(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea làm tăng số hàng hạt vào các dòng bố, mẹ giống ngô lai LVN 10 phục vụ công tác tạo giống ngô lai năng suất cao

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Họ và tên: Phạm Thùy Chi NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Họ và tên: Phạm Thùy Chi

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA

GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ

GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO

GIỐNG NGÔ LAI NĂNG SUẤT CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Họ và tên: Phạm Thùy Chi

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA

GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ

GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO

GIỐNG NGÔ LAI NĂNG SUẤT CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi

dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Khuất Hữu Trung và TS Đỗ Tiến Phát Các

số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021

Tác giả

Phạm Thùy Chi

hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung – Phó

viện trưởng – Viện Di truyền Nông nghiệp đã hướng dẫn, tạo động lực và đưa ra những lời khuyên quý báu cho tôi trong quá trình làm thí nghiệm và thực hiện đề tài

Tôi xin được cảm ơn TS Đỗ Tiến Phát – Phụ trách Phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin được cảm ơn các giảng viên của Viện Khoa học và Công nghệ nơi tôi theo học và tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất - trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn này

Đồng thời, tôi xin cảm ơn tập thể nhóm nghiên cứu Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp đã đồng ý cho tôi được tham gia vào đề

tài: “ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea* làm tăng số hàng hạt vào các dòng bố mẹ của Việt Nam phục vụ tạo giống ngô lai năng suất cao”

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021

Tác giả

Phạm Thùy Chi

BC 1,2,3 Backcross, lai trở lại lần thứ 1,2,3

BC5F1 Đời con lai F1 của dòng lai trở lại lần thứ 5

BC5F2 Đời con lai F2 của dòng lai trở lại lần thứ 5

BC6F1 Đời con lai F1 của dòng lai trở lại lần thứ 6

BL10 Dòng đƣợc chọn làm bố trong phép lai tạo LVN10

dCAP Derived Cleavage Amplified Polymorphism

dNTPs Deoxynucleoside triphosphates

DMSO Dimethyl sulfoxide (CH3)2SO

fea* Allele đột biến lặn của gen FASCITED EAR2 có tác

dụng tăng hàng hạt ở ngô

MABC Marker assisted backcross (lai trở lại có hỗ trợ của chỉ thị

phân tử) MAS Marker-assisted selection (chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử) ML10 Dòng đƣợc chọn làm mẹ trong phép lai tạo LVN10

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng nhân theo chuỗi

Hình 1.1: Bắp giống ngô LVN10 ở công ty giống cây trồng Thái Bình 9

Hình 1.2: So sánh ảnh hưởng của đột biến fea* lên bắp ngô 11

Hình 1.3: Quá trình backcross qua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trong các đời backcross 16 Hình 2.1 Sơ đồ và kế hoạch lai tạo backcross 21 Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt PCR với cặp mồi OSV1 và OSV2 25 Hình 3.1 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST1 giữa các dòng ML10, BL10, và W223 34 Hình 3.2 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST2 giữa các dòng ML10, BL10, và W22 .34 Hình 3.3 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST3 giữa các dòng ML10, BL10, và W22 35 Hình 3.4 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST4 giữa các dòng ML10, BL10, và W22 35 Hình 3.5 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST5 giữa các dòng ML10, BL10, và W22 36 Hình 3.6 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST6 giữa các dòng ML10, BL10, và W22 36 Hình 3.7 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST7 giữa các dòng ML10, BL10, và W22 37 Hình 3.8 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST8 giữa các dòng ML10, BL10, và W22 37

Hình 3.10 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST9 giữa các dòng ML10, BL10, và W22 38 Hình 3.11: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F1 của tổ hợp lai ML10/W22 sử dụng cặp mồi OVS1-OVS2 39 Hình 3.12: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F1 của tổ hợp lai BL10/W22 sử dụng cặp mồi OVS1-OVS2 40 Hình 3.13 Kết quả kiểm tra nền di truyền nhóm cá thể BC5F1 của 31 chỉ thị trên 10 nhiễm sắc thể 44 Hình 3.14 Kết quả kiểm tra nền di truyền của các cá thể BC5F1 thuộc nhóm

3 với các chỉ thị umc1160 và umc1166 45 Hình 3.15 Kết quả kiểm tra nền di truyền nhóm các cá thể BC5F1 của 26 chỉ thị trên 10 nhiễm sắc thể 48 Hình 3.16 Kết quả kiểm tra nền di truyền của các cá thể BC5F1 thuộc nhóm

1 và nhóm 3 với các chỉ thị umc1160 và phi070 48 Hình 3.17: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F2 của tổ hợp lai ML10/W22 sử dụng cặp mồi OVS1-OVS2 50 Hình 3.18: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F2 của tổ hợp lai BL10/W22 sử dụng cặp mồi OVS1-OVS2 51

Hình 3.19: Hình thái các dòng ngô trên đồng ruộng Thái Bình vụ Xuân 2020

ở giai đoạn tung phấn 54 Hình 3.20: Hình thái các dòng ngô trên đồng ruộng Thái Bình vụ Xuân 2020

ở giai đoạn tung phấn 55

Hình 3.22: Ảnh bắp sau thu hoạch của các dòng ngô thu tại Thái Bình vụ Xuân 2020 59 Hình 3.23: Ảnh bắp sau thu hoạch của các dòng ngô thu tại Thái Bình vụ Xuân 2020 60

Bảng 3.1 Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc thể giữa dòng ML10 và W22… …31 Bảng 3.2 Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc thể giữa dòng BL10 và W22… 33 Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra kiểu gen của các dòng BC5F1 vụ Xuân 2019 40 Bảng 3.4: Tỉ lệ nền di truyền của các cá thể BC5F1 so với dòng nhận gen ML10 43 Bảng 3.5 Tỉ lệ nền di truyền của các cá thể BC5F1 so với dòng nhận gen

BL10 47 Bảng 3.6: Một số đặc điểm hình thái nông học của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng bố mẹ gốc 53 Bảng 3.7: Năng suất cá thể của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng gốc 57

MỞ ĐẦU 1

1.Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ TRÊN THẾ GIỚIVÀTẠIVIỆTNAM 5

