Xác định Rhodamine B thực phẩm kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao HPLC sử dụng detector UV Trần Thị Thanh Nga Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Hóa học Chun ngành: Hóa Phân tích; Mã số: 60 44 29 Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Luận Năm báo vệ: 2011 Abstract Tổng quan số vấn đề Rhodamine B công thức cấu tạo, tính chất vật lý, tính chất sinh học, ứng dụng, phương pháp xác định Rhodamine B Chọn điều kiện phù hợp cho việc xác định Rhodamine B có mẫu thực phẩm kĩ thuật HPLC sử dụng detector UV- Vis Đánh giá phương pháp phân tích khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại Chọn quy trình phân tích khảo sát dung môi chiết tách loại thực phẩm Đã tiến hành xác định hàm lượng Rhodamine B mẫu thực phẩm: hạt dưa, bánh xu xê, siro dâu, nước hương dâu quy trình tối ưu tìm Keywords Phẩm màu cơng nghiệp; Rhodamine B; Hóa phân tích; Thực phẩm; Kỹ thuật sắc ký Content: Khi xã hội ngày phát triển vấn đề sức khoẻ người ngày trọng, vấn đề an tồn thực phẩm vệ sinh mơi trường đặt lên hàng đầu có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người, vấn đề đáng quan tâm khu chế biến, sản xuât xuất nhập thực phẩm Sự tồn dư chất độc hại có thực phẩm vấn đề đáng lo ngại người tiêu dùng Ngày với phát triển khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích mới, đại áp dụng nhiều lĩnh vực khác đặc biệt đánh giá, kiểm định chất gây độc thực phẩm Trong trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp, bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp Phẩm màu cơng nghiệp nói chung, Rhodamine B nói riêng độc hại, bị cấm sử dụng thực phẩm khó phân huỷ Tuỳ thể mà ảnh hưởng đến gan, thận tồn dư lâu ngày gây độc hại đến thể người, đặc biệt gây ung thư Phẩm màu thực phẩm tự nhiên có độ bền hơn, lại đắt phẩm màu công nghiệp Do nhiều người kinh doanh lạm dụng phẩm màu công nghiệp dù chất từ lâu bị cấm sử dụng Vì việc nghiên cứu xác định hàm lượng Rhodamine B- thành phần phẩm nhuộm thực phẩm vấn đề cần thiết sức khoẻ cộng đồng Tuy nhiên, ngồi có mặt Rhodamine B cịn có thành phần hố học khác có phẩm nhuộm Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưu để xác định Rhodamine B sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đây phương pháp ứng dụng nhiều nhiều năm gần Nó áp dụng để tách nhận dạng xác định hàng loạt hợp chất mà số phương pháp trước gặp nhiều khó khăn hợp chất khơng bền với nhiệt, hợp chất có tính chất hố học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm mà phương pháp khác khơng có như: xác định đồng thời nhiều chất, tốn mẫu, thao tác đơn giản,… Trong phân tích phương pháp HPLC có hai loại cột tách thường sử dụng cột trao đổi ion cột tách pha đảo Trong luận văn này, tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình tách xác định hàm lượng Rhodamine B số mẫu thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detetor UV- VIS Phương pháp có độ [Type text] chọn lọc cao, độ nhạy tốt trang bị nhiều sở kiểm nghiệm nước ta, có tính khả thi tính ứng dụng thực tế cao Phân tích số mẫu thực phẩm hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm lượng Rhodamine B mẫu thực phẩm Dựa kết nghiên cứu phân tích hàm lượng Rhodamine B mẫu thực phẩm mà đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm sở sản xuất Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét Rhodamine B 1.1.1 Công thức cấu tạo Rhodamine B hợp chất hóa học, thành phần phẩm màu công nghiệp Công thức phân tử C28H31ClN2O3 Phân tử khối 479,02g/mol Công thức cấu tạo Rhodamine B [9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride Tính chất vật lý Rhodamin B tinh thể màu tối có ánh xanh hay dạng bột màu nâu đỏ Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 2110C Rhodamine B thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l) Độ hoà tan 100 gam dung môi: nước 0,78 gam (260C),rượu etylic 1,74 gam Dung dịch nước rượu etylic có màu đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ dung dịch loãng Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có  = 526 517 nm 1.1.2 Tính chất sinh học Rhodamine B gây độc cấp mãn tính Qua tiếp xúc, gây dị ứng làm mẩn ngứa da, mắt, Qua đường hơ hấp, gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực Qua đường tiêu hóa, gây nơn mửa, có hại cho gan thận Nếu tích tụ dần thể gây nhiều tác hại gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh gây ung thư [19,23 ] Thực nghiệm chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống tiêm vào tĩnh mạch [23], Rhodamine B vào thể chuyển hóa thành amin thơm tương ứng có phần độc hại loại Rhodamine B thường, gây ung thư phát triển khối u dầy, Rhodamine B dẫn xuất tác động mạnh mẽ đến q trình sinh hóa tế bào gây ung thư gan, gan [Type text] quan tạng lọc chất Rhodamine B [31] Một số thực nghiệm khác cho thấy Rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN nhiễm sắc thể đưa vào nuôi cấy tế bào [26,21] 1.1.3 Ứng dụng Rhodamine B thường sử dụng thuốc nhuộm tracer nước để xác định tốc độ hướng dòng chảy vận chuyển [24] Được sử dụng rộng rãi ứng dụng công nghệ sinh học kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang [24] Rhodamine B thử nghiệm để sử dụng bio maker vacxin bệnh dại cho động vật hoang dã, gấu trúc, để xác định động vật hoang dã có thuốc phịng ngừa cách cho Rhodamine B vào râu động vật.[24] Nó trộn vào thuốc diệt cỏ Ngoài Rhodamine B sử dụng để tạo mầu nhuộm mầu cơng nghiệp sợi, nhuộm màu phịng thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào tính bền mầu [25] Rhodamine B sử dụng sinh học thuốc nhuộm huỳnh quang Tận dụng đặc tính phát quang Rhodamine B, người ta dùng chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên ớt, lấy dầu, Rhodamine B thấm vào ớt dính dầu máy ép ớt, phơi ớt sàn sơn gây lây nhiễm chất nhuộm Ủy ban Gia vị khuyến cáo khơng đựng túi cói nhuộm màu nghi ngại chất nhuộm thẩm lậu vào sản phẩm[25] Mặt khác đường thâm nhập hóa chất vào sản phẩm trồng không để ý đến từ trước đến chúng lại diễn nhiều nước phát triển Ngoài ra, không với ớt bột hay chất gia vị nói chung, chất tạo mầu Rhodamine B có nguy xuất hầu hết sản phẩm lương thực, thực phẩm từ trồng có dùng phân bón hóa học[25] 1.2 Các phƣơng pháp xác định Rhodamine B 1.2.1 Các phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký cổ điển (phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc ký mỏng- TLC) Phương pháp đơn giản không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để kiểm tra đánh giá sơ chất phân tích Phương pháp có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu song song lúc tiện lợi Khi TLC trang bị phần phát máy đo quang phân tích định tính định lượng [27,28] Trong phương pháp này, người ta hòa tan Rhodamine B chuẩn ethanol tuyệt đối để thu dung dịch có nồng độ khoảng 10g/ml Rồi tiến hành xác định định tính điều kiện sắc ký sử dụng mỏng silicagel 60F254, hoạt hóa 1100C 30 phút Pha động sử dụng gồm hai hệ: Hệ 1: CHCl3- MeOH- H2O (65: 35: 10), lấy lớp dưới; Hệ 2: EA- MeOH- H2O (100: 17: 13) Phát vết cách quan sát vết ánh sáng thường soi đèn tử ngoại, bước sóng 366nm So sánh vị trí màu sắc vết sắc ký đồ dung dịch thử với vết mẫu Rhodamine B sắc ký đồ dung dịch chuẩn để đánh giá kết [28] 1.2.1.