(LUẬN văn THẠC sĩ) xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố ciguatoxins trong chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ kép (LC MS MS)

Gần đây,nhóm nhà khoa học Nhật Bản đã công bố về kết quả phát triển phương phápmới phân tích độc tố CTXs trong mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏngkhối phổ kép LC/MS-MS.Tuy nhiên đ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sốliệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác.

Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm

2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Phương Nga

Để luận văn này đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè.

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đào Việt Hà và TS Phạm Đức Thịnh đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi chân thành cảm ơn đề tài Nghiên cứu độc tố của một số loài cá rạn

và thân mềm có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam (mã số: KHCBBI.02/18-20) của Viện Hải dương học đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện Luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa Học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Quản lý Tổng hợp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.

Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Hải dương học cũng như các anh chị em trong phòng Hóa sinh trong quá trình thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Nha Trang, ngày 04 tháng 10 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Phương Nga

: Ciguatoxin: Ciguatoxins: Distilled water: Đơn vị diện tích: Electrospray ionization: Electron ionization: Fast-atom bombardment

: High-resolution fast atom bombardment mass

spectrometry: Proton NMR spectroscopy: Correlated Spectroscopy: Gas chromatography: High-performance liquid chromatography: High Resolution Mass Spectrometry: Identification point

: Ion spray: Liquid Chromatography: Limit of Detection

: Ngộ độc thực phẩm biển: Phòng thí nghiệm

: Radio frequency: Selected Ion Monitoring: solid phase extraction

: Selected Reaction Monitoring

: Trifluoroacetic acid: Temperature

Bảng 1.1 Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng phân tích bằng

sắc ký khối phổ……… ………17

Bảng 2.1 Định danh và ký hiệu mẫu 25 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các điều kiện chiết rút đối với dịch chiết … 36 Bảng 3.2 Thời gian lưu của mẫu trong phép phân tích với pha tĩnh là

Hình 1.1 Một số cấu trúc của Ciguatoxin từ G toxicus………… ……….10

Hình 1.2 Cấu trúc Pacific (P-CTX-1) và Caribbean (C-CTX-1)

ciguatoxin……… 11

Hình 1.3 Mô phỏng chuỗi thức ăn biển……… 12 Hình 1.4 Mô hình hệ thống LC-MS 14 Hình 1.5 Khối phổ và thời gian lưu của 16 dẫn xuất CTXs ……… …… 22 Hình 3.1 Sắc ký đồ CTX-1B chuẩn 38 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu cơ có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn 38 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu gan có cùng thời gian lưu so với mẫu chuẩn 38 Hình 3.4 Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs bằng

LC/MS-MS trên pha tĩnh Agilen (A: C026; B: C029; C: C034; D: G035; E:G036)……… ……….……… 40

Hình 3.5 Sắc ký đồ một số mẫu dương tính khi phân tích CTXs bằng

LC/MS-MS trên pha tĩnh Wakosil (A: G028; B: G027; C: C026; D: C027; E:G030)……… 42

Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu C034 khi phân tích CTXs trên 02 pha tĩnh (A: pha

tĩnh Agilent; B: pha tĩnh Wakosil)……… ………….43

Hình 3.7 Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Agilent (A: sắc ký đồ mẫu cá chứa

độc tố; B: sắc ký đồ Acetone; C: Sắc ký đồ chuẩn CTX-1B)……… …….44

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 NGỘ ĐỘC CIGUATERA 7

1.1.1 Khái niệm 7

1.1.2 Đối tượng gây ngộ độc 7

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng 7

1.2 ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS 9

1.2.1 Bản chất, cấu trúc hoá học 9

1.2.2 Cơ chế hoạt động 11

1.2.3 Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học 11

1.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ 12

1.3.1 Nguyên lý hoạt động 13

1.3.2 Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ 16

1.3.3 Ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố Ciguatoxins 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 25

2.2.1 Nguyên liệu, thiết bị 25

2.2.1.1 Dung môi, hóa chất 25

2.2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 26

2.2.2 Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ cơ và gan của Chình biển 27 2.2.3 Xác định độc tố CTXs bằng phương pháp LC/MS-MS 32 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 KẾT QUẢ CHİẾT RÚT VÀ TİNH SẠCH ĐỘC TỐ CTXS TỪ MỘT

SỐ BỘ PHẬN CỦA CHÌNH BİỂN (CƠ, GAN) 36 3.2 THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ CTXS TRONG CƠ, GAN, CHÌNH BİỂN 37 3.3 QUY TRÌNH THỰC NGHİỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ CTXS BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS 46 3.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (ĐỐI CHIẾU VỚI KẾT QUẢ KIỂM CHỨNG CỦA NHẬT BẢN) 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ciguatera (CFP) là dạng ngộ độc thực phẩm biển (NĐTPB) do ăn phảicác loài cá rạn san hô vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt chứa độc tố ciguatoxin(CTX) và các dẫn xuất độc tố này

Độc tố CTXs được sản sinh ra do một loài vi tảo sống đáy là

Gambierdiscus toxicus và được tích lũy qua chuỗi thức ăn biển Đến nay đã

phát hiện hơn 400 loài cá rạn có nguy cơ ngộ độc CFP

Mặc dù tỉ lệ tử vong thấp (0,1%), nhưng CFP hiện nay là một trongnhững mối lo ngại lớn của thế giới về mặt an toàn thực phẩm (ATTP), do độc

tố có hiệu ứng dài hạn (vài tháng cho đến cả năm), là gánh nặng đối với dịch

vụ y tế, chăm sóc sức khoẻ cộng đồng CFP cũng gây nên tâm lý hoang mang,bất ổn cho người tiêu dùng, dẫn đến thiệt hại về kinh tế đối với ngành côngnghiệp thuỷ hải sản nội địa và xuất khẩu của nhiều quốc gia

Trước đây, tình trạng ngộ độc CFP chỉ xảy ra ở Nam Thái bình dương,Caribbe và Ấn Độ, nhưng đến nay đã lan khắp châu Á, châu Âu và Bắc Mỹ

Ở Mỹ, từ thập niên 1970 đến nay, các vụ ngộ độc CFP đã tăng gấp 5 lần lênhơn 250 vụ mỗi năm Trong khi đó, do nhập khẩu phần lớn hải sản, HồngKông mỗi năm xảy ra hàng trăm vụ ngộ độc CFP so với mức chưa đến 10 vụvào những năm 1980 Tỷ lệ mắc và phân bố CFP trên thế giới ngày càng giatăng, theo thống kê của FAO, hàng năm có khoảng 20,000 - 30,000 vụ ngộđộc CFP được ghi nhận, phần lớn tập trung tại các vùng biển nhiệt đới và cậnnhiệt đới