1.1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 5

1.1.1.1 Sản xuất ngô trên thế giới 5

1.1.1.2 Sản xuất ngô tại Việt Nam 6

1.1.2 Phương pháp chọn tạo giống ngô 7

1.1.2.1 Phương pháp chọn tạo giống ngô trên thế giới 7

1.1.2.2 Nghiên cứu chọn tạo giống trong nước 7

1.2.GIỚITHIỆUVỀGIỐNGNGÔLVN10 8

1.3.KHÁIQUÁTVỀGENFEA* 9

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới về QTLs quy định tính trạng năng suất ngô và gen liên quan đến số hàng hạt trên bắp ngô 9

1.3.2 Gen FEA2 và allele fea* 10

1.4.SỬDỤNGCHỈTHỊPHÂNTỬTRONGPHÉPLAITRỞLẠI 11

1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng 11

1.4.2 Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai hồi giao (Marker Assited Backcrossing - MABC) 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1.VẬTLIỆU 19

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Các loại hóa chất 19

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 20

2.2.1 Bố trí thí nghiệm lai trở lại (BC) 21

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 22

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA- CTAB 22

2.2.2.2.Phương pháp PCR bằng mồi dCAPs 23

2.2.2.3 Phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn PstI 24

2.2.2.4.Phương pháp PCR với mồi SSR 25

2.2.2.5 Phương pháp điện di trên gel poly-acrylamide 26

2.2.2.6 Phương pháp điện di trên gel Agarose 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1.KẾTQUẢ 28

3.1.1 Kết quả xác định chỉ thị đa hình giữa các dòng ML10, BL10 và dòng W22 trên 10 NST 28

3.1.1.1 Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen fea* giữa dòng ML10 và dòng W22 28

3.1.1.2 Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen fea* giữa dòng BL10 và dòng W22 30

3.1.2 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 mang gen fea* bằng phương pháp chỉ thị phân tử 38

3.1.2.1 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 ở dòng ML10 38

3.1.2.2 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 ở dòng BL10 38

3.1.3 Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 40

3.1.3.1 Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 ở dòng lai ML10 40

3.1.3.2 Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 ở dòng lai BL10 43

gen fea* bằng chỉ thị phân tử 46

3.1.4.1 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 ở dòng ML10 47

3.1.4.2 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 ở dòng BL10 48

3.1.5 Đặc điểm hình thái nông sinh học của các dòng BC5F3 mang gen fea* trong vụ Thu Đông năm 2019 49

3.1.5.1 Đặc điểm hình thái nông học của các dòng BC3F3 49

3.1.5.2 Đánh giá sơ bộ về năng suất của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng bố mẹ gốc 53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1.KẾTLUẬN 59

4.2.KIẾNNGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngô (Zea mays L.) thuộc chi Zea, tông Androppogoneae, họ Poaceae,

bộ Poales Ngô là cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu vì nó nuôi sống ít nhất 30% dân số thế giới và là cây lương thực đứng thứ 3 sau lúa

mì và lúa Ngô là nguồn cung cấp lương thực và an ninh dinh dưỡng chủ yếu cho hàng triệu người ở các nước đang phát triển, đặc biệt là ở Châu Phi và Châu Mỹ Latinh Ngô có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như được dùng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và sản xuất công nghiệp (nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học)

Theo số liệu thống kê của USDA (United States Department of Agriculture) (tháng 1 năm 2017), Mỹ và Trung Quốc vẫn là hai cường quốc sản xuất ngô lớn nhất thế giới với sản lượng lần lượt là 384 triệu tấn và 219 triệu tấn (http://worldofcorn.com) Năng suất trung bình ngô của Mỹ là 11.7 tấn/ ha (2016) Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ 2 sau cây lúa và là cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác Cây ngô không những cung cấp lương thực cho người, làm thức ăn cho vật nuôi mà còn giúp xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn Tuy nhiên, ngô lại chỉ được trồng ở những khu vực không có lợi cho việc trồng cây công nghiệp Do ngô chủ yếu được gieo trồng trong điều kiện không thuận lợi nên sản lượng mặt hàng này của Việt Nam đang rất thấp.Theo số liệu thống kê của tổng cục thống kê (http://www.gso.gov.vn/) năm 2016, năng suất ngô trung bình cả nước vào khoảng 45,3 tạ/ha, sản lượng đạt khoảng 5,23 triệu tấn trên diện tích gieo trồng khoảng 1,15 triệu ha

Theo thống kê của FAO, Hoa Kỳ và Trung Quốc là hai nước sản xuất ngô hàng đầu thế giới với lần lượt là 377,5 triệu tấn và 224,9 triệu tấn

Sản xuất ngô cả nước qua các năm không ngừng tăng về diện tích,năng suất, sản lượng: năm 2001 tổng diện tích ngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đã tăng lên 1 triệu ha, năm 2010 diện tích ngô cả nước là 1126,9 nghìn ha, năng suất đạt 40,9 tạ/ha, sản lượng trên 4,6 triệu tấn Tính đến thời điểm năm 2016, diện tích cả nước gieo trồng giảm chủ yếu do hạn hán không gieo trồng được, năng suất ngô năm 2016 đạt 46 tạ/ha (tăng 1,2 tạ/ha so với 2015) Sản lượng ước đạt 5,1 triệu tấn Năm 2020 , sản lượng chỉ còn 4,5 triệu tấn do giảm mạnh diện tích gieo trồng cả nước ảnh hưởng của mưa, bão, lũ lụt tại các địa phương phía Bắc [1]

Giống ngô LVN10 của Viện nghiên cứu Ngô, là giống ngô cho năng suất cao nhất hiện nay ở nước ta, màu sắc và dạng hạt đẹp, độ đồng đều cao, chịu hạn, chịu chua phèn, chống đổ tốt, ít nhiễm sâu bệnh Đây là giống thích ứng với mọi vùng sinh thái trong cả nước Giống LVN10 có trung bình 10-12 hàng hạt/bắp, bắp dài 18-22cm, năng suất trung bình 55-65 tạ/ha, thâm canh tốt có thể đạt 80-90 tạ/ha.[2]

Do có nhiểu đặc tính tốt và năng suất cao mà LVN10 được trồng khá phổ biến ở nước ta Nhận thấy tiềm năng phát triển của chúng, chúng tôi chọn cách tiếp cận tăng năng suất ngô hơn nữa bằng cách làm tăng số hàng hạt trên

một bắp ngô nhờ sử dụng đột biến fea* có khả năng làm giảm họat tính của gen kiểm soát sự phân chia của đỉnh sinh trưởng ở bắp ngô.[3]