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trong năm gần đây, phương pháp HPLC đóng vai trị vơ quan trọng việc tách phân tích chất lĩnh vực khác nhau, lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nơng hố, hố dầu, hố học hợp chất thiên nhiên, loại chất có tác dụng độc hại, phân tích mơi trường,…đặc biệt tách phân tích lượng vết chất Trên giới, phương pháp HPLC sử dụng rộng rãi để xác định Rhodamine B thực phẩm loại mẫu khác nhau, ưu so với phương pháp khác có độ xác, độ nhạy độ lặp lại cao… [Type text] Detector ghép nối máy HPLC cho phép phát xuất chất sau rửa giải Ngày có nhiều loại detector sử dụng cho mục đích mở rộng khả phát nhiều loại chất phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) tách phân tích chất đối tượng phức tạp Cịn thông dụng người ta dùng detector UV-Vis hay detector huỳnh quang Dùng detector UV-Vis xác định nhiều loại chất, detector huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc tương tác hợp chất có mẫu Ngồi cịn dùng số detector khác detector diode array (DAD), detector điện hoá,[18]… detector thường ứng dụng để phân tích chất có phẩm nhuộm 1.2.1.3 Ngun tắc chung trang bị phƣơng pháp HPLC Sắc ký lỏng kỹ thuật tách chất dựa tổ hợp nhiều q trình vừa có tính chất hố học lại vừa có tính chất lý học Nó cân động xảy cột sắc ký pha tĩnh pha động, vận chuyển phân bố lại liên tục chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo lớp chất cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách Trong q trình chất tan luôn phân bố lại hai pha, pha động chảy liên tục qua cột tách với thành phần pha động định, hay gradient Nghĩa phân tử chất tan, q trình sắc ký, ln chuyển từ pha sang pha nhiều lần từ dầu cột đên cuối cột sắc ký Mặt khác, cấu trúc tính chất phân tử chất tan khác nên tốc độ dịch chuyển trung bình chất tan khác Khi pha động, chuyển dịch theo tốc độ dịng pha động, cịn pha tĩnh lại khơng dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại Như có khoảng thời gian định chất tan bị giữ lại cột tách sắc ký, thời gian phụ thuộc vào chất sắc ký cột pha tĩnh, tính chất cấu trúc chất tan khác đồng thời phụ thuộc vào chất thành phần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan bị lưu giữ, điều dẫn đến kết là, có trình tách chất xảy cột sắc ký [6] Q trình tách chất xảy theo ba chế sau:  Tương tác hấp thụ  Tương tác trao đổi ion  Tương tác theo chế rây phân tử Tương ứng với ba chế có ba phương pháp tiến hành tách khác  Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP- HPLC hấp phụ pha ngược RP- HPLC)  Sắc ký trao đổi ion (EX- HPLC)  Sắc ký rây phân tử (Gel- HPLC) Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) kỹ thuật tách chất xảy q trình chất tan chuyển dịch cột tách có chứa chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác phụ thuộc vào hệ số phân bố Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu tách sắc ký tốt Thành phần pha động thay đổi để đạt lực rửa giải phù hợp Sau chất tan chuyển tới cuối cột tách chuyển tới detector để phát Tuỳ thuộc vào chất chất tan mà dùng loại detector khác [6] 1.2.2 Các kết nghiên cứu Rhodamine B phƣơng pháp HPLC Trên giới có số cơng trình nghiên cứu để xác định Rhodamine B Theo Carcinogen Pesticide Branch [15], phịng thí nghiệm hóa phân tích OSHA, thành phố Salt Lake, Utah, làm thí nghiệm tách Rhodamine B phương pháp HPLC, sử dụng detector huỳnh quang với điều kiện sau: [Type text] Cột tách: hypersil ODS, 100mm x 2,1mm, 5m Nhiệt độ: 400C Pha động: 85% axetonitrile, 15% nước