Tài liệu Tiểu luận:Chuẩn đoán virus PMWS bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào docx

Việc phát hiện PCV2 do đó không đủ thuyết phục để thiết lập cách chẩn đoán PMWS và việc xác định những trường hợp bị PMWS vẫn còn là tranh cãi.. Do sự chết ở heo tăng cao quá mức so với

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MỞ ĐẦU

Hội chứng còi cọc sau cai sữa là 1 bệnh đang phổ biến trên heo Những triệu chứng được quan sát lần đầu ở Canada vào năm 1991, từ đó nhiều nghiên cứu đã được ghi nhận heo nhiễm PMWS trở nên còi cọc sau cai sữa có thể có hoặc không

có biểu hiện khó thở,tiêu chảy, xanh xao, vàng da và có nhiều thay đổi đặc tính mô

bệnh học Dòng circovirus heo dạng 2 , khác với dạng 1 về mặt kháng nguyên và

di truyền, gây ra sự nhiễm bệnh liên tục cho nhiều dòng tế bào heo, lúc đầu được cho là do PMWS Tuy nhiên những nghiên cứu về sau cho thấy sự nhiễm trùng chỉ PCV2 thường không gây ra PMWS vì hầu hết heo thí nghiệm được tiêm dòng PCV2 chỉ bị lây nhiễm cận lâm sàng Hơn nữa, 1 cuộc khảo sát đã cho thấy tỷ lệ cao heo với kháng thể PCV2 ở những nông trại mà PMWS không được ghi nhận Việc phát hiện PCV2 do đó không đủ thuyết phục để thiết lập cách chẩn đoán PMWS và việc xác định những trường hợp bị PMWS vẫn còn là tranh cãi Sự chẩn bệnh chính xác cho từng heo hiện nay đang dựa trên tất cả 3 điều kiện sau: những dấu hiệu lâm sàng điển hình gồm còi cọc sau cai sữa; những bệnh tích vi thể; phát hiện PCV2 trong những bệnh tích tương ứng Ở những nông trại kinh doanh,

PMWS cho thấy sự gia tăng liên tục số lượng những heo tăng trưởng chậm và không có hiệu quả kinh tế Do sự chết ở heo tăng cao quá mức so với quá khứ nên trong những trường hợp xác định bệnh hiện nay ở mức độ đàn gia súc cũng xem sự chết đó như là 1 tiêu chuẩn quan trọng Sự phát sinh bệnh của PMWS cũng còn khó hiểu Những đồng tác nhân gây nhiễm, có thể 1 mình hoặc kết hợp, được cho

là nhân tố nguy hiểm cho sự phát triển hoặc sự kịch phát của PMWS Những thí nghiệm với sự lây nhiễm kép đã xác định porcine parvovirus (PPV), virus gây hội

chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo ( PRRS), mycoplasma hyopnemoniae

như là những đồng tác nhân Cũng có những bằng chứng cho thấy việc sử dụng

những vaccin hay kích thích miễn dịch nhất định có thể ảnh hưởng đến sự phát triển PMWS

Những khác biệt trong sự phổ biến của PMWS ở các nước có thể góp phần vào

sự hiểu biết về sự phát sinh bệnh của tình trạng này Đến nay, nhiều nghiên cứu về bệnh này đã được báo cáo Có nhiều phương pháp để xác định sự có mặt của

PCV2, bài này chỉ đề cập đến việc phát hiện PCV2 trên môi trường nuôi cấy tế bào.Việc phát hiện PCV2 chỉ cho phép kết luận thú bị nhiễm PCV2 nhưng không thể kết luận thú bị PMWS

TỔNG QUAN

GIỚI THIỆU

PMWS ( Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa) là 1 căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và phổ biến, ảnh hưởng đến nền công nghiệp nuôi heo trên toàn cầu Bệnh được phát hiện đầu tiên ở tây Canada 1991, với những triệu chứng như mất trọng lượng liên tục, bệnh hô hấp và vàng da Những triệu chứng tương tự cũng xuất hiện trên heo ở Mỹ, Pháp, bắc Ireland, Tây Ban Nha, Đan Mạch và Đức Việc xác định kháng nguyên PCV và nucleic acid trong những bệnh tích đưa đến khả năng là virus PCV mới và độc hại hơn đã xuất hiện trong những đàn heo ở những nước này Tất cả PCV phân lập từ PMWS đều có những nhóm có liên hệ về trình

tự nucleotide, 96% trình tự nucleotide intragroup được xác định nhưng có vài sự khác biệt với PCV phân lập từ dòng tế bào PK15, ít hơn 80% trình tự nucleotide được xác định Người ta cho rằng PCV gây ra PMWS nên được xem như là PCV loại 2 và PCV gây bệnh trong môi trường tế bào PK15 là PCV loại 1