FEA2 (FASCIATED EAR2) là gene điều khiển kích thước mô phân

sinh, do đó có ảnh hưởng đến số hàng hạt trên bắp ngô Bommert và cộng sự

đã phát hiện ra 4 đột biến điểm ở gene FEA2, trong đó có một đột biến lặn

fea* làm giảm hoạt tính của gene FEA2 và tăng số hàng hạt trên bắp nhưng

không gây ảnh hưởng đến các tính trạng khác trên bắp ngô

Cho đến nay, ở Việt Nam chưa tìm thấy kết quả nghiên cứu nào trong nước công bố về tăng năng suất ngô bằng cách tăng số hàng hạt Các gen quy định số hàng hạt trên bắp mới bắt đầu được phát hiện và làm rõ chức năng

Do đó mà nguồn vật liệu mang những đột biến tiềm năng trong việc tăng năng suất ngô bằng cách tăng số hàng hạt là chưa phổ biến và khó tiếp cận Việc sử dụng chỉ thị phân tử ở ngô đã được sử dụng rất thành công trên thế giới để chọn tạo giống ngô nhưng chưa được áp dụng ở Việt Nam Do vậy, việc ứng

dụng chỉ thị phân tử trong việc nghiên cứu đưa gen fea* làm tăng số hàng hạt

của các dòng ngô bố mẹ ưu tú sẽ nhanh chóng tạo ra giống ngô lai có năng suất cao phục vụ cho sản xuất là thực sự cần thiết

Bằng cách lai tạo chuyển đột biến lặn fea* vào các dòng bố mẹ của tổ

hợp lai ngô LVN10 thông qua phương pháp lai trở lại (MABC: marker assisted backcross) có thể cải tiến năng suất của giống ngô này MABC đã được áp dụng cho lai tạo ngô trên thế giới [4], là phương pháp lai chuyển một vài tính trạng ưu việt (đã biết chỉ thị phân tử) từ dòng cho gene sang dòng nhận gene (là dòng muốn cải tiến) bằng lai trở lại có sử dụng chỉ thị phân tử

để chọn lọc con lai Qua mỗi thế hệ lai trở lại (backcross-BC), trong hệ gene của cây lai thành phần gene (genetic component) của cây cho gene sẽ giảm đi một nửa 50% (F1) , 75% (BC1), 87.5% (BC2), 93.75% (BC3), 96.88% (BC4), 98.43% (BC5) Vì thế, độ giống nhau của cây lai so với dòng nhận gene sẽ tăng dần qua các thế hệ BC

Dòng BC6F1, BC6F2 mang di truyền của giống ngô LVN10, mang thêm gen đột biến fea* có độ đồng hợp cao (>98%) cho năng suất cao hơn so với dòng bố, mẹ Tổ hợp lai F1 giữa các dòng bố mẹ cải tiến mang gen fea*

se cho năng suất vượt trội giống ngô lai LVN10 Chính vì vậy chúng tôi tiến

hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea* làm tăng số

hàng hạt vào các dòng bố, mẹ giống ngô lai LVN10 phục vụ công tác tạo

giống ngô lai năng suất cao”

2 Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu chung : Đánh giá khả năng làm tăng hàng hạt và tăng năng suất của gen fea* trong giống ngô LVN10 phục vụ chọn tạo giống ngô mới có

năng suất cao hơn

Mục tiêu cụ thể :

Cải tiến được dòng bố mẹ của LVN10 mang gen fea* bằng phương pháp chỉ thị phân tử và lai trở lại, từ đó chọn được dòng bố mẹ cải tiến ưu tú, lai tạo được dòng F1 mới tăng lên 2 hàng hạt, năng suất cao hơn giống LVN10 thương mại hiện nay ít nhất 10%

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: dòng ngô LVN10 của Việt Nam và 2 dòng bố

mẹ

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 09/2018 tới tháng 10/2020

Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu thực nghiệm ngoài đồng ruộng tiến hành tại ruộng ngô Đông Anh, Hà Nội và ruộng ngô tại Viện nghiên cứu cây trồng- Tập đoàn Thái Bình Seed Các thí nghiệm sinh học phân tử được thực hiện, tại Bộ môn Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học: Thiết kế các chỉ thị phân tử để xác định gen đích và các gen đồng hợp có mặt trong nền di truyền của cá thể chính xác hơn so với chọn lọc rút dòng bằng mắt thường, từ đó xây dựng quy trình nghiên cứu trên các thí nghiệm tương tự để chọn lọc dòng hiệu quả Phương pháp chọn lọc dòng dựa trên chỉ thị phân tử nhanh và chính xác hơn, khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chọn lọc dòng truyền thống

Ý nghĩa thực tiễn: Chọn được dòng bố mẹ cải tiến LVN10 mang gen fea*, từ đó lai tạo được dòng F1 mới tăng lên 2 hàng hạt, năng suất cao hơn giống LVN10 thương mại, năng suất tăng ít nhất 10% Góp phần làm tăng sản lượng ngô cả nước và tạo ra một giống ngô mới đưa ra thị trường, tạo tiền đề cho các nghiên cứu lai tạo giống ngô mới ở Việt Nam

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM

1.1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam

1.1.1.1 Sản xuất ngô trên thế giới

Ngô là cây ngũ cốc nuôi sống gần 1/3 dân số thế giới Ở các nước trồng ngô, nó được sử dụng làm lương thực với các mức độ khác nhau Đặc biệt ngô là cây lương thực đóng vai trò chủ lực tại các nước Nam Á (42.6%), Trung Mỹ (66.3%) và Châu Phi (75%)[5] Ngoài việc được sử dụng làm lương thực, ngô ngày nay còn có thể được sử dụng như là nguồn thực phẩm cho con người với nhiều cách chế biến khác nhau, hoặc thức ăn cho gia súc và tạo sinh khối, hay trong công nghiệp sản xuất cồn, bánh kẹo, tinh bột Gần đây, ngô còn được chú trọng hơn trong công nghiệp vì được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất xăng sinh học thay thế cho các nguồn nhiên liệu hóa thạch đang cạn kiệt dần Theo số liệu thống kê của FAOSTAT năm 2018, Mỹ vẫn đứng đầu trong các cường quốc sản suất ngô trên thế giới với sản lượng 392.5 triệu tấn (million metric tons) và đóng vai trò rất quan trọng đóng góp cho nên kinh tế nước này Khoảng 20% sản lượng ngô hàng năm được Mỹ xuất khẩu Diện tích chuyên canh cho cây ngô ở Mỹ là khoảng 96 triệu ha phân bố ở hầu hết các bang của Mỹ Cường quốc thứ hai là Trung Quốc với sản lượng là 257.3 triệu tấn (million metric tons) (năm 2018) Mặc dù lúa gạo

là thực phẩm chính của quốc gia này, nhưng mấy năm trở lại đây, sản lượng ngô đã tăng lên là do nhu cầu sử dụng ngô trong chăn nuôi tăng lên Hơn 25 năm qua, sản lượng ngô đã tăng 125%, trong khi sản lượng lúa chỉ tăng 7%,

và hiện nay, khoảng 60% lương thực được sử dụng cho chăn nuôi Brazil cũng là cường quốc thứ ba trong sản xuất ngô với sản lượng hàng năm đạt gần