với 0,005M axit 1- heptansunfonic, điều chỉnh pH tới 3,5 axit H3PO4 Tốc độ dịng: 0,2ml/phút Bước sóng: 556nm Vòng mẫu: 1,0l Với điều kiện mẫu Rhodamine B phát 4,5 phút Theo R.W Mason L.R.Edwards [22], phân tích Rhodamine B huyết tương thỏ người, sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu DR-3 với detector huỳnh quang với điều kiện: Cột tách: Bondapak CN (25mm x 4,6mm) Pha động: axetonitril nước (35: 65 40: 60) chứa 0,1% axit orthophotphoric Tốc độ dòng: 1,8ml/phút Nhiệt độ cột: 18  20C Mẫu huyết tương: 0,5ml huyết tương pha loãng 0,5ml 0,05M Kalidihidrogen photphat, pH= 5,5, chiết 5ml etylaxetat Kết phân tích: Rhodamine B phát 9,7 phút Mẫu huyết tương đem phân tích có chứa từ 25 đến 50 ng/ml [27] Rhodamine B mỹ phẩm phân tích L Gagliardi, D De Orsi, G Multari, D Tonelli [18] Các điều kiện phân tích thực sau: Cột tách: C- 18 Pha động: Axetonitril nước chứa 0,1M natri perclorat với thành phần thay đổi tỷ lệ từ 50: 50 đến 70: 30 Mẫu phân tích pha metanol nước với tỷ lệ 8: Kết phân tích mẫu thực cho thấy dung dịch chứa 0,3g/ml Rhodamine B, pic xuất 9,15 phút [18] Tác giả J.W.Hofstraat cộng ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn sắc ký lỏng hiệu cao với detector huỳnh quang để xác định Rhodamine B nước bề mặt Giới hạn phát phương pháp 10 pg/l [18] Tại Việt Nam, viện kiểm nghiệm thuốc trung ương [1] tiến hành phân tích Rhodamine B mẫu dược liệu Các điều kiện sắc ký thực sau: Cột tách: RP- C18 (5m, 4,6mm x 250mm) Pha động: 50% Axetonitril- 50% đệm kalidihidrophotphat 20mM- trietylamin (100: 0,3), điều chỉnh pH tới 3,0 axit photphoric Tốc độ dịng: 1,4ml/phút Detector UV-Vis Bước sóng 525nm Lượng tiêm: 20l Kết phân tích cho thấy dược liệu có chứa Rhodamine B[1] Tháng năm 2011, Việt Nam đề xuất TCVN 8670-2011 việc xác định Rhodamine B HPLC [11] sở viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia xây dựng thực nghiệm cho số loại thực phẩm có nhuộm màu 1.2.3 Phƣơng pháp UV- Vis xác định Rhodamine B Để xác định Rhodamine B, người ta sử dụng phương pháp UV- Vis Lấy mẫu chất đem hồ tan dung mơi thích hợp, lắc, rung siêu âm chiết lấy dung dịch Đem dung dịch chiết đo máy UV- Vis, dựa vào cực đại hấp thụ ta xác định mẫu chất có chứa Rhodamine B hay khơng [13, 17] 10 [Type text] Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.2 Phân tích định lƣợng HPLC Trong điều kiện phân tích chọn, đại lượng đặc trưng cho chất thời gian lưu tRi chất cột tách Chúng ta dựa vào thời gian lưu để định tính chất thơng qua mẫu chuẩn Sau dựa vào tín hiệu phân tích thu (chiều cao pic diện tích pic) để định lượng chất Thông thường phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic diện tích H= k.Cb S= k Cb Trong đó: H chiều cao pic sắc ký chất S diện tích pic sắc ký chất k số điều kiện thực nghiệm tách sắc ký 11 b- số chất, nhận giá trị vùng: < b  Ở vùng nồng độ nhỏ b= 1, mối quan hệ H(S) với C tuyến tính: H= k1.C = f(C) S= k2.C =f(C) Sử dụng quan hệ xác định nồng độ chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn Dùng phương pháp đường chuẩn nhanh, đơn giản Còn thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần xác định nhỏ người ta dùng phương pháp thêm chuẩn 2.3 Giới thiệu chung phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng 2.4 Hoá chất dụng cụ nghiên cứu 2.4.1 Hoá chất Các loại hoá chất dùng phương pháp thuộc loại tinh khiết phân tích HPLC CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 3.1.1 Chọn thể tích vịng mẫu (sample loop) Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý mẫu ban đầu nạp vào vịng chứa mẫu tích