Xác định kiểu gen virut viêm gan c trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan c bằng kỹ thuật sinh học phân tử real time – PCR

Xác định kiểu gen virut viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử Real time – PCR Phương Thị Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ

Xác định kiểu gen virut viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử Real time – PCR

Phương Thị Hà

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40

Người hướng dẫn: TS.BS Nguyễn Văn Tiến

Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Trình bày đặc điểm sinh học virut viên gan C (HCV), genotype HCV, bệnh

học viêm gan virut C và các kỹ thuật real-time PCR Phân tích những mẫu huyết thanh

và các bệnh nhân đã xác định anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/ 2011 đến tháng 01/2012 Đưa ra kết quả nghiên cứu: tỷ lệ bệnh nhân chuẩn đoán viêm gan C theo giới tính; tỷ lệ bệnh nhân chuẩn đoán viêm gan C theo mạn; mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type; xác định lại kiểu gen type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen

(Sequencing) trên đoạn NS5B

Keywords: Vi sinh vật học; Virus viêm gan C; Kiểu gen; Sinh học phân tử

Content

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sau khi xác định được người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước khi cho chỉ đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian điều trị cần thiết là định lượng số lượng siêu vi trong máu (HCV-ARN) và định kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) Để xác định được genotypes HCV thì ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử đã phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV Trên thế giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… đã cho ra đời các bộ kit xác định genotypes HCV với độ chính xác cao Tuy nhiên, giá thành của những bộ kit này còn cao nên chưa được

áp dụng rộng rãi Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes HCV: Real-time PCR (RT-PCR) và kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing) Kỹ thuật Sequencing trong chuẩn đoán

có nhiều tính ưu việt trong việc xác định kiểu gen là sự chính xác cao, tránh được những nhầm lẫn trên cùng một type hoặc subtype nhưng phương pháp này cần có các máy móc trang thiết bị hiện đại và điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu được thực hiện tại các trung tâm nghiên cứu Kỹ thuật RT-PCR được tiến hành ở tất cả các phòng thí nghiệm

PCR do dễ thực hiện không đòi hỏi máy móc trang thiết bị và kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người dân ở Việt Nam,tuy nhiên không xác định được đến subtype và có sự nhầm lẫn giữa type1 và type6 Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn

đúng phương pháp xác định genotype, vì vậy tôi chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm

gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”,

với những mục tiêu như sau :

1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV bằng phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe

2) Xác định lại kiểu gen Type 1 bằng phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) trên đoạn gen NS5B

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV)

1.1.1.Hình thái cấu trúc virut viêm gan C

Virut viêm gan C là loại virut hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người phát hiện HCV

có hình cầu, hình đa diện hoặc hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1)

Về cấu trúc của virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein và màng

vỏ (Hình 1.2)

Kích thước khoảng 60nm

Hình 1.2 Cấu trúc của virut viêm gan C

1.1.2 Genome HCV

Genome của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN có tính phân cực dương, bao quanh bởi một màng protein có chức năng bảo vệ tạo hình đa diện đều và gói lại bởi màng lipid từ nguồn của tế bào gan, kích thước của một chuỗi đơn ARN (+) là 9,6 kb Giống như các chuỗi ARN dương của các loại virut khác, tổ chức genome của virut viêm gan

C cũng mang vai trò như một ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho

protein của virut [17,40,47]

Mà ng vỏ

ARN virus

Mà ng vỏ

glycoprotein

Core

Tổ chức Genome của HCV được chia làm hai vùng

Vùng cấu trúc mã hóa cho các protein cấu trúc gồm:

- Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit

- Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ ngoài p33

- Gen E2 mã hóa cho protein vỏ ngoài gp 70

Vùng không cấu trúc mã hóa cho các protein không cấu trúc bao gồm:

- Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23)

- Gen NS3 mã hóa cho proteaza và helicaza (p72)

- Gen NS4 được chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 và NS4B mã hóa cho protein p27

- Gen NS5 được chia thành NS5a mã hóa cho replicaza và NS5b mã hóa cho ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho quá trình sao chép

Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa một đơn khung mở (ORF- open reading frame),

mã hóa cho một tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1.3) Trong quá trình virrut sao chép chuỗi protein này sẽ được kích hoạt bởi enzyme virut giống như tế bào chủ trong ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) và bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31] Một protein khác (kí hiệu F-Temed) hoặc ARF (khung đọc thay thế) được dự đoán là kết quả của khung đọc thay thế riboxome trong quá trình sao chép cùng với vùng nhân của hệ gen ARN[39,43,46]