Ở Việt Nam, theo thông tin từ y tế địa phương, từ 2007 đến nay, hàngnăm đều ghi nhận được rải rác các vụ ngộ độc nghi ngờ CFP, xảy ra chủ yếu

ở các vùng ven biển Quảng Ngãi, Ninh Thuận, Bình Thuận,…

Năm 2012, hội thảo ATTP của EU đã báo cáo ghi nhận độc tố nghi ngờCTXs trong cá Hồng nguồn gốc Việt Nam Đến tháng 5/2017, EU chính thứccảnh báo về ATTP đối với mặt hàng cá Hồng xuất khẩu của Việt Nam

Dù được rất nhiều sự quan tâm, hướng nghiên cứu về độc tố CTXs củathế giới vấp phải trở ngại lớn về phương pháp cũng như nguồn chất chuẩn rấtquý hiếm CTXs là những hợp chất polyete tan trong các dung môi hữu cơ,bền nhiệt (nhiệt độ cao và đóng băng) và bền pH (axit hay kiềm), không nhạyvới ánh sáng tia cực tím, nên không thể phân biệt bằng trực quan Gần đây,nhóm nhà khoa học Nhật Bản đã công bố về kết quả phát triển phương phápmới phân tích độc tố CTXs trong mẫu thịt cá sử dụng hệ thống sắc ký lỏngkhối phổ kép (LC/MS-MS).

Tuy nhiên đến nay vẫn chưa có công bố về công trình nghiên cứu độc

tố này tại Đông Nam Á, gây khó khăn trong việc giám sát và cảnh báo vấn đềATTP Hơn nữa, quá trình nghiên cứu CFP tại Việt Nam gặp nhiều khó khănnhư về đặc tính sinh học loài, nguồn gốc, cơ chế tích lũy và lan truyền độc tốtrong chuỗi thức ăn biển rất phức tạp, đặc biệt là chưa có phương pháp phântích phù hợp do thiếu trang thiết bị phân tích hiện đại chuyên sâu và chưa tiếpcận, cập nhật phương pháp phân tích của thế giới

Hiện nay, Viện Hải dương học đã xây dựng được quy trình phân tíchđộc tố trong cá Hồng nhưng chưa có quy trình phân tích đối với loài Chìnhbiển, vì vậy, học viên chọn đề tài luận văn “Xây dựng quy trình thực nghiệmphân tích độc tố Ciguatoxins trong Chình biển bằng phương pháp sắc ký lỏngđầu dò khối phổ kép (LC/MS-MS)” Nội dung phân tích độc tố CTXs trong đềtài này sẽ sử dụng quy trình phân tích độc tố CTXs cập nhật mới nhất củaNhật Bản Tuy nhiên, quy trình thực nghiệm trên cần được hiệu chỉnh phùhợp với điều kiện hệ thiết bị hiện có của Việt Nam cũng như thành phần hoásinh của Chình biển để đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phântích

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Dựa trên quy trình phân tích Ciguatoxins của Nhật Bản, tiến hành hiệu chỉnh

để xây dựng được một quy trình thực nghiệm vừa phù hợp với điều kiện trangthiết bị tại Việt Nam vừa phù hợp với thành phần hóa sinh của Chình biển đểđảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của kết quả phân tích

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- 14 cá thể cá Chình, thuộc 4 loài Chình biển (cá Lịch vân vòng, cá Lịch vânsóng, cá Lịch chấm tia, cá Lịch mõm trắng) được thu mua tại đảo Lý Sơn(Quảng Ngãi), mỗi cá thể tách lấy 2 phần cơ và gan

3.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp chiết rút: dung môi Acetone được lựa chọn để hòa tan chất phân tích, tách chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu

- Phương pháp tinh sạch: thử nghiệm các điều kiện tinh sạch theo phương pháp chiết lỏng – lỏng và phương pháp chiết ly pha rắn SPE

- Xác định độc tố CTX: phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS)

- Xử lý số liệu thực nghiệm, đánh giá hiệu quả của quy trình thực nghiệm bằng phương pháp thống kê F-test, T-test trong phần mềm Excel

4 Nội dung nghiên cứu

- Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ một số bộ phận của Chình biển (cơ, gan)

- Lựa chọn pha tĩnh tối ưu để xác định độc tố CTX trong mẫu đã chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC/MS-MS)

- Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố CTX bằng phương phápLC/MS-MS

- Đánh giá kết quả của quy trình thực nghiệm trên cơ sở so sánh, đối chiếu vớikết quả kiểm chứng tại PTN của Nhật Bản

5 Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu

Trên cơ sở vận dụng những tiến bộ khoa học - kỹ thuật và công nghệmới của thế giới, đây là hướng nghiên cứu mới, tiên phong tại Việt Nam Mặtkhác, kết quả của đề tài là dẫn liệu khoa học tin cậy phục vụ an toàn thựcphẩm biển, và là tiền đề cần thiết để có những công trình công bố quốc tế vềđộc tố CTX trong sinh vật biển tại Việt Nam

7 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu

Trước những năm 2010, kỹ thuật sắc ký lỏng đầu dò khối phổ đơn(single LC/MS) sử dụng chế độ quét ion chọn lọc (SIM) được áp dụng để pháthiện độc tố này Sau đó, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, sắc kýlỏng khối phổ sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (Electrosprayionization – ESI) được ứng dụng để định lượng độc tố CTXs với nguyên lýchọn lọc phân tử được proton hóa [M+NH4]+ hoặc [M+H]+ để cắt các phân tửnước trong bộ lọc khối tứ cực thứ 2 (Q2) của chế độ ghi phổ nhiều ion chọnlọc (Multi Reaction Monitoring, MRM) Tuy nhiên, các ion sau khi mất điphân tử nước lại không đủ độ nhạy để phát hiện được ở nồng độ tương đương0,01 ppb CTX-1B (giới hạn ATTP của US FDA) Khắc phục nhược điểm này,nhóm nghiên cứu của Yogi đã phát triển thành công phương pháp sử dụngLC/MS-MS với chế độ SIM và MRM có độ nhạy cao hơn, sử dụng cách bắtcặp phân tử CTX với một số ion dương hoặc âm (H+, Na+, K+, NH4-, SO42-,