Khi chưa có những nghiên cứu về dịch tễ phân tử, có 2 giả thiết liên quan đến PCV2: một, PCV2 chính là PCV1 nhưng do sự thay đổi về kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng heo cũng như những yếu tố môi trường khác đã tạo điều kiện cho PCV1 trở

nên có độc lực và gây bệnh tương tự như 1 số loài vi sinh vật khác sống cộng sinh trên cơ thể vật chủ; hai, PCV1 dưới tác động của những thay đổi điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng và môi trường đã biến đổi trở thành loài virus gây bệnh mới Do PCV1 và PCV2 cùng có thể hiện diện trên cùng 1 heo và giữa chúng có sự tương đồng nhất định về gen nên dịch tễ học phân tử cần phân biệt chúng với nhau để có những đánh giá chính xác về tình hình dịch tễ PMWS

Porcine circovirus dạng 2 ( PCV 2) thuộc họ Circoviridae, giống Circovirus,

là 1 DNA virus chuỗi đơn vòng PCV 2 lan tràn trên khắp thế giới ở những đàn heo nuôi thuần hóa, với nhiều triệu chứng như bệnh Porcine circovirus (PCVD), hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa ( PMWS), hội chứng viêm da va viêm thận ở heo (PDNS) và rối loạn khả năng sinh sản PCV được phát hiện đầu tiên năm 1974 như là 1 chất gây nhiễm không gây bệnh tế bào ở liên tiếp dòng tế bào thận heo ( PK15) Kháng thể huyết thanh đối với PCV gây bệnh trong môi trường tế bào PK15 được chứng minh ở nhiều đàn heo trên thế giới Tuy nhiên, sự xâm nhiễm cho heo trong phòng thí nghiệm với virus này thất bại trong việc tạo ra những bệnh lâm sàng Theo phòng thí nghiệm chẩn đoán thú y trường đại học bang Iowa, các trường hợp PCV2 gây bệnh trên heo đã tăng nhanh chóng ở Mỹ trong giai đoạn những năm 1998-2000

PCV2 kết hợp với bệnh viêm phổi là 1 trong những biểu hiện phổ biến nhất của

sự nhiễm PCV2 PMWS là biểu hiện phổ biến thứ 2 do nhiễm PCV2 Chẩn đoán PMWS dựa vào tiền sử còi cọc, sự mất lympho và viêm u hạt trong hạch lympho nhờ kiểm tra mô bệnh học và chứng minh kháng nguyên PCV2 kết hợp với bệnh tích lympho Dạng phổ biến thứ 3 là PCV2 kết hợp với nhiễm hệ thống, sự chẩn đoán này dựa trên những trường hợp có tiền sử còi cọc và sự vỡ tế bào bạch cầu hoặc viêm u hạt được quan sát trong nhiều cơ quan có liên quan với kháng nguyên

PCV2 Sự thiếu hụt tế bào bạch cầu không được quan sát hoặc mô lympho không được chấp nhận trong những trường hợp này

Có vài dấu hiệu bệnh lâm sàng cơ bản của PMWS làm tiền đề cho những chẩn đoán lâm sàng bệnh bao gồm sưng hạch lympho, còi cọc, khó thở, tiêu chảy, vàng vọt, vàng da Những dấu hiệu này không xuất hiện riêng lẻ ở từng con heo, đa số heo trong trang trại bị nhiễm bệnh sẽ có biểu hiện lâm sàng bệnh Để xác định bệnh cần: sự hiện diện của những dấu hiệu lâm sàng bệnh, những bệnh tích mô học

và sự hiện diện của PCV 2 trong những bệnh tích đó

Dấu hiệu lâm sàng của PMWS bị giới hạn bởi tuổi cai sữa của heo PMWS xuất hiện trên heo tuổi từ 25 đến 120 ngày, tập trung cao nhất trong khoảng tuổi từ 60 đến 80 ngày tuổi

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁNVIRUS GÂY PMWS (

POSTWEANING MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROME)