83 triệu tấn (million metric tons) Tiếp theo là Ấn Độ, với sản lượng ngô hàng

năm là 42,3 triệu tấn.Tiếp theo trong bảng xếp hạng là Argentina (40 triệu tấn), Ukraine (39.2 triệu tấn), Mexico (32,6 triệu tấn), Indonesia (19 triệu tấn, đứng đầu trong các nước ASEAN, sau đó là Philippines và Việt Nam), Pháp (17,1 triệu tấn), và Nam Phi (15,5 triệu tấn) [6]

Theo thống kê của ETC Group và NGO, tốp 7 công ty hạt giống chi phối 71% thị trường hạt giống trên thế giới bao gồm Monsanto, DuPont Pioneer, Syngenta, Vilmorin, WinField, KWS, và Bayer (theo số liệu báo cáo năm 2013) Trong đó ba công tyMonsanto, DuPont Pioneer, và Syngenta chiếm 60% thị trường hạt giống cho bông, đậu tương, và ngô

1.1.1.2 Sản xuất ngô tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực chính chỉ đứng thứ hai sau lúa gạo Cùng với cám gạo, sắn, ngô là nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi Từ 1990 đến nay, sản xuất ngô trong nước có những bước nhảy vọt đáng kể do đưa những giống ngô lai thay thế giống bản địa ngày càng nhiều, thay đổi phương pháp canh tác phù hợp với các giống ngô lai Năng suất ngô Việt Nam có tốc độ tăng nhanh hơn tốc độ trung bình thế giới trong suốt 20 năm qua Tuy nhiên, 70% ngô được trồng trên các vùng có địa hình phức tạp, đất cao, phụ thuộc vào nước trời, ít đầu tư thâm canh, bị hạn chế việc áp dụng khoa học kĩ thuật vào sản xuất, hoặc trồng xen canh cùng những cây trồng có giá trị cao, do đó năng suất ngô vẫn còn thấp Cùng với đó, côn trùng dịch bệnh gây hại cũng ảnh hưởng rất nhiều làm giảm sản lượng dẫn đến việc năng suất ngô tại Việt Nam thấp, chưa đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của người dân

Do sản lượng ngô trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu của thị trường nên mỗi năm nhà nước phải chi hàng tỉ đồng nhập khẩu ngô từ Ấn Độ, Brazil, Argentina, Campuchia, Lào và Thái Lan Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn Việt Nam và Hiệp hội chăn nuôi Việt Nam năm 2013, nước ta phải nhập khẩu 2,19 triệu tấn ngô Đến năm 2018, kim ngạch nhập khẩu ngô là 3 triệu tấn

1.1.2 Phương pháp chọn tạo giống ngô

1.1.2.1 Phương pháp chọn tạo giống ngô trên thế giới

Để tạo được một giống ngô lai thường trải qua 3 bước: phát triển dòng thuần, thử khả năng kết hợp giữa các dòng thuần, tạo con lai giữa các dòng thuần ưu tú

Phương pháp tạo các dòng thuần từ truyền thống đến hiện đại: rút dòng

tự thụ phấn, nuôi cấy bao phấn và noãn chưa thụ tinh, dùng cây kích đơn bội (haploid inducer) được các nhà lai tạo và chọn giống áp dụng để tạo ra dòng thuần Trong đó, các phương pháp hiện đại như nuôi cấy bao phấn và noãn chưa thụ tinh, và đặc biệt công nghệ inducer rất phát triển, làm rút ngắn thời gian tạo ra dòng thuần

Từ những năm 2007-2010, với sự ra đời của công nghệ giải mã genome, việc chọn tạo giống ngô đã có nhiều bước ngoặt lớn Nhiều tính trạng số lượng (QTLs) được tìm ra, ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa các QTL này vào dòng bố mẹ tốt bằng lai trở lại Chọn lọc trên cả hệ gen (Genomic selection) được đưa vào ứng dụng mạnh Chọn lọc trên cả hệ gen (Genomic selection) là một dạng của chọn lọc dựa trên marker, trong đó có hàng chục, hàng trăm, hàng nghìn marker bao phủ toàn bộ hệ gen được sử dụng Genomic selection

là chiến lược lai tạo giống đầy hứa hẹn cho việc cải tiến nhanh chóng các tính trạng phức tạp

1.1.2.2 Nghiên cứu chọn tạo giống trong nước

Hiện nay, ở Việt Nam, chọn tạo giống ngô vẫn chủ yếu bằng phương pháp rút dòng và lai tạo truyền thống Gần đây, kĩ thuật nuôi cấy bao phấn và

noãn chưa thụ tinh, dùng cây kích đơn bội (haploid inducer) đã được áp dụng

để nhanh chóng tạo ra dòng thuần, nhưng kết quả vẫn còn khá khiếm tốn Ngô lai ở Việt Nam được chọn tạo cho đến nay chủ yếu dựa vào 4 phương pháp chính:

Rút dòng bằng tự thụ phấn, tạo dòng thuần kết hợp với chọn lọc: từ các phép lai giữa các dòng thuần, hoặc từ các dòng F1 thương mại của nước ngoài, qua việc tự thụ phấn 8 thế hệ kết hợp với chọn lọc dòng thuần và lai thử (testcross) sẽ chọn ra những dòng bố mẹ để tham gia vào tổ hợp lai mới

Rút dòng bằng nuôi cấy bao phấn: Phấn của cây ngô tạo ra từ các phép lai giữa các dòng thuần, hoặc từ các dòng F1 thương mại của nước ngoài sẽ được nuôi cấy và đa bội hóa để tạo ra dòng thuần sau 1-2 thế hệ