OH-…) Phương pháp này được đánh giá có ưu thế về độ nhạy và tính ứngdụng trong phân tích định lượng độc tố CTXs, mặc dù đầu dò khối phổ độphân giải cao (HRMS) ghép nối với hệ sắc ký đã được chứng minh được khảnăng phát hiện các đồng phân của độc tố CTXs trong điều kiện thiếu vắngchất chuẩn

Tuy nhiên, tuỳ thuộc vào thông số kỹ thuật của từng hệ thống thiết bịLC/MS-MS, đòi hỏi quá trình thăm dò, thử nghiệm nhằm tối ưu hoá quy trìnhphân tích bao gồm công đoạn tách chiết, loại tạp chất trong mẫu, điều kiệnphản ứng (nhiệt độ, áp suất…) và hệ dung môi pha động (đẳng dòng hay đổidòng), cột sắc ký… phù hợp để có được LOD và LOQ tốt nhất đối với phântích độc tố CTXs Báo cáo này trình bày quy trình thực nghiệm tối ưu hoáphương pháp phân tích độc tố CTXs trong mẫu Chình biển sử dụng hệ thốngsắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ kép Shimadzu LCMS 8040 tại phòngthí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về An toàn thực phẩm vàmôi trường (khu vực miền Trung) tại Viện Hải dương học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NGỘ ĐỘC CIGUATERA

1.1.1 Khái niệm

Ciguatera Fish Poisoning (CFP) là một dạng ngộ độc thực phẩm biển ởngười do tiêu thụ các loài cá rạn vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới đã tích lũyđộc tố Ciguatoxin (CTX) Độc tố CTX được biết đến có nguồn gốc từ loài vitảo giáp sống đáy Gambierdiscus toxicus [2].

Theo một bài báo cáo được FAO công bố năm 2004, hơn 400 loài cáđược biết đến là nơi di truyền ngộ độc CFP

1.1.2 Đối tượng gây ngộ độc

Con người đều được cho là nhạy cảm với độc tố CTX [3] Dân cư ở cácvùng biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới có khả năng ảnh hưởng cao nhất do tầnsuất cao tiêu thụ các loài cá độc Tuy nhiên, sự gia tăng mức tiêu thụ sảnphẩm thủy sản cùng với sự gia tăng giao thông liên khu vực của các sản phẩmthủy sản đã mở rộng phạm vi địa lý của các vụ ngộ độc CFP [3]

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng

“Ciguatera” là một hội chứng lâm sàng với chuẩn đoán chủ yếu vẫndựa trên tiền sử tiêu thụ cá rạn san hô và biểu hiện lâm sàng được xác địnhbởi cả triệu chứng tiêu hóa và thần kinh [2]

Sự khác biệt về địa lý cũng sẽ gây ra sự khác biệt về triệu chứng củacác bệnh nhân

Khởi phát của triệu chứng CFP thường bắt đầu bằng các vấn đề củađường tiêu hóa như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau bụng trong vòng 12 giờsau khi ăn phải cá có độc tố Các triệu chứng thường thuyên giảm trong vòng

24 giờ [2] Các vấn đề về tim mạch cũng có thể xuất hiện trong suốt giai đoạncấp tính này, thường là nhịp tim chậm và hạ huyết áp

Từ vài giờ đến hai tuần sau khi ngộ độc cá ciguatera, những vấn đề vềthần kinh như đau đầu, đau cơ, dị cảm (tê và ngứa ran ở vùng ngoại vi và tứchi), rối loạn cảm giác nhiệt độ (sự đảo ngược cảm giác nhiệt độ với các vật

thể lạnh sẽ cảm thấy nóng và ngược lại),… có thể xuất hiện [2] Các triệuchứng thần kinh chủ quan khác được báo cáo như vị kim loại, ngứa, đau khớp

và đau cơ (đau cơ đặc biệt là ở chân) và cảm giác răng lung lay [2] Có thểxuất hiện triệu chứng chấn động não đến 10 ngày sau khi bị ngộ độc Đau đầunhiều vị trí, đau dữ dội và kéo dài cũng là biểu hiện khi ngộ độc ciguatera.Những triệu chứng liên quan đến hệ thần kinh trung ương (tê liệt, mất điềuhòa, choáng váng và nhầm lẫn) thường là dấu hiệu của các trường hợp nghiêmtrọng nhất Một loạt các triệu chứng rối loạn thần kinh đã được báo cáo saukhi ngộ độc ciguatera bao gồm mệt mỏi, lo lắng, trầm cảm, hysteria, rối loạntrí nhớ, thiếu hiệu quả về tinh thần

Vấn đề tiêu hóa cấp tính thường giải quyết trong vòng 1 hoặc 2 ngày

và các rối loạn tim mạch đảo ngược trong vòng 48 – 72 giờ Sự phục hồi từcác triệu chứng thần kinh là lâu hơn và ít dự đoán hơn, từ 1 tuần đến 6 tháng

Ngứa, đau khớp và mệt mỏi có thể kéo dài trong nhiều tháng hoặcnhiều năm Sự mệt mỏi có thể dẫn đến suy nhược như một hội chứng mệt mỏimãn tính Mãn tính có thể phản ánh sự tồn tại lâu dài của ciguatoxins trong cơthể

Sự tồn tại của các triệu chứng ở một số bệnh nhân trong vài năm đãđược ghi nhận và không có gì bất thường Khoảng 65% số bệnh nhân có triệuchứng từ 6 tháng hoặc lâu hơn với báo cáo tái phát lên đến 2 năm Ở Tháibình dương, các báo cáo đã ghi nhận về sự tiến triển nhanh chóng của triệuchứng thần kinh khi ngộ độc CFP, dẫn đến suy hô hấp, hôn mê và đôi khi tửvong [2]

Trên cơ sở các quan sát cho thấy rằng việc tiếp xúc nhiều lần với độc

tố ciguatera có liên quan đến một bệnh lâm sàng nặng hơn, người ta đã đưa ragiả thuyết rằng CTX tan trong chất béo có khả năng tích tụ trong cơ thể người

và làm giảm ngưỡng chịu đựng của cơ thể Tuổi thọ và cân nặng càng lớncàng làm tăng khả năng lưu giữ độc tố, cũng có liên quan đến thời gian vàmức độ nghiêm trọng của các triệu chứng nhiễm độc Các hành vi về thể chấthoặc chế độ ăn uống (ví dụ: tập thể dục, uống rượu hoặc uống quá nhiều

caffein) hoặc tiếp xúc lại với độc tố CTX có thể gây tái phát lại các triệuchứng ngộ độc.