định xilanh áp suất bình thường, sau nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu dịng pha động nạp vào cột tách Độ xác, độ lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách phụ thuộc vào thiết kế van bơm mẫu mà phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào cột 3.1.2 Chọn bƣớc sóng detector Việc chọn bước sóng đo phát chất quan trọng định trực tiếp tới độ nhạy phép phân tích Vì phương pháp nghiên cứu lựa chọn HPLC ghép nối detector UV- Vis, detector cố định bước sóng 12 [Type text] phải tiến hành khảo sát điều kiện để chọn bước sóng phù hợp cho phân tích chất Tiến hành ghi phổ hấp thụ quang Rhodamine B vùng Vis máy UV-Vis 8453 thu cực đại hấp thụ 526 nm 572 nm Chúng tiến hành ghi phổ hấp thụ ánh sáng vùng Vis máy UVVis 8453 với dung dịch chuẩn Rhodamine B pha thành phần dung môi khác nhau:  Rhodamine B 1ppm 100% nước 3.2 Chọn pha tĩnh Pha tĩnh yếu tố quan trọng định tới hiệu tách Bản chất pha tĩnh định chế tách khả lưu giữ chất tan Tùy theo chất chất phân tích mà chọn loại pha tĩnh, kích thước hạt nhồi, chiều dài cột cho phù hợp trình sắc ký Hệ pha ngược ứng dụng phổ biến độ ổn định, độ lặp lại khả tách nhiều loại chất Ngồi dung mơi sử dụng cho pha ngược có tính kinh tế Để nghiên cứu tách xác định hàm lượng Rhodamine B, chất có tính phân cực chủ yếu cơng trình nghiên cứu cơng bố sử dụng cột tách chứa chất nhồi pha đảo RP- C18, RP- C8,… 3.3 Tối ƣu hóa pha động 3.3.1 Ảnh hƣởng thành phần pha động tới khả tách sắc ký Tỷ lệ thành phần dung môi tạo pha động có ảnh hưởng đến q trình rửa giải chất mẫu khỏi cột tách Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi lực rửa giải pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu chất phân tích, làm thay đổi hệ số dung lượng chất phân tích 13 Do đó, để có thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát tỷ lệ khác với thành phần pha động lựa chọn gồm: Pha động thứ nhất: Dung dịch đệm có pH=3 dung mơi hữu methanol (MeOH), thay đổi tỷ lệ pha động: 60%MeOH- 40% H2O; 65%MeOH- 35% H2O; 70%MeOH- 30% H2O; 75%MeOH- 25% H2O; 80%MeOH- 20% H2O; 85%MeOH- 15% H2O; 90%MeOH- 10% H2O; 95%MeOH- 5% H2O; 100%MeOH- 0% H2O 3.3.1.1 Pha động thứ 3.3.1.2 Pha động thứ hai 3.3.2.1 Pha động gồm 70% MeOH- 30% đệm 3.3.3 Ảnh hƣởng chất phụ 3.3.3.1 Ảnh hƣởng trietylamin hệ pha động gồm MeOH đệm 3.3.4 Khảo sát tốc độ pha động Cùng với yếu tố thành phần pha động, tốc độ pha động chạy sắc ký ảnh hưởng khơng đến kết tách sắc ký Tốc độ pha động yếu tố định đến trình rửa giải chất cột sắc ký ảnh hưởng đến q trình thiết lập cân chất tan hai pha tĩnh pha động Tốc độ pha động nhỏ gây tượng dỗng píc, thời gian rửa giải chất lớn làm giảm tính kinh tế phương pháp Nhưng tốc độ pha động lớn làm cho chất mẫu không kịp tách khỏi nhau, dẫn đến tượng dỗng pic Vì cần lựa chọn tốc độ pha phù hợp 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.4.1 Tổng kết điều kiện chọn 3.4.2 Khảo sát lập đƣờng chuẩn khoảng nồng độ 0,01- 2,00ppm 14 [Type text] Để so sánh, chúng tơi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính phép đo với điều kiện sau 3.4.3 Giới hạn phát (limit of detection- LOD) Giới hạn phát nồng độ thấp chất phân tích mà phương pháp phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền, hay píc sắc ký chất phân tích phải có chiều cao H thoả mãn: H  x n Trong đó: H chiều cao pic n độ lệch chuẩn tín hiệu Từ xác định giới hạn phát theo hai phương pháp sau: 3.4.4 Giới hạn định lƣợng (limit of quanlity- LOQ) Giới hạn định lượng nồng độ thấp (x Q) chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu (blank or