II.1 Phát hiện DNA PCV2 trong nuôi cấy tế bào

Để phát hiện DNA PCV2 bằng nuôi cấy tế bào, 5g mỗi bộ phận (phổi, hạch lympho, hạch amidan) được thu thập, hòa lẫn trong 10 ml PBS (phosphate –

Sau 2h ủ ở 22°C , mỗi giếng được thêm vào 1 ml EMEM được làm giàu với 5% huyết thanh thai bò (BioWhittaker Inc., MD, USA)

Môi trường nuôi cấy NSK được kiểm tra âm tính thường xuyên với PCV1,

PCV2, virus pseudorabies, và virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp Đối

chứng dương được chuẩn bị từ môi trường tế bào NSK bị nhiễm virus dòng PCV2, phân lập từ đàn heo Italy

Môi trường tế bào NSK không có PCV1 và PCV2 được sử dụng làm đối chứng

âm Tất cả các đĩa nuôi cấy được ủ trong 10 ngày ở 37°C trong 10% CO2

Thực hiện 3 lần cấy chuyển, sau khi ủ, dịch nổi được dùng để xác định sự có mặt của DNA PCV2 bằng real- time PCR, theo protocol của Olvera et al (2004)

II.2 Hóa mô miễn dịch ( Immunohistochemistry )

Nguyên tắc:

Hóa mô miễn dịch là kết hợp phản ứng miễn dịch và hoá chất để làm hiện rõ các kháng nguyên (KN) hiện diện trong mô (bào tương, màng tế bào, nhân) Vì kháng nguyên không thể quan sát hình thái được nên người ta phải xác định vị trí của nó trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học Có hai kỹ thuật: miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch men

Nguyên tắc: Cho kháng thể (KT) đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có kháng

nguyên sẽ có phản ứng kết hợp KN - KT Có 2 cách để quan sát được phức hợp này:

Miễn dịch huỳnh quang: cho gắn với một chất phát huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

Miễn dịch men: Cho gắn với một loại men (peroxidase hoặc alkaline

phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học

2.2 Cách thực hiện

- Hóa mô miễn dịch được tiến hành trên mô, ngay cả khi mẫu bị đông lạnh

ở −20°C Mẫu mô được thu nhận từ những con heo có những dấu hiệu lâm sàng của pmws như giảm cân liên tục, bệnh đường hô hấp, vàng da, sưng hạch lympho

- Mẫu mô dày khoảng 4-μm được nhuộm hematoxylin và eosin (HE) và với thuốc nhuộm hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng chống PVC2

- Sau khi làm khô và loại bỏ chất nhờn ở mẫu, peroxidase nội sinh sẽ ức chế với peroxide hydrogen 0.3% trong methanol 30 phút, sự phục hồi kháng thể nhờ

- Sau 5 phút rửa trong PBS, mẫu được ủ trong enzyme diaminobenzidine

tetrahydrochloride (DAB) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng ( DAB được sử dụng như chất tạo màu), rửa và nhuộm với haematoxylin 1 phút ở nhiệt độ phòng

- Mẫu được làm sạch nhờ cồn và xylene, đặt dưới lamen làm tiêu bản

- Mẫu mô được nhuộm tương phản papanicoleu hematoxyline, làm khô nước và

cố định với dibutyl phthalate xylene Mô lympho của heo con nhiễm PMWS ngẫu nhiên , sự hiện diện của PCV2 được xác định nhờ PCR và lai in situ, được sử dụng như là đối chứng dương Đối chứng âm là kháng thể có cùng isotype (IgG1) với kháng thể sơ cấp nhưng có đặc hiệu không phù hợp

Kết quả

Hầu hết động vật được kiểm tra cho thấy điều kiện cơ thể kém, với mức độ teo

cơ bên ngoài biến đổi Những bệnh tích ở mức độ lớn được quan sát chủ yếu ở

thùy đỉnh của phổi, viêm phổi, với đốm xuất huyết và ở hạch lympho của phế quản, bị sưng và tái (bảng 1)

Mô học cho thấy sự hiện diện của những tổn thương trong phổi, hạch, và mô lympho ( những tế bào đa nhân lớn, sợi phế quản, viêm u hạt , hoại tử đông tụ, và xuất huyết ) Không có bằng chứng mô học nào về sự nhiễm vi khuẩn, PCR từ những cơ quan bệnh đồng nhất cho thấy có DNA PCV2 ở 7 trong số 16 con heo đực Về phân lập virus, không có tác động gây bệnh tế bào nào được quan sát trong môi trường nuôi cấy NSK