1.2 ĐỘC TỐ CİGUATOXİNS

1.2.1 Bản chất, cấu trúc hoá học

Ciguatoxin là các polyether gồm 13 – 14 vòng liên kết với nhau bằngcác liên kết ether tạo thành một cấu trúc bền vững CTX tan trong lipid nênkhi vào cơ thể dễ dàng tấn công vào các màng tế bào, gây ngộ độc nhanhchóng Phân tử CTX tương đối bền nhiệt, không bị phá hủy hay biến tính khichế biến thức ăn Độc tố này không mùi, không vị và thường không thể pháthiện bằng các thử nghiệm đơn giản

CTX trong cá có nhiều đồng phân liên quan chặt chẽ với nhau CTXphân lập từ vùng biển Pacific (P-CTX) được xác định các đặc trưng cấu trúctrước các CTX phân lập từ Caribbean (C-CTX) 02 dạng này có sự khác biệttương đối cả về cấu trúc phân tử và độc tính [2] P-CTX được Scheuer và cs.phân lập đầu tiên từ cá Chình năm 1967 Một thập kỉ sau, Yasumoto vàcs.,1977 đã phát hiện ra nguồn gốc của CTX ở quần đảo Gambier và đặt tên

cho sinh vật sản sinh độc tố là Gambierdiscus toxicus [2].

Cấu trúc chính của P-CTX phân lập từ cá Chình được mô tả hoàn chỉnhnăm 1989 [2] và được gọi là Gambiertoxin 4B hoặc P-CTX-4B (Hình 1.1)

1.2.3 Nguồn gốc và sự tích luỹ sinh học

Những quan sát chi tiết của Randall (1958) về hành vi kiếm ăn của cácloài cá ở Thái bình dương đã đưa ông đến giả thuyết rằng độc tố CTXs do vi

sinh vật sống đáy sản xuất, sau đó được tiêu thụ bởi các loài cá bé và chuyểnqua các loài cá lớn hơn theo chuỗi thức ăn Bọn vi tảo giáp sống đáy thuộc chi

Gambierdiscus xuất hiện ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới Loài tảo này sản sinh CTX và/hoặc tiền chất của CTX (Gambiertoxin).

G toxicus là trọng tâm chính của các nghiên cứu độc tính của CTX trong

nhiều năm, tuy nhiên sau đó, có thêm các nghiên cứu về một số loài

Gambierdiscus mới như G belizeanus [4], G.yasumotoi [5], G pacificus, G australes, G polynesiensis [6] Ngoài sự khác biệt về mức độ độc tính của loài, độc tính của từng chủng Gambierdiscus có thể rất khác nhau và phụ

thuộc vào một số yếu tố môi trường [2]

Tảo giáp dinoflagellate thuộc chi Gambierdiscus xuất hiện ở vùng biển

nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới trên thế giới Loài tảo này sản sinh ciguatoxinvà/hoặc tiền chất của ciguatoxin (gambiertoxin) [3] Các gambiertoxin đượcchuyển từ sinh vật đáy sang các loài ăn thực vật (cá, động vật không xươngsống…) và sau đó đến cá ăn thịt thông qua chuỗi thức ăn biển Độc tố sẽ lớndần theo chuỗi thức ăn Con người khi ăn phải cá ăn thực vật hoặc cá ăn thịt

bị ô nhiễm sẽ gây ra triệu chứng ngộ độc CFP Các yếu tố ảnh hưởng đếnnồng độ CTX tích lũy trong cá bao gồm tốc độ ăn vào, hiệu quả của quá trìnhđồng hóa, mức độ và tính chất của bất kỳ biến đổi sinh học độc tố, tốc độ suygiảm và tốc độ tăng trưởng của cá [7]

Hình 1.3 Mô phỏng chuỗi thức ăn biển [7]

1.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐİ ĐẦU DÒ KHỐİ PHỔ

Hiện nay sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC-MS được sử dụng rộng rãitrong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, môi trường, thực phẩm, vật liệu côngnghiệp và một số mảng khác

1.3.1 Nguyên lý hoạt động

Nhìn chung, sắc ký lỏng LC cho phép tách các thành phần khác nhautrong cùng một mẫu dựa vào sự khác biệt về tính ái lực (lực lưu giữ chất) đốivới pha tĩnh của cột và với pha động, và tùy thuộc vào tính chất của từngthành phần mà phát hiện chúng bởi đầu dò UV, huỳnh quang, độ dẫn điện Bằng cách sử dụng những đầu dò này, việc tiến hành phân tích định tính cáchợp chất chủ yếu dựa trên thời gian lưu, phân tích định lượng dựa vào chiềucao và diện tích đỉnh Phương pháp sắc ký có thể cho phép phân tách xuất sắccác chất; tuy nhiên, việc định danh và định lượng một cách đáng tin cậy sẽgặp khó khăn trong trường hợp có nhiều thành phần rửa giải cùng lúc từ cộtsắc ký cũng như khi phải tiến hành phân tích đồng thời tất cả các chất có mặttrong mẫu

Mặt khác, khối phổ MS là phương pháp phát hiện có độ nhạy cao; đầutiên các loại chất phân tích được ion hóa bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, sau

đó trong chân không các ion phát sinh này được phân loại dựa trên cơ sở tỉ lệ

khối lượng trên điện tích của mỗi ion (tỉ lệ m/z) và sau cùng tiến hành đo

cường độ của chúng Phổ khối lượng thu được cho thấy một mức độ xuất hiệncác ion sao cho mỗi ion đi kèm với một số khối, do đó, MS hỗ trợ rất lớntrong việc phân tích định lượng Số khối thu được trực tiếp từ khối phổ, làmột thông tin đặc trưng cho (từng) phân tử Tuy nhiên, đó là khi các thànhphần trong mẫu được phân tích độc lập với nhau Nếu nhiều chất phân tíchđồng thời được tiêm vào thì việc giải phổ trở nên cực kì khó khăn

LC-MS là một hệ thống thiết bị tập hợp vừa khả năng phân tách chấtxuất sắc của LC và vừa khả năng định lượng xuất sắc của MS Một phổ khốithu được bằng cách sử dụng chế độ quét (scan analysis) sẽ cho biết khốilượng phân tử và thông tin về cấu trúc, trong khi thời gian lưu được cung cấpbởi các đầu dò LC nhằm thực hiện phân tích định tính Ngoài ra, chế độ quétion chọn lọc SIM (Selected Ion Monitoring) sẽ căn cứ vào số khối – là mộtthông số cung cấp độ chọn lọc cao Ngay cả trong trường hợp sự phân táchbằng sắc ký lỏng không đáp ứng đủ, có thể tiến hành phân tích định lượngnhằm tránh ảnh hưởng của tạp chất MS tổng hợp giữa khả năng phân tích đa

dạng các chất cùng với tính chọn lọc nên được đánh giá là đầu dò rất hiệu quảtrong sắc ký lỏng.