Tạo dòng thuần bằng inducer: Bất kì một cây ngô nào khi nhận phấn của các dòng tạo đơn bội (female haploid inducer) này có thể tạo ra các hạt đơn bội (8% số hạt sẽ là đơn bội) Cây từ hạt này sẽ được xử lí đa bội hóa để tạo ra cây nhị bội thuần chủng 100%

Dùng các chỉ thị SSR để xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng bố

mẹ tiềm năng: Dùng các chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ về di truyền giữa các dòng ngô từ đó có thể giới hạn chỉ tiến hành lai những dòng ngô nào xa cách

về di truyền để có thể tạo ưu thế lai

1.2 GIỚI THIỆU VỀ GIỐNG NGÔ LVN10

Giống ngô lai LVN10 của Viện nghiên cứu Ngô được Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn cho phép khu vực hoá và quy trình sản xuất hạt lai LVN10 được công nhận là tiến bộ ky thuật mới vào tháng 8/1994

Giống LVN10 thuộc nhóm chín muộn, thời gian sinh trưởng vụ xuân

125 - 135ngày, vụ hè thu 95 - 100 ngày, vụ thu đông 110 - 120 ngày Cây cao

200 - 240cm, cao đóng bắp 100 - 140cm có 20 - 21 lá Bắp dài trung bình 18 -

22cm, đường kính bắp 4,5 - 5,5cm, có từ 10 - 12 hàng hạt, số hạt/hàng từ 35 -

45 hạt, tỷ lệ hạt/bắp từ 82 - 84%, khối lượng 1.000 hạt khoảng 300 - 330 gram, hạt bán răng ngựa, màu vàng da cam Năng suất trung bình 55 - 65 tạ/ha, thâm canh tốt có thể đạt 80 - 90 tạ/ha Đặc biệt LVN10 chịu hạn, chịu chua phèn tốt, khả năng chống đổ khá, ít nhiễm các loài sâu bệnh [7]

Hình 1.1: Bắp giống ngô LVN10 ở công ty giống cây trồng Thái Bình.[2]

1.3 KHÁI QUÁT VỀ GEN FEA*

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới về QTLs quy định tính trạng năng suất ngô và gen liên quan đến số hàng hạt trên bắp ngô

Tính trạng năng suất (grain yield-GY) ở ngô là một trong những tính trạng quan trọng và phức tạp nhất trong chương trình lai tạo giống ngô Trên thế giới đã tìm được 8 QTLs liên quan đến 4 đặc điểm liên quan đến năng suất: năng suất hạt (GY), khối lượng 100 hạt (HKW), chiều dài 10 hạt (10-kernel length-KL), và chiều rộng của hàng 10 hạt (10-kernel length width

(KW) [8]

So với các tính trạng nhằm tăng năng suất của ngô, số hàng hạt của bắp ngô có tầm quan trọng và tiềm năng rất lớn Bắp ngô trung bình có 12-14 hàng hạt, nếu tăng thêm hai hàng (mà không làm giảm chiều dài bắp) tức là năng suất đã tăng lên hơn 10%

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy hệ số di truyền của tính trạng số hàng hạt (kernel row number KRN) khá cao (0.97 [4]; hay 0.89 [3]) Đo đạc trong cùng một nghiên cứu, đã xác định hệ số di truyền của số hàng hạt là 0.94, cao hơn so với năng suất hạt (0.87) hay khối lượng hạt (0.76) hay độ sâu cay (0.9) [4] Điều này đồng nghĩa với việc tính trạng KRN ít chịu ảnh hưởng của môi trường và việc cải thiện gene sẽ có hiệu quả mạnh hơn ở tính trạng này so với các tính trạng khác

Những năm gần đây, rất nhiều QTL liên quan đến số hàng hạt và năng suất ở ngô đã được tìm ra và lập bản đồ (Yang et al 2015 [8], Mendes-Moreira et al 2015 [9], Liu et al 2016 [10], Huo et al 2016 [11], Chen et al 2016 [12])

1.3.2 Gen FEA2 và allele fea*

Gene FEA2 (FASCIATED EAR 2) được phân lập đầu tiên từ dòng ngô đột biến toè đỉnh bắp vào năm 2001 bởi nhóm nghiên cứu của GS Dave Jackson và cộng sự Một nghiên cứu năm 2013 tại phòng thí nghiệm của giáo

sư David Jackson, viện Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Mỹ đã

lần đầu tiên lập bản đồ chi tiết tính trạng số lượng và tìm ra gene FEA2 qui

định làm tăng số hàng hạt [13] Gene FEA2 qui định một protein thụ quan lặp

giàu leucine trên màng tế bào (Leucine rich repeat receptor) FEA2 là gene

tương đồng với CLAVATA2 ở Arabidopsis Gene FEA2 được biểu hiện mạnh trên đỉnh sinh trưởng của cây ngô (cờ, bắp) và có chức năng làm hạn chế sự phát triển của định sinh trưởng

Allele đột biến fea* được tạo ra bởi phương pháp gây đột biến bằng

EMS, gây đột biến C->T ở vị trí nucleotide 1430, làm thay đổi amino acid Proline ở vị trí 477 thành Leucine trên protein) gây ra tăng hàng hạt rõ nhất

trên bắp so với các đột biến khác Cây ngô mang đột biến fea* này có bắp với

18-20 hàng hạt và đến 289 hạt/bắp so với cây không đột biến của cùng một

nền di truyền chỉ có 14-16 hàng hạt và 256 hạt/bắp Như vậy đột biến fea*

làm tăng năng suất lên 13% (hình 1.2)

Hình 1.2: So sánh ảnh hưởng của đột biến fea* lên bắp ngô

Ghi chú: (A) Bắp của cây mang đột biến fea* (đột biến làm gen FEA2

bị bất hoạt): bắp ngô có tới 30 hàng hạt nhưng bắp ngắn và hàng hạt lộn xộn,

(B) Bắp của cây hoang dại mang FEA2 (bắp có 14 hàng hạt), (C) Bắp mang đột biến fea* (đột biến làm gen FEA2 bị yếu đi): bắp có 18 hàng thẳng và

chiều dài bắp không đổi so với giống không đột biến của cùng một nền di truyền hình B.[14] Ảnh dưới là mặt cắt ngang của bắp với số hàng hạt được ghi chú ở giữa