background) LOQ = 10 x SB/b Trong đó: b hệ số góc phương trình hồi quy SB độ lệch chuẩn mẫu trắng, xác định theo phương trình hồi quy Như theo phương trình hồi quy ta có: LOQ= 0,0502 g/ml 3.4.5 Độ phép đo 15 Độ xác phép đo đánh giá thông qua phần trăm sai số Chọn mẫu phân tích có nồng độ điểm đầu, cuối khoảng tuyến tính khảo sát Chúng tơi tiến hành chuẩn bị mẫu chuẩn có nồng độ 0,1ppm; 0,5ppm; 1,0ppm tiến hành chạy sắc ký, mẫu chạy lặp lần Phần trăm sai số tính theo cơng thức sau: %X  Si  St x100 St Trong đó: Si diện tích tính từ đường chuẩn St diện tích theo sắc đồ Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn với điều kiện sắc ký với nồng độ khác Pha tĩnh: RP- C8 (4,6x150 mm, 5m) Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 0,007M natri heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm Kết thu mẫu chuẩn Rhodamine B 0,1ppm thể bảng 3.13 hình 3.26 3.4.6 Độ lặp lại phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngồi việc có sai số nhỏ cịn u cầu có độ 3.5 Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý kết phân tích 3.5.1 Khảo sát dung môi chiết lấy Rhodamine B 3.5.1.1 Xử lý sơ mẫu phân tích Áp dụng điều kiện tối ưu để phân tích bốn đối tượng mẫu hạt dưa, bánh xu xê, nước tương ớt 16 [Type text] Tống số mẫu phân tích mẫu/đối tượng x đối tượng (hạt dưa, bánh xu xê, nước tương ớt) Cứ ba đơn vị mẫu đối tượng thu thập trộn với thành mẫu phức hợp để phân tích 3.5.1.2 Chọn dung môi chiết Dung môi chiết yếu tố vô quan trọng định hiệu suất q trình xử lý mẫu Các dung mơi chiết sử dụng ACNAxeton, Etanol- nước, Nước- KCl, ACN- Axeton- nước, nước, etanol Chúng tiến hành xử lý sơ mẫu hạt dưa chiết với dung môi chiết khác để lựa chọn dung mơi chiết tốt 3.5.2 Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết 3.5.2.1 Mẫu hạt dƣa Sau tìm điều kiện tối ưu cho trình xử lý mẫu, chúng tơi tiến hành phân tích mẫu thực đối tượng mẫu: hạt dưa, bánh xu xê, nước ngọt, tương ớt Đối với mẫu hạt dưa,quy trình chiết sau: mẫu hạt dưa cân xác lượng 0,5 0,002 g cân phân tích chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml định mức pha động, lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn 3.5.2.2 Mẫu bánh xu xê Giống mẫu hạt dưa trên, chúng tơi tiến hành chiết mẫu phân tích theo quy trình tương tự khơng pha lỗng Đối với mẫu bánh xu xê,quy trình chiết sau: mẫu bánh xu xê cân xác lượng 0,1030 0,00054 g cân phân tích chuyển vào bình định 17 mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml định mức pha động, lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) 3.5.2.4 Mẫu siro dâu Quá trình chiết mẫu phân tích tiến hành tương tự mẫu hạt dưa mẫu bánh xu xê, khơng pha lỗng Đối với mẫu siro dâu,quy trình chiết sau: mẫu siro dâu lấy xác 0,5 0,001ml pipet men chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml định mức pha động, lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Kết phân tích mẫu Rhodamine B mẫu siro dâu trình bày bảng 3.21 Bảng 3.21 Kết phân tích mẫu siro dâu TT Lƣợng mẫu thực Lƣợng Rhodamine (ml) Diện tích píc (mAu.s) B chuẩn thêm vào (ppm) 0,5 0,00 28047 0,5 0,01 61781 0,5 0,02 96730 Kết tính tốn theo phần mềm thống kê Origin 7.5 sau: (a) (b) 18 [Type text] Hình 3.33 Đường chuẩn (a) sắc đồ (b)khi thêm chuẩn mẫu siro dâu Ta có: Cx= a/b = 0,0081(ppm) Theo cơng thức tính hàm lượng chất phân tích mẫu ban đầu, tính mx = 8,1.10-5(mg) hay 0,162mg/l Hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu 3.5.2.5 Mẫu nƣớc hƣơng dâu Quá trình chiết mẫu phân tích nước hương dâu tiến hành tương tự mẫu siro Đối với mẫu nước hương