Hệ thống phân tích khối phổ kế gồm có bộ phận đưa mẫu vào (như hệthống HPLC, GC…), bộ phận ghép nối giữa bộ phận tiêm mẫu và những bộphận của hệ thống MS, nguồn ion hóa mẫu, các thấu kính tĩnh điện giúp tạo

ion một cách hiệu quả, khối phổ kế phân tách ion theo tỉ lệ m/z và các ion sau

lọc sẽ đi vào đầu dò Căn cứ phương pháp phân tách ion, có nhiều loại khốiphổ kế khác nhau Hệ thống khối phổ có chế độ ion hóa ở áp suất khí quyểnkèm với sử dụng bộ phân tích khối tứ cực (còn gọi là bộ lọc khối tứ cực)thường được dùng như một đầu dò trong sắc ký lỏng ghép cặp khối phổ LC-

MS Một số kỹ thuật ion hóa ở áp suất khí quyển như ion hóa đầu phun điện

tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI),…; và chúng đượcdùng vừa như bộ phận ghép nối với HPLC và vừa như nguồn cung ion Saukhi desolvat hóa, tại đây các ion tạo thành được điều hướng bởi bát cực để dichuyển bộ phân tích khối tứ cực Trong bộ phân tích khối tứ cực, điện thế mộtchiều và xoay chiều RF (radio frequency - tần số vô tuyến) được xen kẽ vào

trên đường di chuyển của các ion, do đó chỉ các ion đáp ứng đúng tỉ lệ m/z lựa

chọn trước mới có thể đi qua các cặp đối diện của các thanh này Số lượng ion

đi đến đầu dò sẽ được chuyển đổi thành tín hiệu và được ghi nhận bởi máy vitính

Hình 1.4 Mô hình hệ thống LC-MS

- Chế độ quét (SCAN)

Khi thao tác với chế độ scan (quét), đầu dò sẽ nhận được tất cả cácmảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trìnhphân tích Chế độ này thường dùng để định danh hay phân tích khi chất phântích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCANthường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ

- Chế độ khảo sát ion chọn lọc (Selected Ion Monitoring – SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ionđặc trưng cho chất cần xác định SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựachọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thưviện có sẵn Chế độ SIM có thể được dùng để định lượng; ví dụ, trong khoảngkhối từ 50 - 300 như trên, mảnh ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ

chọn riêng m/z 150 ra để định lượng Có thể chọn được nhiều ion một lần, và

càng nhiều ion thì càng tốt về độ nhạy và độ chính xác Đối với đầu dò khốiphổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượngphân mảnh khi đã biết ion mẹ

- Chế độ khảo sát ion cô lập (Selected Reaction Monitoring – SRM) và khảo sát đa ion cô lập (Multiple Reaction Monitoring – MRM)

Đối với khối phổ ba tứ cực – máy đo khối phổ hai lần liên tiếp

(MS-MS); 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM vàMRM

SRM là cô lập ion cần chọn để phân mảnh và cô lập 01 mảnh ion concần quan tâm trong các mảnh ion sinh ra, đưa vào đầu dò để phát hiện Thực

tế, do yêu cầu kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quantâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM.Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion côlập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, côlập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò đểphát hiện

1.3.2 Sự kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ

Hệ thống GC-MS là một thành công trong kết hợp các thiết bị phân tíchvới nhau, mặc dù kỹ thuật LC và MS trực tuyến đã được đặt nhiều kì vọngcao, nhưng công dụng của LC-MS chỉ mới được đưa vào thực hiện gần đây

Khối phổ kế là thiết bị trong đó chất cần phân tích được hóa hơi thànhion sau đó được phát hiện ở chân không cao (0,1 Pa > p > 10 - 5 Pa) TrongLC-MS, việc kết nối đơn thuần phần LC với MS sẽ làm cho pha lỏng hóa hơi

và lượng lớn khí được bơm vào hệ thống MS sẽ giảm độ chân không đếnđiểm mà tại đó những ion cần phân tích không thể đến được đầu dò Đối vớisắc ký lỏng, ngay cả với tốc độ dòng 1 mL/phút và phụ thuộc vào loại dungmôi thì việc hóa hơi có thể làm tăng thể tích của dung môi lên 1000 lần, do đósản sinh ra một lượng khí cực lớn Tuy nhiên, lượng pha động có thể bay hơiphải được giới hạn trong LC-MS, nên nhiều loại giao diện ghép nối đượcnghiên cứu và phát triển để xử lý vấn đề này nhưng hiện nay giải pháp nàyvẫn bị hạn chế về độ nhạy, độ bền và sự tiện lợi

1.3.3 Ứng dụng sắc ký khối phổ trong phân tích độc tố Ciguatoxins

Khối lượng phân tử của CTX được xác định bởi phương pháp khối phổ

độ phân giải cao (HR-FABMS) với giá trị của ion [M+H]+ là 1061,6 [8] Vàithập kỷ gần đây, kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phát triển với

ưu điểm vượt trội về lượng rất nhỏ mẫu cần phân tích cấu trúc Kết quảnghiên cứu cho thấy, cấu trúc phân tử của CTX bao gồm nguyên tử carbon,protons (hydrogen) và oxy với đặc trưng của gốc Me (methonin); và hoàntoàn không có mặt proton nitrogen [8] Kỹ thuật ion hóa điện tử (electronionization - EI) và bắn phá nhanh nguyên tử (fast-atom bombardment - FAB)cùng bộ phân tích khối hỗn hợp tứ cực đã được sử dụng để ghi phổ khối của