1.4 SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG PHÉP LAI TRỞ LẠI

1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Thay vì đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người nghiên cứu chỉ cần tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn tạo giống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection = MAS) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau:

 Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ

 Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

 Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp

* Các giả thuyết mô hình MAS

Trong những năm gần đây, một vài mô hình MAS đã được các nhà khoa học đưa ra và được phân tích cặn kẽ Theo một số mô hình, chỉ cần tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn lọc có kích thước nhỏ và các giữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Hơn thế nữa, Frisch M (1999) đã đưa ra chiến lược “chọn lọc hai giai đoạn” để áp dụng trong trường hợp chưa biết các thông tin về bản đồ liên

kết của các chỉ thị phân tử [15]

Theo Robert Koebner (2003), những tính toán dựa trên cơ sở máy tính để so sánh các chiến lược chọn lọc 2 bước, 3 bước và 4 bước (stage) về tỷ

lệ kiểu gen bố mẹ phục hồi (recurrent parent genotype-RPG) cho thấy:

 Với chiến lược lấy mẫu 4 bước và quần thể từ 50-100 cá thể, tỷ lệ kiểu gen giống bố mẹ (RPG) có thể đạt 96% với độ tin cậy 90% Trong khi chọn giống truyền thống phải cần tới 6 thế hệ và với rủi ro lớn hơn

 Việc tăng số lượng chỉ thị để đánh giá kiểu gen ở mỗi thế hệ có rất ít tác dụng Khi ngưỡng 1 chỉ thị/20cM đạt được, việc thêm chỉ thị nữa

là không cần thiết (ngoại trừ các chỉ thị xung quanh locus quan tâm) Tỷ lệ tái tổ hợp chứ không phải số lượng chỉ thị là yếu tố hạn chế trong việc giảm các cản trở liên kết Điều đó cho thấy, việc lấy mẫu quần thể lớn hơn với ít chỉ thị hơn có tác dụng hơn việc làm ngược lại.[16]

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống với các ưu điểm sau:

 Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở

những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang)

 Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc điểm này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc)

 Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của nhiều locus trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau

 Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví

dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau Trong trường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả Nhưng nếu áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt

 Ứng dụng MAS (Marker Assisted Selection) đã được sử dụng phổ biến

ở lúa nhưng ít được dùng cho ngô do nghiên cứu di truyền ở ngô rất khó và phức tạp, chỉ có rất ít các gen của ngô được tìm ra Từ khi công nghệ giải mã hệ gen thế hệ mới (next gene sequencing) ra đời (sau 2007), các gen ở ngô đã được tìm ra và công bố rất nhiều, và đang tiếp tục tăng Nhiều gene tham gia qui định tính trạng số lượng được tìm ra như: gen qui định thời gian ra hoa DWARF8 [14]; góc lá đứng LIGULELESS [17]; số hàng hạt FASCIATED EAR [3] đã thúc đẩy mạnh ứng dụng của MAS và MABC (marker assisted backcrossing) để

đưa các gen quy định tính trạng số lượng này vào dòng bố mẹ tốt bằng back-cross

1.4.2 Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai hồi giao (Marker Assited Backcrossing - MABC)

Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo Bằng phương pháp này việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ưu việt thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được [18]

Trong trường hợp ta có 1 giống cây trồng ưu tú nhưng cần đưa thêm một vài gen mong muốn vào giống đó, người ta sử dụng quy trình lai trở lại nhiều lần với giống ưu tú nhằm thu được 1 giống cây trồng mới mang gen mong muốn nhưng vẫn gữ nguyên nền di truyền của giống ưu tú Theo quy trình lai trở lại truyền thống, phải ít nhất 6-8 thế hệ mới thu được cây mang gen mong muốn nhưng giữ được gần 100% nền gen di truyền của giống ưu tú

Quy trình tổng quát quá trình lai tạo sử dụng phương pháp lai trở lại qua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trong dòng BC qua các thế hệ được minh họa ở dưới đây (hình 1.3)

Hình 1.3: Quá trình backcross qua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trong

các đời backcross Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân

tử, các nhà khoa học đã đưa ra một phương pháp chọn giống phân tử mới – đó

là “Chọn giống lai trở lại nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Backcrossing – MABC) MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đưa locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng hay gen mong muốn vào giống ưu

tú nhằm chọn tạo giống mới mang gen/tính trạng di truyền số lượng mong muốn nhưng vẫn giữ nguyên (gần 100%) nền gen di truyền của giống ưu tú với thời gian chọn giống rất ngắn: quy trình chọn giống kết thúc ở thế hệ BC3, thậm chí BC2

Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một tính trạng di truyền

số lượng/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hội nhập của dòng cho thông qua phần còn lại của hệ gen [19,20] Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗi thế hệ Ưu điểm chính của phương pháp MABC là:

 Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với locus gen đích

 Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp

 Tiến gần đến locus quan tâm trên bản đồ liên kết

 Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm

Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng [19] Thông qua phương pháp MABC tốc độ của quá trình chọn lọc được đẩy nhanh lên gấp đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tương đương với BC6 theo phương pháp thông thường) Chọn giống qua phương pháp BC nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục được những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ loại bỏ được các tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng một alen hay giữa các alen gây ra Những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng cách phân tích kiểu hình Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt

* Ứng dụng MABC trong chọn lọc ngô

Ở ngô MABC đã được ứng dụng thành công để cải tiến những tính trạng phức tạp như tính trạng năng suất hạt Sử dụng MABC, 6 đoạn NST từ Tx303 và Oh43 được chuyển sang 2 dòng thuần B73 và Mo17 qua 3 thế hệ lai trở lại và 2 thế hệ tự phối Những dòng được cải tiến được lựa chọn dựa trên những đánh giá Sau đó, phép lai đơn giữa dòng cải tiến B73 và dòng cải tiến Mo17 cho dòng lai tăng năng suất 12-15% [20]