dâu,quy trình chiết sau: mẫu nước đong xác 1 0,001 ml pipet men chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml định mức pha động, lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn (mục 3.4.1) Kết phân tích cho thấy mẫu nước phân tích có chứa 0,126ppm (1,26 mg/l) Rhodamine B 19 KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng detector UV-Vis để xác định hàm lượng Rhodamine B thực phẩm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lượng Rhodamine B có mẫu thực phẩm kỹ thuật HPLC sử dụng detetor UV-Vis: Pha tĩnh: Pha động: RP- C8 (4,6 x 150 mm, 5m) 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- heptansunfonat), pH=3 Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút Nhiệt độ cột tách: 300C Thể tích vịng mẫu: 20l Detector: UV-Vis 550 nm Đã đánh giá phương pháp phân tích: Khoảng tuyến tính Rhodamine B: 0,01- 2ppm Giới hạn phát hiện: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 1ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 15ppb Giới hạn định lượng: 20 0,007mM natri [Type text] + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 3,33ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 50,2ppb Khảo sát mẫu thực  Đã chọn quy trình phân tích khảo sát dung mơi chiết tách loại thực phẩm 60% nước- 40% etanol.Trên sở quy trình tối ưu tìm tiến hành xác định hàm lượng Rhodamine B mẫu thực phẩm gồm mẫu hạt dưa, mẫu bánh xu xê, mẫu siro dâu, mẫu nước hương dâu với độ lặp lại tốt  Kết xác định mẫu thực cho thấy: mẫu thực phẩm lưu hành thị trường tiến hành phân tích, hàm lượng Rhodamine B xác định nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Chứng tỏ bị cấm sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm Rhodamine B sử dụng phổ biến loại thực phẩm lưu hành thị trường Từ kết thu được, chúng tơi thấy phương pháp HPLC sử dụng detector UV-Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho việc xác định hàm lượng Rhodamine B có loại thực phẩm với cách xử lý mẫu thích hợp Chúng tơi hy vọng nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng kỹ thuật HPLC- UV-Vis nói riêng kỹ thuật HPLC nói chung để xác định Rodamine B đối tượng mẫu thực phẩm, nhằm phục vụ đắc lực cho ngành khoa học đặc biệt lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm giúp bảo vệ sức khoẻ người References : 21 Thái Bình (18/ 11/2009), “Rhodamine B có vị thuốc đơng y chất gây ung thư”, báo Sức khoẻ đời sống Nguyễn Thạc Cát, Từ Vọng Nghi, Đào Hữu Vinh (1980) “Cơ sở ký thuyết hố học phân tích”, nhà xuất Đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Xuân Dũng, Từ Vọng Nghi, Phạm Luận (1986) “Các phương pháp tách- Sắc ký lỏng cao áp”, Đại học Tổng hợp Amsterdam, Hà Nội Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003), “Hố học phân tích- Phần II- Các phương pháp phân tích cơng cụ”, ĐHQG Hà Nội Nguyễn Đắc Kiên (2009- 2010), “Nghiên cứu hình thành tích lũy độc tố afltoxin bảo quản thức ăn thủy sản”, luận văn thạc sỹ khoa họcĐại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia, Hà Nội Phạm Luận (1999), “Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao”, Đại học Tổng hợp Hà Nội Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Đào Tố Uyên, Phạm Văn Hoan (2009), “Xác định Sudan I số loại gia vị kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)”, tạp chí y học thực hành, số (641+642), trang 58-60 Đỗ Văn Quân (2007), “Xác định hợp chất Sudan phương pháp sắc ký lỏng có độ phân giải cao” Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội TCVN 8670-2011 việc xác định Rhodamine B HPLC An activity of asean