16 độc tố CTXs ở chế độ ion dương [M+Na]+ và đã xác định cấu trúc hoá họccủa chúng (Bảng 1.1) Kết quả phân tích phổ khối lượng bắn phá nguyên tửnhanh có độ phân giải cao (HR-FABMS), độc tố CTX-4A và -4B có khốilượng phân tử là 1061,6 đ.v.c., cường độ hấp phụ cao nhất ở bước sóng 226

nm (trong dung môi MeOH) [8] Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton NMR) COSY (đo phổ giữa proton của các nguyên tử C kế cận nhau) có thể

(H-phân biệt giữa CTX-4A và -4B bằng sự khác biệt của độ dời hoá học

(chemical shift, ) của proton H-48 [9], [10], [11]

Bảng 1.1 Các độc tố ciguatoxins và ion phân tử tương ứng

phân tích bằng sắc ký khối phổ

Khối phổ được sử dụng để phân tích CTXs cả khi cần xác định đặc tính

và cấu trúc của các đồng phân khác nhau, chủ yếu sử dụng kỹ thuật FAB vàion hoá Lewis và cs.,1994 [24] đã đề cập đến kỹ thuật dùng nguồn sương ion(IS) cho điều tra phổ của độc tố này Rất nhiều nguồn ion được ứng dụng, chủyếu mục đích để xác định khối lượng phân tử và giả phân tử của các ion độc

tố P-CTX-1 với các m/z khác nhau như 1111,8 đối với [M + H]+; 1133,8 đối

với [M + Na]+; 1129,8 đối với [M+H+ H2O]+ và khi đã bị cắt đi lần lượt 05

phân tử nước (m/z 1094; 1076, 1058; 1040 và 1022).

Phân tích khối phổ thu nhận được bằng kỹ thuật IS cung cấp thông tinphổ và các mảnh phổ tương tự như trong kỹ thuật FAB, và có thể phát hiệnđược CTX-1 tinh sạch (tương đương với độ nhạy của HPLC-FLD) Tuynhiên, rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến các ion này khi thử nghiệm phân tíchcác dịch chiết thô từ cá được thêm P-CTX-1 ở nồng độ 1,5 ng/g mẫu ban đầu.Tuy nhiên, đây vẫn được coi là một cách đơn giản, nhạy để kiểm chứng kỹthuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ Khi sử dụng phương pháp này để phân

tích dịch chiết độc tố có độ tinh sạch cao từ ruột Chình biển Lycodontis javanicus gây ngộ độc CFP đã cho phép xác định 14 đồng phân gồm 02 ở m/z

1095,7; 06 ở 1111,6 hoặc 06 ở 1127,7 với ưu thế của P-CTX-1, -2 và -3.Ngoài các ion chính, mỗi đồng phân này lại cho các mảnh ion [M+NH4]+ và[M+Na]+ Ở đây, cũng ghi nhận là hệ dung môi MeCN:H2O bổ sung 1 nMammonium acetate cho kết quả tốt hơn so với bổ sung 0,1% TFA, và sử dụngbơm hỗ trợ hệ HPLC-MS sẽ giúp tín hiệu ghi nhận tăng gấp 20 lần so vớiHPLC-MS truyền thống [13] Thành công chứng minh được đặc tính phânmảnh này vô cùng hữu hiệu để xác định các đồng phân mới của độc tố CTXs

Trong một công bố khác, HPLC-MS được ứng dụng để xác định đặctính của 12 đồng phân C-CTXs trong dịch chiết tinh sạch của loài cá Vẩu

Caranx latus [25] Trong trường hợp này, bơm cao áp HP 3300 được kết nối

với đầu dò tứ cực API Qstar Pulsar (PE-Sciex) Ion tương ứng với [M+NH4]+,[M+H]+ và [M+H-H2O]+ và [M+H-2H2O]+ được ghi nhận với cường độ nhấtkhi formic acid được bổ sung vào dung dịch đệm Ngược lại, khi dùng TFA,hầu như thiếu vắng có mặt của phân tử ion [M+NH4]+ Ngoài ra, formic acidluôn cải thiện đường nền và khối phổ thu nhận được cao gấp 5 lần so vớiTFA Kỹ thuật phân tách pha đảo trở nên hiệu quả hơn trên cột sắc ký ZorbaxC3 (2,1 × 150 mm, Agilent) so với cột Aquapore C18 RP 300 (1 × 50 mm),đặc biệt là có thể phân tách được các đồng phân gần nhau Với chế độ sắc kýthay đổi nồng độ pha động (gradient) là hệ dung môi MeCN:H2O khi có vàkhông có mặt formic acid 0,1%; đã xác định được 05 đồng phân CTXs mới ở

m/z của [M+H]+ lần lượt là 1159,6; 1143,6; 1157,6; 1127,6; và một loạt dẫn

xuất và C-CTX-1 mà trước đây chưa bao giờ được ghi nhận

I-CTXs đầu tiên được xác định bởi Hamilton và cs [26] trong cá Hồng

đốm bạc Lutjanus bohar và Lutjanus sebae và kiểm chứng bằng HPLC-MS

tương tự như phương pháp phân tích C-CTXs [25] có một số thay đổi ở điềukiện sắc ký Quá trình phân tách được thay đổi sang chế độ đẳng dòng trên cộtsắc ký Zorbax 300SB (2,1×150 mm; 3,5 μm, Agilent) với hệ pha độngMeCN:H2O:isopropanol (80:19:1 về thể tích) có 5 μM ammonium acetatehoặc 0,1% formic acid Kết quả, ion phân tử của I-CTX thu được hoàn toàn

tương đồng với ion phân tử của C-CTX ở m/z 1141,6; mặc dù thành phần/tỉ lệ

của các phân tử và ion phân tử có khác biệt với ưu thế của giả ion phân tử[M+H-H2O]+ trong các dẫn xuất I-CTXs Sau đó, đã phát hiện thêm 03 đồngphân khác là I-CTX-2, -3 và -4 I-CTX-1 và -2 có khối phổ hoàn toàn giống

C-CTX-1 trong loài cá Hồng L bohar.