Ribaut et al., 2007 đã mô tả kết quả MABC trong cải tiến năng suất ngô trong điều kiện khô hạn của ngô nhiệt đới và so sánh với các phương pháp thay thế MAS [21] Việc đưa các alleles từ 5 vùng đích mà tham gia vào sự biểu hiện của các yếu tố cấu thành năng suất và đặc điểm ra hoa đã làm tăng năng suất hạt và làm giảm sự chênh lệch thời gian ra hoa đực và hoa cái trong điều kiện thiếu nước Khoảng 85% kiểu gen của bố mẹ (recurrent parent) ở ngoài vị trí target đã được phục hồi sau 4 thế hệ MABC bằng việc sàng lọc quần thể phân ly với số lượng cá thể lớn (2200 cá thể) cho 3 thế hệ đầu Các

dòng BC2F3 được lai với 2 tester và đánh giá ở những chế độ nước khác nhau cho thấy năng suất của các dòng lai chọn lọc từ MABC cao hơn so với đối chứng trong điều kiện thiếu nước, ít nhất là 50% (dựa trên năng suất trung bình của 5 dòng lai từ MABC tốt nhất) Kết quả cũng chỉ ra rằng việc chọn lọc khoảng 10-20 kiểu gen ở mỗi chu kì MABC là hiệu quả nhất [21]

Theo báo cáo của Zhao et al., 2012, locus tính trạng số lượng chính

(qHSR1) trên NST số 2 (bin 2.09) quy định khả năng kháng bệnh than

(head smut) đã được tích hợp thành công vào 10 dòng ngô thuần năng suất cao (dòng mẫn cảm với bệnh than) Mỗi dòng thuần này được lai với dòng cho gen Ji1037, rồi được lai trở lại với dòng nhận gen tương ứng qua 5 thế

hệ Việc chọn lọc foreground được tiến hành với các marker liên kết với

qHSR1 Việc chọn lọc tái tổ hợp (recombinant selection) được tiến hành ở

thế hệ BC4 bằng flanking marker để giảm những liên kết kéo theo Việc chọn lọc background (chọn lọc nền di truyền) được thực hiện ở thế hệ BC5 với các marker SSR bao phủ khắp hệ gen Các cá thể BC5 được chọn lọc sẽ được cho tự thụ phấn qua hai thế hệ Cả 10 dòng thuần được cải tiến mang

qHSR1 đều thể hiện tăng tính kháng với bệnh than Thế hệ lai từ các dòng

thuần này tăng tính kháng rõ rệt và đảm bảo duy trì được các đặc tính nông học ưu tú khác [22, 23]

Gupta et al., 2013 đã sử dụng phương pháp MABC để tạo ra giống ngô lai Vivek Quality Protein Maize (QPM) 9 từ phép lai giữa hai dòng thuần CM

212 và CM 145 mà đã được cải tiến khả năng tổng hợp lysin và trypyophan

bằng cách tích hợp alen opaque-2 từ dòng cho gen là CML 180 và CML170

Giống ngô lai Vivek Quality Protein Maize (QPM) 9 tăng khả năng tổng hợp tryptophan và lysin lên lần lượt là 41 và 30% so với giống ngô lai ban đầu [24]

Gần đây, Zhang et al., 2017 đã lập bản đồ của tính trạng số lượng Qgls8 cho khả năng kháng bệnh đốm lá (gray leaf spot - GLS) ở ngô với vùng rộng khoản 130 kb nằm trên NST số 8 bao gồm 5 genes (predicted genes) [25]

Ở Việt Nam, phương pháp MABC cũng đã được áp dụng thành công

để cải tiến một số giống lúa như Bắc Thơm kháng bạc lá, BC15 kháng đạo ôn, lúa chịu ngập AS996

Nguyễn Thị Lệ., 2014, sử dụng dòng chuẩn kháng IRBB21 mang gen kháng bệnh Xa21 lai tạo với giống Bắc Thơm 7 tạo ra giống cải tiến kháng 3 chủng bạc lá do Bộ môn bệnh cây- Khoa Nông học phân lập: Chủng 3 (Isolate: 981.HUA10146); chủng 5 (Isolate: 996.HUA10147); chủng 14 (Isolate: 1035.HUA10153) cho năng suất tương đương với giống Bắc Thơm

7 [26]

Năm 2017, Trần Thị Thúy và các cộng sự đã thiết kế mồi nhận biết

gen ứng viên (candidate gene) kháng đạo ôn Pik-p ở một số giống lúa địa phương Tầm soát trình tự gen Pik-p của 36 giống lúa địa phương và xác định

giống OM5629 có trình tự, thành phần Nucleotide, amino acid ở vùng CDS (Coding DNA Sequence) tương tự như gen tham chiếu Cặp mồi Pikpdel16 đã được thiết kế có thể khuếch đại đoạn gen với kích thước 14 bp (ở các giống

có gen ứng viên Pikp) và 190 bp (ở các giống có trình tự sai khác với trình tự gen Pikp) Sự dụng phương pháp lai hồi giao, tiến hành tích hợp gen ứng viên pik-p vào giống BC5 [27]

Doãn Thị Hương Giang và các cộng sự (2017) cũng đã ứng dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) đã được sử dụng để cải tiến giống lúa AS996 phổ biến thành giống lúa có thể chịu ngập mà vẫn duy trì các đặc tính ban đầu đang được nông dân và người tiêu dùng đón nhận QTL chịu ngập Sub1 giữ vai trò tới 70% tính chịu ngập Gen này được quy tụ vào giống AS996 bằng lai trở lại và hỗ trợ của chỉ thị phân tử Nghiên cứu đã sử dụng

460 chỉ thị phân tử để đánh giá đa hình của bố mẹ [28]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Dòng bố (BL10) và dòng mẹ (ML10) của giống lai đơn LVN10, không

mang allen đột biến fea* (Giống ngô lai đơn LVN10 có nguồn gốc của Viện

Nghiên Cứu Ngô, được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật tháng 8 năm

1994 Mặc dù đã được tạo ra cách đây 26 năm nhưng hiện giống LVN10 vẫn

là giống được nhiều hộ nông dân chọn lựa vì năng suất cao và khả năng thích ứng với mọi vùng sinh thái trong cả nước)

Dòng cho gene fea2-1328 (W22) cung cấp bởi phòng thí nghiệm của giáo

sư Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory-Mỹ), mang allen đột biến

Acrylamide, Bis-Acrylamide, Sodium thiosunfate, Urea ;

Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: bốn loại deoxynucleotide triphosphat (dNTPs) của hãng Sigma; Taq-DNA Polymerase của hãng Fermentas

+ 300 mồi SSR nằm trên 10 nhiễm sắc thể được tìm trên website http://www.maizegdb.org

5`-GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3`) được thiết thiết kế dựa trên trình tự

của gen FEA2 Bommert et al., 2013.