committee on science and technology  federation of institutes of food science and technology in asean (2005), “identification of prohibited colorants in cosmetic products by TLC and HPLC”, ACM SIN 02, pp 1-6 10.Brian Stuart and M.Walker (2006) “Analysis of illegal Dyes in Chili Powder by LC- UV”, Statutory analysis government chemist: Programme ad hoc project 1, pp 1-11 22 [Type text] 11.C.Minier (1996) “Rhodamine B accumulation and MXR protein expression in musscle blood cells: effects of exposure to vicristine” Marine ecology progress series vol 142 pp 165-173 12 Carcinogen, Pesticide Branch, (2/1989), Rhodamine B, OSHA analytical Laboratory- Salt Lake city- Utah 13.Geertruida Sihombing (2001), “An Exploratory Study on three Synthetic Colouring Matters Commonly Used as Food colours in Jakarta”, Master Theses from JKPKBPPK 14.Hu- sheng cheng (2007) “Indentification of Rhodamine B 6g and Rhodamine B dyes present in ballpoint pen ink using high performance liquidchromatography and UV vis spectro mettry”, Frorensic science journal pp21-37 15 L.Gagliardi, D.De Orsi, G.Cavazzutti, G.Multari, D Tonelli, (6/1996), “HPLC determination of rhodamine B (C.I 45170) in cosmetic products”, Chromatographia Vol.43.ultari 16.Noureddine Barka and CS(2008) “Factors influencing the photocatalytic degradation of Rhodamine B by TiO2- coated non- woven paper” journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry 195, pp 346-351 17 Giao Xuân, (1/2/2010), “Chili powder maker suspended for Rhodamine B contaminnation health news”, báo Sức khoẻ đời sống 18.Petr botek, Jan Poustka (2007) “Determination of banned dyes in spices by liquid chromatography- Mass spectrometry”, Czech J Food Sci, vol.25, No.1, pp 17- 24 19 R.W Mason L.R.Edwards (1989), “High-performance liquid chromatographic determination of rhodamine B in rabbit and human plasma”, Journal of Chromatography, 491 page 468- 472 23 20.Wirasto, Skrisi (2008) “Analisis Rhodamine B dan metanil yellow danam minuman jajana anak sd di kecamatan laweyan kotamadya surakarta dengan metade kromatography lapis tipis” Fakultas Farmasi, Muhammaadiyah surakarta, Indonesia, pp 2-17 21 http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodamine_B (7/2011) 22 http://vietbao.vn/Suc-khoe/Phat-hien-chat-doc-Rhodamine-B-trong-giavi/70077015/248/ (9/2/2007) 23 http://wordpress.com/2010/03/02/vấn-đề-an-toàn-thực-phẩm-tại-việtnam-nổi-cộm-trở-lại-với-vụ-bột-gia-vị-nhiễm-rhodamine B/Tonelli 24.http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/SKLM.htm (6/2011) 25.www.asean.org/MRA-Cosmetic/Doc-2.pdf (02/12/2005) 26.http://www.leo.com (9/2008) “Using LC- TOFMS for screening of Sudan Dyes in food” 27.http://duocphamvn.com/baiviet/6159-28-TCN198-2004-Histamin-trongsan-pham-thuy-san-Phuong-phap-dinh-luong-bang-sac.thuoc 28 http://3c.com.vn/Story/vn/tintucvasukien/diemtin/2007/2/8174.htmlc (6/2011) “khâu liên quan đến trình sản xuất lương thực thực phẩm” 24 ... biến b? ??o quản thực phẩm Rhodamine B sử dụng phổ biến loại thực phẩm lưu hành thị trường Từ kết thu được, thấy phương pháp HPLC sử dụng detector UV- Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho việc xác định. .. khác  Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP- HPLC hấp phụ pha ngược RP- HPLC)  Sắc ký trao đổi ion (EX- HPLC)  Sắc ký rây phân tử (Gel- HPLC) Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) kỹ thuật. .. (1,26 mg/l) Rhodamine B 19 KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng detector UV- Vis để xác định hàm lượng Rhodamine B thực phẩm, thu số