Tiếp theo, Lewis và cs công bố kết quả ghép nối giữa HPLC với khốiphổ kép tandem mass spectrometry (MS/MS) [27] Khi phân tích CTX tinhsạch với pha động 50% MeCN có 0,1% TFA, sản phẩm ion của MRM đượctối ưu cho mất đi gốc -NH3 từ phân tử ion [M+NH4]+, sau đó tiếp tục mất đi

03 phân tử H2O và đã thu nhận các mảnh khối phổ với m/z lần lượt 1128,7 >1094,0/1076,0/1058,0 (P-CTX-1); và 1158,6 > 1123,6/1105,6 (C-CTX-1).Phương pháp này cho đường chuẩn trong khoảng làm việc và cải thiện độnhạy rất nhiều LOD 0,04 và 0,1 ng/g đối với P-CTX-1 và C-CTX-1 Quá trìnhsắc ký được thực hiện trên cột pha đảo Vydac (2,1 × 250 mm, 5 μm;Separation Group) với dịch giải cột là MeCN:H2O có bổ sung 0,05% TFA

Hệ sắc ký lỏng 1100 Agilent kết nối với 4000 QTRAP hybrid massspectrometer (Applied Biosystems) được thử nghiệm để kiểm chứng P-CTX-1

và C-CTX-1 trên cơ sở khối phổ và thời gian lưu đối chiếu với độc tố chuẩn

và đã phát hiện được độc tố một cách đặc hiệu [2] Đối với C-CTX-1, 03 quátrình chuyển tiếp MRM được chọn lọc với giả phân tử ion [M+H-H2O]+ đóng

vai trò ion tiền thân (m/z: 1123,5 > 1105,6/1087,6/1069,6) Đối với P-CTX-1,

02 nhóm chuyển tiếp được giám sát với sự có mặt của tín hiệu phản hồi

Trước tiên, coi phân tử ion [M+H]+ là chất tiền thân (m/z: 1111,6 >

1093,6/1075,6/1057,6), sau đó dựa vào mảnh ion [M+NH4]+ (m/z: 1128,6 >

1093,6/1075,6/1057,6) Chế độ sắc ký được thực hiện trên cột pha đảo LunaC8 (2) (2,0 × 150 mm, 5 μm; Phenomenex) và chương trình sắc ký thay đổinồng độ của pha động MeCN:H2O có 0,1% formic acid

Gần đây, phương pháp HPLC/MS-MS cải tiến được công bố bởi Lewis

và cs [28] với phương pháp tách chiết nhanh từ 2 g mẫu thịt cá ban đầu vớigiới hạn định lượng là 0,1 ng/g – hoàn toàn có thể ứng dụng phân tích cácmẫu cá gây ngộ độc CFP từ biển Thái bình dương Ở quy trình này, chế độsắc ký được thực hiện trên cột Luna C18 (2.1 × 250 mm, 5 μm; Phenomenex)với chương trình thay đổi nồng độ pha động 95% MeCN:H2O có 2 mMammonium formate và 0,1% formic acid Hệ khối phổ kép 3 tứ cực (triplequadrupole) API 4000 QTRAP (Applied Biosystems) với cặp chuyển đổiMRM đối với P-CTX-1 trên cơ sở sự phân mảnh của giả ion phân tử[M+NH4]+ sau khi lần lượt mất đi nhóm chức -NH3 và các phân tử H2O (m/z:

1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7)

Ngay sau đó, Stewart và cs đã công bố phương pháp cải tiến nhằm táchchiết nhanh và phân tích HPLC/MS-MS các độc tố P-CTX-1, -2 và -3 trongmẫu cá nghi ngờ gây ngộ độc CFP [29] Chế độ sắc ký được thực hiện trênthiết bị Prominence LC (Shimadzu Corp.) gắn cột Gemini C6-phenyl (2,0 ×

50 mm; Phenomenex) và AB/Sciex API4000Q (AB/MSD Sciex) Hệ dungmôi pha động Acetonitrile:H2O thay đổi dòng với cải tiến bằng cách có mặtcủa 2 mM ammonium acetate và 0,1% formic acid Chế độ sang lọc nhiều ion(MRM) tương tự như Lewis và cs [28], với khoảng phổ để xác định CTX-2 và

-3 (m/z: 1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7 (P-CTX1); 1112,7 >

1077,6/1059,6/1041,6 (P-CTX-2 và -3)

Hình 1.5 Khối phổ và thời gian lưu

của 16 dẫn xuất CTXs [30]

Nhìn chung, HPLC-MS và HPLC/MS-MS đã được chứng minh hiệuquả trong định danh và xác định đặc tính các đồng phân độc tố CTXs trêntoàn thế giới Hơn nữa, sự cải tiến các thiết bị phân tích đã nâng cao độ nhạy

và độ chọn lọc do đo lường được chính xác phổ hoặc chuỗi các mảnh ion contheo đặc tính từng mảnh

Tuy nhiên, xét về tiêu chí an toàn thực phẩm (0,01 ng/g và 0,1 ng/g đốivới P-CTXs và C-CTXs), HPLC-MS vẫn bị hạn chế khi cần kết quả địnhlượng chính xác từ những mẫu có kết quả rất gần với giới hạn này Cải tiếnthiết bị phân tích và quy trình chuẩn bị mẫu trước khi phân tích sẽ khắc phụcđược khó khăn do một số tạp chất trong mẫu cá làm giảm LOD và LOQ

Kỹ thuật ion hóa

Trong khi các nghiên cứu nhằm tìm hiểu tính chất đặc điểm phổ khốicủa các độc tố nhóm CTXs có thể sử dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau vớicác loại nguồn ion khác nhau, các nghiên cứu nhằm định tính, định lượngnhững độc tố này trong cá sử dụng phổ biến nhất là ESI Với đặc điểm là kỹ

thuật ion hóa “mềm”, phổ ESI-MS thường cho các pic có cường độ lớn tươngứng với những ion sơ cấp giữ nguyên cấu trúc nguyên bản của đối tượng phântích (chẳng hạn như ion [M-H]– ở chế độ ion âm hay ion [M+Na]+ ở chế độion dương), tạo điều kiện thuận lợi cho việc bắn phá tiếp để tạo ra các ion thứcấp đặc trưng khi phân tích MS/MS ở chế độ MRM nhằm nâng cao độ đặchiệu của phương pháp Vì vậy, với kỹ thuật ESI-MS/MS được dùng rất phổbiến để phân tích các độc tố nhóm CTXs ở cả chế độ ion âm và ion dương [1].Các điều kiện cụ thể của bộ nguồn ESI được công bố dao động tùy thuộc vàothiết bị LC/MS-MS cụ thể được sử dụng để xây dựng phương pháp.