(MDF-2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bố trí thí nghiệm lai trở lại (BC)

Thí nghiệm cải tiến tổ hợp lai dòng bố (BL10), mẹ (ML10) tạo giống LVN10 mang allele fea* bằng phương pháp lai trở lại có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử được khái quát trong sơ đồ lai dưới đây Cụ thể thí nghiệm thể hiện trong hình 2.1

@

@ BC5F3

Ở vụ Xuân 2019, bố trí thí nghiệm với 2 tổ hợp lai BC5F1- ML10/W22

và BC5F1- BL10/W22, mỗi tổ hợp lai 140 cá thể, trồng 10 hàng, mỗi hàng

14 cây

Ở vụ Thu 2019, tiếp tục bố trí thí nghiệm cho 2 tổ hợp lai BC5F2- ML10/W22 và BC5F2- BL10/W22 tương tự giống vụ thu 2019, mỗi tổ hợp lai 140 cá thể, trồng 10 hàng, mỗi hàng 14 cây

Vụ Xuân 2020, trồng 5 dòng ưu tú, bố trí thí nghiệm với mỗi dòng 2 hàng, mỗi hàng 14 cây, chọn 20 cây mỗi dòng không có bệnh đánh giá hình thái nông sinh học

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN- CTAB

Lấy mẫu lá ngô để kiểm tra chỉ thị phân tử ở giai đoạn thời kỳ 3-6 lá , cắt

2 lá non/cây ở các cá thể ở mỗi tổ hợp lai

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp có sử dụng CTAB có cải tiến để tiến hành tách chiết ADN từ các dòng BC

1 Cắt 2 cm2 mẫu lá cho vào ống eppendoft 2ml đã có bi và viết ống đầy

4 Ủ mẫu ở 65 độ C trong 20 phút

5 Bổ sung 800 µl chlorofom vào ống mẫu trong tủ hút

6 Đóng nắp ống, lắc đều sau đó cho vào ly tâm 13000 rmp trong 15 phút

7 Lấy ống ra khỏi máy ly tâm, lúc này ống chia tành 3 lớp, dịch trên cùng trong suốt màu hơi xanh hoặc vàng, ở giữa là lớp bã lá, cuối cùng

là chlorofom có màu xanh đậm Hút 400 µl dịch tách trên cùng cho vào ống eppendoft 1,5 µl đã bổ sung 400 µl isopropanol

8 Lắc đều ống, ủ mẫu trong tủ lạnh -40 C ít nhất 1 giờ đồng hồ

9 Lấy mẫu ra từ tủ lạnh, lắc đều, ly tâm 13000 rpm trong 15 phút

10 Đổ bỏ dịch bên trên, giữ lại kết tủa ở đáy ống nghiệm

11 Rửa tủa bẳng EtOH 70%, đổ bỏ dịch và phơi phô trong 15 -20 phút

12 Thêm 100 µl nước cất khử trùng vào mỗi ống, vortex cho tan hết tủa sau đó cất mẫu vào tủ lạnh ngăn mát

2.2.2.2.Phương pháp PCR bằng mồi dCAPs

Phương pháp nghiên cứu sử dụng PCR kiểm tra sự có mặt của gene fea*

trong các con lai Sử dụng chỉ thị phân tử dCAPs đặc hiệu cho đột biến điểm

của allele fea* Bommert et al., 2013, tác giả đã có sẵn trình tự các cặp mồi kiểm tra gene fea* (allele fea2-1328) Cặp mồi này khi nhân tạo ra sản phẩm

PCR, sản phẩm PCR nhân lên từ allele đột biến sẽ bị cắt bằng enzyme SmlI, còn sản phẩm PCR nhân lên từ allele hoang dại không đột biến sẽ không bị cắt Ngoài ra chúng tôi cũng sẽ thiết kế thêm các cặp mồi OVS1 – OVS2 dựa trên trình tự của gene FEA2 Cặp mồi OVS1 – OVS2 khi nhân tạo ra sản phẩm PCR, sản phẩm PCR nhân lên từ allele đột biến sẽ bị cắt bằng enzyme PstI

Trình tự cặp mồi sử dụng cho kiểm tra đột biến fea* bởi Bommert et al.,

2013

Fea*F 5’-GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3’

- Trình tự cặp mồi dCAPs dùng trong PCR:

OVS1 –F 5’-GCAACCTCCCCATGCCCCCAAGC

CCCGCA-3’

OVS1 –R 5’-GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3’

- Thành phần dung dịch phản ứng PCR với mồi dCAPS

Phản ứng PCR được chạy với chu kỳ nhiệt với cặp mồi OSV1 và OSV2 được trình bày cụ thể 2 bước như sau:

• Bước 1: Cặp mồi OSV1/OSV2 biến tính ở 940 C trong 3 phút (tách mạch DNA khuôn), chạy 5 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 20 giây, 52 0C trong 30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 30 giây (kéo dài)

• Bước 2: Chạy 39 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 20 giây, 59 0C trong

30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 30 giây (kéo dài), cuối cùng giữ ở 72 0C trong

5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng)

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt PCR với cặp mồi OSV1 và OSV2

2.2.2.3 Phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn PstI

Sử dụng cặp mồi OSV1 và OSV2 trong PCR khuếch đại được đoạn DNA dài 212bp, sau đó sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme cắt giới hạn PstI tại điểm không đột biến trên đoạn DNA nhờ đó phân biệt được các kiểu gen khác nhau của các cá thể đồng hợp trội (không đột biến), dị hợp và đồng hợp lặn (gen đột biết) Phản ứng cắt DNA nhờ eyme cắt giới hạn PstI trong điều kiện

370C trong 2 giờ, dưới đây là bảng thành phần dung dịch phản ứng cắt PCR bằng PstI

- Thành phần dung dịch phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Pst I

Sản phẩm PCR (DNA)

2.2.2.4.Phương pháp PCR với mồi SSR

Thành phần dung dịch phản ứng PCR với mồi SSR

Phản ứng PCR được chạy với chu kỳ nhiệt:

• Bước 1: Cặp mồi SSR biến tính ở 940 C trong 3 phút (tách mạch DNA khuôn

• Bước 2: Chạy 39 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 30 giây, 55 0C trong

30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 40 giây (kéo dài), cuối cùng giữ ở 72 0C trong

5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng)

2.2.2.5 Phương pháp điện di trên gel poly-acrylamide

Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide

Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thước 30cm x 12cm):