Tuy nhiên, sự có mặt của DNA PCV2 được chứng minh từ tất cả 16 con heo hoang dã bằng Real Time PCR của gen Cap (Capsip protein gene) được thực hiện trên dịch nổi của môi trường nuôi cấy NSK Kết quả này được xác nhận bằng kính hiển vi điện tử cho thấy sự có mặt của những tụ porcine circovirus như những phân

tử, với hình tròn và đường kính khoảng 17 nm trong bất cứ môi trường tế bào nào ( hình 1)

Fig 1 Electron microphotograph of small circovirus particles from supernatant of newborn swine kidney cell culture on pooled organs (bronchial lymph nodes, lungs, tonsils) from wild boars with PCV2 infection Negative staining Bar 50 nm

Không có virus khác giống những phân tử được quan sát trong môi trường

không nhiễm và đối chứng Chỉ có 1 mẫu cho kết quả dương tính với nhuộm kháng nguyên IHC trong tế bào chất và nhân tế bào của những nang trong hạch lympho phổi (hình 2)

II.3 Lai tại chỗ (In situ hybridization)

3.1 Nguyên tắc:

Lai tại chỗ là kiểu lai phân tử trong đó trình tự đích cần tìm nằm ngay trong tế bào, trong mô Quá trình lai với mẫu dò đánh dấu và phát hiện phân tử lai được thực hiện ngay trên lát cắt mô

Mẫu mô lặp lại được loại bỏ paraffin nhờ 3 thay đổi xylene và 2 thay đổi cồn tuyệt đối, làm khô trong PBS có 70-95% ethanol Giữa mỗi bước, mô được rửa 2 lần trong 5 mM PBS mỗi 10 phút Hoạt động của enzyme nội sinh peroxidase bị ức chế khi ủ 20 phút trong 0.5% H2O2 methanol

Những mẫu cắt và môi trường tế bào cố định formalin được ủ ở 0.5% protease XIV trong 0.05 M tris- HCL trong 15 phút, 37°C, rửa qua với nước cất và rửa lại 2 lần trong 5 mM PBS (để tối ưu cho thí nghiệm ISH và IHC, mẫu này được đưa vào

enzyme tiêu hóa protein sử dụng protease XIV hoặc proteinase K ở nồng độ là 0.5 mg/ml cho 10, 20, 30 hoặc 40 phút ở 37°C.)

50 µl hỗn hợp lai được đưa vào và đặt dưới lamen

DNA mục tiêu trong mô và mẫu dò PCV2 trong hỗn hợp lai sẽ bị biến tính khi ủ ở 90°C, 10 phút ngay sau khi làm lạnh ở túi đá Sự lai được thể hiện trong khoảng 18-22h, ở 37°C trong môi trường ẩm

Sau khi lai, slide kính được rửa 2 lần trong muối natri citrate Slide được rửa lại lần nữa trong PBS sau khi ủ trong buffer maleic acid 20 phút, 37°C

Những mẫu cắt sau đó được chuyển vào buffer maleic acid, chứa 1% tác nhân ức chế, sau khi ủ trong kháng thể anti-digoxygenin POD, pha loãng 1:200 trong 1% chất ức chế/ buffer maleic acid

Mẫu được rửa đầu tiên trong buffer maleic acid rồi đến 5mM PBS Cuối cùng, đưa DAB vào ( 3,3 diaminobenzidine)

Slide sẽ được nhuộm tương phản nhẹ với Harris hematoxylin, làm khô bằng cồn và

cố định làm tiêu bản để quan sát bằng kính hiển vi quang học

3.3 Kết quả:

Hình thái học tế bào bị khử ở cả những mô cố định formalin và ethanol khi so sánh với những mẫu cắt nhuộm hematoxylin và eosin (HE) của cùng mẫu mô và phương pháp cố định formalin

Mô cố định ethanol có sự giảm rõ ràng về hình thái học khi ISH được so sánh với

HE hoặc ISH trên những mô cố định formalin

Cả hai phương pháp cố định ethanol và formalin đều tạo ra cùng dạng nhuộm trên

mô dương tính PCV2 Khi cố định ethanol, mẫu tuyến ức và hạch lympho âm tính PCV2 không chứa tế bào dương tính ISH Mẫu nhiễm PCV2 chứa mô heo bị