Lựa chọn phân tích khối

Các phương pháp sử dụng đầu dò khối phổ, nhất là khối phổ hai lần, đã

và đang được sử dụng ngày càng phổ biến để phân tích đồng thời cả định tính

và định lượng độc tố nhóm CTXs Theo yêu cầu về độ tin cậy, một phươngpháp phân tích bằng khối phổ hai lần (MS/MS) được chấp nhận là đủ đặc hiệukhi đối tượng nghiên cứu được định danh ít nhất bằng 4 điểm định danh(identification point - IP) trong đó 1 ion sơ cấp được tính 1 IP, một ion thứcấp được tính 1,5 IP, và tỷ lệ cường độ các peak thu được từ các ion thứ cấpcủa mẫu thử phải nằm trong khoảng dao động cho phép so với tỷ lệ này củachuẩn phân tích trong cùng điều kiện và thời điểm Như vậy, để đáp ứng cácyêu cầu về độ tin cậy kể trên, các phương pháp phân tích độc tố nhóm CTXsbằng LC/MS-MS đều sử dụng tối thiểu 1 ion sơ cấp, tối thiểu 2 ion thứ cấpcủa các độc tố này khi phân tích, trong đó cường độ 1 ion thứ cấp được dùnglàm đáp ứng để tính toán kết quả định lượng, ion sơ cấp và ion thứ cấp còn lạicung cấp thông tin định tính và đảm bảo độ đặc hiệu Chế độ ion dương vớinguồn ion hoá phun điện tử (ESI+) được áp dụng để định tính và định lượng

CTXs, trong đó các ion thứ cấp m/z từ [M+NH4]+ sau khi lần lượt mất đinhóm chức -NH3 và các phân tử H2O (m/z: 1128,7 > 1093,7/1075,7/1057,7)được dùng để định tính độc tố này

Như vậy, cho tới nay, chế độ ion dương là chế độ được áp dụng phổbiến để định danh riêng từng độc tố bằng cách so sánh với chất chuẩn, kết hợpthời gian lưu với các thông tin phân tích MS/MS Tuy nhiên, với đặc trưng là

một kỹ thuật phân tích phổ phức tạp, có nhiều thông số phải tối ưu hóa, vớimỗi thiết bị LC-MS cụ thể sẽ cần phải thực hiện lại việc khảo sát tối ưu hóacác điều kiện phù hợp với đặc điểm kỹ thuật nội tại của thiết bị để có được kếtquả phân tích tốt nhất.

Điều kiện sắc ký

Trong các nghiên cứu phân tích độc tố CTXs bằng LC/MS-MS, phatĩnh sử dụng chủ yếu là cột pha đảo C18

Chủ yếu sử dụng pha động với 2 thành phần dung môi chính là MeCN

và H2O ở 2 vùng pH: pha động có pH acid và pha động có pH kiềm

+ Thành phần của pha động có pH kiềm thường là hỗn hợp MeCN

-H2O có chứa amoniac Tỷ lệ amoniac trong pha động được duy trì cố định ởmột mức nhất định: 0,05 % (tt/tt) [31], 6,7 mM [32], [33] Ngoài ra, pha động

ở pH kiềm còn sử dụng amoni bicarbonat được chỉnh pH về khoảng 11 bằng amoniac [34]

+ Thành phần pha động ở vùng pH acid là hỗn hợp ACN - H2O có chứaacid formic và amoni format [31] hoặc chỉ chứa acid formic [33], [35] Cácpha động có thành phần dung môi MeCN - H2O được sử dụng ở cả chế độ rửagiải gradient và rửa giải đẳng dòng

Nhận xét:

- Dung môi phổ biến dùng để chiết độc tố CTXs là Acetone

- Chương trình sắc ký để tách độc tố nhóm CTXs là sắc ký pha đảo với pha tĩnh hay sử dụng là C18

- Kỹ thuật khối phổ 2 lần cho LOD thấp với độ nhạy của phương pháprất cao (đơn vị ppb) [1] Đây là một ưu điểm nổi trội của phương phápLC/MS-MS so với các phương pháp trước đây trong xác định độc tố CTXs cómặt trong mẫu cá

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng: Tổng số 14 cá thể cá Chình thu mua tại một số vùng biểnmiền Trung Việt Nam bao gồm Lý Sơn (Quảng Ngãi), Trường Sa (KhánhHoà) Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm tại Viện Hải dương họctrong điều kiện bảo quản bằng đá lạnh với thời gian sớm nhất

Tại phòng thí nghiệm, mẫu được rửa sạch, định danh khoa học, sau đó

cá tách thành 02 phần (cơ, gan), bảo quản trong các túi plastic riêng ở điềukiện -20°C cho đến khi sử dụng thí nghiệm..

Thiết bị bảo quản mẫu: Tủ lạnh sâu MDF-549-PB (Panasonic, Nhật)

Bảng 2.1 Định danh và ký hiệu mẫu

2.2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.2.1.1 Dung môi, hóa chất

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích dành cho LC/MS-MS

- Methanol (Wako, code: 131-01826, độ tinh khiết: 99,8%)

- Acetone (Wako, code: 016-00346, độ tinh khiết: 99,5%)

- Diethyl ether (Wako, code: 055-01155, độ tinh khiết: 99,5%)

- Hexan (Wako, code: 085-00416, độ tinh khiết: 96%)

- Acetone nitril (Wako, code: 014-00386, độ tinh khiết: 99,5%)

- Ethyl acetate (Wako, code: 051-00356, độ tinh khiết: 99,5%

- Amonium formate (Wako, code: 014-03125)

- Formic acid (Wako, code: 063-04192, độ tinh khiết: 99 %)

- Nước trao đổi ion (Hệ thống máy khử ion nước cất Ultral Clear GP

- Máy ly tâm lạnh Mikko (Hermle, Đức, code: 58080029)

- Cân phân tích Sartorius CP224S (Sartorius, Thụy Sĩ) với d = 10-4 g

- Thiết bị đồng nhất mẫu Ika T10 (Ika, Đức)

- Máy lắc xoáy, Ika Vortex 2 (Ika, Đức)

Ngoài ra, còn các thiết bị phụ trợ khác bao gồm nồi cách thủy, máy lọcnước trao đổi ion, hệ thống cô quay chân không, tủ âm sâu bảo quản mẫu…thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về “ATTP

và môi trường (khu vực Miền Trung)” tại Viện Hải dương học