 bp) ñã ñược thực hiện và so sánh với các trình tự ñã có trên cơ sở dự liệu bằng công cụ Blast Search

Qua bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy 296 chủng phân lập ñược là Streptomyces (chiếm khoảng 69,81%) và 128 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) (chiếm khoảng 30,19%) Các nghiên cứu trước ñây cho thấy Streptomyces là một trong những

nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong ñất và phân bổ rộng rãi trên thế giới (Hopwood A D.,

2007) Do vậy tỷ lệ cao của Streptomyces trong bộ sưu tập xạ khuẩn ở Cát Bà khẳng ñịnh

kết luận này

Nhìn chung, hầu hết các chủng Streptomyces phân lập ñược mọc nhanh và khỏe,

xuất hiện trước tiên trong các ñĩa phân lập và dễ phân lập Ngược lại, các chủng xạ khuẩn

hiếm (non-Streptomyces) mọc chậm, khuẩn lạc nhỏ, khó phân lập và nuôi cấy Số lượng

xạ khuẩn hiếm thu ñược từ phương pháp ly tâm-hoàn ẩm nhiều hơn bằng phương pháp sấy khô truyền thống

Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ñược

Xét về mức ñộ ña dạng, chúng tôi nhận thấy các chi Micromonospora, Nonomureae

và Nocardia là các chi chiếm ưu thế trong các chi xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) thu

thập tại Cát Bà (Bảng 3.1) Các loài thuộc ba chi này cũng thường ñược phân lập ở các ñịa ñiểm khác ở Việt Nam (Duong V.H., Ando K., 2010)

Các chủng phân lập ñược hiện ñược lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (Vietnam Type Culture Collection, VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học trong glycerol 20% ở −80 °C

3.2 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh

ðể sàng lọc các chủng sinh kháng sinh, 4 chủng vi sinh vật ñại diện cho vi khuẩn Gram âm và dương; nấm và nấm men ñã ñược lựa chọn làm vi sinh vật kiểm ñịnh

Bước sàng lọc ñầu tiên ñược thực hiện bằng phương pháp mảnh thạch như ñã mô tả

ở chương II Qua ñó cho thấy trong 424 chủng xạ khuẩn nghiên cứu chỉ có 115 chủng

(chiếm khoảng 27,12%) cho hoạt tắnh ựáng kể kháng ắt nhất một trong bốn vi sinh vật kiểm ựịnh

Tiếp theo 115 chủng này ựược dùng làm ựắch cho bước sàng lọc thứ hai sử dụng phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy Một số hình ảnh ựại diện cho bước phân tắch này ựược trình bày ở hình 3.1 Từ bước sàng lọc này 17 chủng thể hiện hoạt tắnh tương ựối cao với ắt nhất hai trong bốn vi sinh vật kiểm ựịnh ựã ựược lựa chọn Hoạt tắnh tương ựối của các chủng này ựược trình bày ở bảng 3.2

Hình 3.1 đánh giá hoạt tắnh kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn

Một số hình ảnh tiêu biểu minh họa cho phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy Trong số 17 chủng chọn lọc ựược, 14 chủng có hoạt tắnh kìm hãm vi khuẩn Gram

âm (E coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn Gram dương (M luteus) và 11 chủng có hoạt tắnh kháng cả hai nhóm vi khuẩn Với các tế bào nhân thật, gồm nấm (F oxysporium) và nấm men (C albicans), 12 chủng có hoạt tắnh kháng nấm và chỉ 6 chủng có hoạt tắnh

kháng nấm men (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Hoạt tắnh kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ựược

Hiệu quả ức chế vi sinh vật kiểm ựịnh

3.3 Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

17 chủng chọn lọc ñược ñã ñược tiến hành nuôi cấy lỏng và sơ bộ tách chiết dịch ngoại bào ñể tiến hành các phân tích tiếp theo Hiện nay có nhiều công bố liên quan ñến việc tách chiết các chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ vi sinh vật Qua tham khảo tài liệu chúng tôi nhận thấy ethyl acetate thường ñược sử dụng trong bước ñầu tiên khi tách chiết hợp chất có hoạt tính kháng sinh từ vi sinh vật Ethyl acetate ñược coi là một trong những dung môi hữu cơ tương ñối ít ñộc hại, dễ loại bỏ do có ñộ bay hơi cao và là dung môi ñược dùng phổ biến trong tách chiết nhiều chất hóa học Ethyl acetate hiện ñược sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp trong ñó có cả công nghiệp thực phẩm (làm bánh kẹo) Vì vậy sử dụng dung môi này sẽ an toàn cho người thực hiện (Dutia, Pankaj, 2004)

Do ñó chúng tôi ñã lựa chọn ethyl acetate làm dung môi ñể chiết các chất tan trong dịch nuôi thu ñược từ các chủng chọn lọc ñược Quy trình tách chiết ñã ñược mô tả chi tiết ở chương II Hiệu quả tách chiết các chất tan trong ethyl acetate ñược trình bày ở bảng 3.3 Qua ñó cho thấy từ 01 lít dịch nuôi cấy (sau khi ñã loại bỏ tế bào) thu ñược từ vài chục miligram ñến vài gram chất tan trong ethyl acetate So với chất khô thì lượng chất tan này chiếm từ 0,5% ñến gần 15% tùy theo từng chủng xạ khuẩn Trong ñó dịch nuôi của chủng A396 có tỷ lệ chất tan này cao nhất (14,89%), còn thấp nhất là chủng A154 (chỉ chiếm 0,51%)

Bảng 3.3 Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

(từ 1 lít dịch nuôi ñã loại tế bào)

TT Chủng Chất khô (gam) Chất tan trong

ethyl acetate (mg)

Phần trăm so với chất khô (%)

Kết quả thu ñược cho thấy phổ các băng TLC của 17 chủng rất khác nhau Số băng thu ñược dao ñộng từ 1 ñến 4 băng Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ có 2 băng, 4 chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390, A1022) cho phổ

4 băng