PMWS được bảo quản formalin và ethanol Mẫu cắt tuyến ức bị PMWS được cố định ethanol cho thấy có sự phân hủy sản phẩm phản ứng DAB tạo thành những

thể vùi riêng biệt hoặc sự tích đọng tế bào chất đến sự hòa nhập chất nhuộm ở tế bào chất cho thấy sự có mặt của DNA virus trong tế bào chất của đại thực bào Thỉnh thoảng nhân mô bào là dương tính trong khi hiếm khi tế bào có nhân thoái hóa cho thấy nhân nhuộm ISH

Hạch lympho bị PMWS cố định ethanol cho thấy sự nhuộm tế bào chất của DNA virus trong đại thực bào như những thể vùi riêng biệt hoặc sự kết tụ tế bào chất của virus

Tế bào dương tính thỉnh thoảng phân bố trong tủy ức, mô vỏ Hạch lympho bị PMWS cố định formalin cho thấy vật chất trong tế bào chất dương tính mạnh trong

tế bào chất của mô bào và những tế bào thực bào hoạt hóa

Không có sự khác biệt nào về dạng tế bào nhuộm hoặc sự nhuộm nội bào giữa hai phương pháp cố định trên Ở hạch lympho, nhiều đại thực bào là dương tính ISH,

so sánh với vài tế bào rải rác ở mô vỏ

Hạn chế và ưu điểm của phương pháp IHC

Chậm

Đặc hiệu, nhạy

Đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp

Thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm

Hạn chế và ưu điểm của phương pháp lai tại chỗ

Đặc hiệu cao

Độ nhạy cao, không ổn định

Phức tạp, giá thành cao

Phân lập virus

Để phân lập virus, khoảng 15% dịch nổi của mẫu mô được thu nhận từ

MEM-SA (Môi trường thiết yếu tối thiểu chứa muối earle và peniciline và streptomycin)

bằng cách nghiền mẫu với cối, chày vô trùng và thêm vào ít cát vô trùng Sau đó

hòa tan với MEM-SA rồi ly tâm ở 3,000 x g trong 30 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi trước khi ủ với môi trường tế bào, 100 µl chloroform được thêm vào đến 2ml dịch nổi và trộn lẫn liên tục khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp được chuyển vào ống ly tâm và ly tâm ở 3000 x g trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi Dịch nổi này được sử dụng như nguyên liệu cấy cho nghiên cứu phân lập virus

Tất cả nghiên cứu phân lập virus được thực hiện trên môi trường tế bào PK15, không nhiễm PCV, pestivirus, adenovirus heo, parvovirus heo

Tế bào PK15 được lấy ra khỏi môi trường sử dụng trypsin versene và hòa tan lại trong MEM-SA chứa 15% huyết thanh bò không có pestivirus ( MEM-G) ở nồng

độ 4 x 105 tế bào/ml 10ml mẫu đại diện của dịch tế bào này được trộn lẫn với 2ml mẫu đại diện của nguyên liệu cấy ở trên, hỗn hợp thu được sẽ phân chia vào 2 bình nuôi cấy mô khoảng 25ml Những môi trường này được ủ ở 370C trong 18h ở 10% CO2 Sau đó, lớp tế bào 1 lớp sẽ được xử lý với 300 mM D-glucosamine và ủ ở

370C trong 48-72h Sau đó, 1 bình nuôi cấy của mỗi nguyên liệu cấy được được đông lạnh và rã đông 3 lần Bình còn lại của mỗi nguyên liệu cấy được cấy chuyển bằng cách tách tế bào PK15 sử dụng trypsin versene, tái hòa tan những tế bào tách này trong 20 ml MEM-G, đưa chúng vào bình nuôi cấy 75 ml sạch ở nồng độ 4 x

105 tế bào/ ml Bình nuôi cấy này sau đó được “siêu gây nhiễm” bằng cách thêm 5

ml tế bào ly giải thích hợp sau khi đông lạnh/rã đông 3 lần 5 ml dịch siêu gây nhiễm được lấy ra và đưa vào đĩa petri ( đường kính 55mm) có lamen khử mỡ vô trùng Bình nuôi cấy và lamen được ủ ở 370C và xử lý với glucosamine như trên Sau khi xử lý glucosamine 24-48h, Lamen được lấy ra và cố định acetone trong 10 phút ở nhiệt độ phòng hoặc trong 10% buffer formalin trung tính trong 4h Sau khi

cố định, tất cả lamen được dự trữ ở -700C trên gel silica trước khi sử dụng cho hóa miễn dịch và ISH