Cấu trúc Không cấu trúc

Tổng hợp chuỗi polyprotein

Protein

Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza và helicaza Replica

và ARN-polymerase

Hình 1.3: Tổ chức genome HCV

Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein của virut và protein vỏ của virut là E1,E2 được đặt ở phần đuôi 5’ của khung đọc mở theo chiều ngược bởi vùng mã hóa cho các protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1.3) Các protein cấu trúc là hợp phần quan trọng của virut viêm gan C, do đó các protein phi cấu trúc sẽ không có sự gắn kết với virut xong lại cùng nằm trong quá trình sao chép ARN và morphogenesis virut [50]

1.1.3 Vòng đời của virut viêm gan C

Chưa biết đầy đủ vòng đời của HCV vì chưa có môi trường nuôi cấy HCV in vitro để thể hiện vòng đời và sinh trưởng của HCV Nhưng vì hình thành hệ thống replicon đã như một cuộc cách mạng giúp tìm hiểu sinh trưởng vòng đời của HCV

Hình 1.4 : Mô hình hiện tại vòng đời và sinh trưởng HCV [51] (1:Sự hấp phụ bề mặt

tế bào gan nhờ đồng tiếp nhận 2: Xâm nhập nội tế bào 3: Sự dung hợp với àng lipit tế bào gan 4: Phá bỏ lớp vỏ ngoài giải phóng ARN (+) 5: Dịch mã và sao chép ARN nhờ Web màng 6: Tập hợp và đóng gói 7: Tạo virut hoàn chỉnh 8: Sự phóng thích ra khỏi tế bào gan)

1.2 Genotype HCV

HCV là một virus có bộ gen là ARN, trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men RNA polymerase, mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp ARN, từ

đó làm cho bộ gen của virus rất đa dạng nên người ta đã phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50]

Tiến hành so sánh đối chiếu chuỗi nucleotit của các chủng virut thu nhận được từ các bệnh nhân nhiễm bệnh với các nhóm bệnh khác nhau của quá trình lây nhiễm tại các vùng miền địa lý khác nhau người ta đã phát hiện thấy sự tồn tại của ít nhất là 06 nhóm gen chính bao gồm type 1, type 2,type 3 type 4,type 5 và type 6[12,39] Khi tính toán mức trung bình trên toàn bộ genome hoàn chỉnh, khi đó sự khác biệt về các tâm nucleotit là 30- 35% với sự biến đổi nhỏ trong các vùng xác định như là glycoprotein E1 và E2 mà tại đó chuỗi của gen nhân và một số gen không có cấu trúc như NS3 thì có sự bảo toàn cao hơn Khả năng khác nhau của các chuỗi ở mức thấp nhất giữa các genotype được phát hiện thấy trong 5’ NCR, tại

đó chuỗi riêng lẻ và cấu trúc ARN thứ cấp là cần thiết cho quá trình sao chép và chức năng chuyển hóa[44,47]

Mặc dù có sự đa dạng về các chuỗi HCV, tất cả trình tự bổ sung và kích thước trên đoạn gen là có sự đồng nhất Tuy nhiên trái ngược với quan sát chung là sự biến đổi của chuỗi trình

tự mã hóa ở cả hai vị trí khung đọc và kích thước của protein là không có sự bảo tồn cao với kiểu gen Điều này trái ngược với tính chất bảo tồn tiến hóa của rất nhiều bản sao HCV, đồng

ý với ý kiến này cho rằng có khả năng gen này là sản phẩm sinh ra từ sự nhân đôi của ARN có

sự biến đổi codon thứ ba của gen lõi[42,44]

Hình 1.6 : Sự phân bố của các kiểu gen [44]

Mỗi nhóm gen trong bộ 06 nhóm gen quan trọng nhất của HCV đều có chứa một chuỗi các subtype có liên quan chặt chẽ với nhau Trong đó, sự khác biệt của mỗi subtype vào khoảng 20- 25% về chuỗi nucleotit, với genotype con số này là >30% Một số genotype như 1a,1b, và 3a có sự phân bố rộng hơn cả, điều này có thể là kết quả của quá trình truyền máu

và dùng chung kim tiêm giữa những người sử dụng ma túy trong vòng 30-70 năm qua và bây giờ phần lớn là phân bố ở các nước phương tây (Hình 1.6 ).(Đây là những kiểu gen được gặp phổ biến nhất trong các thử nghiệm lâm sàng và thông tin mới nhất đã được thu thập trên các phản ứng với interferon (INF) và các phương pháp điều trị virus khác) Trong đó 1a phân bố toàn thế giới, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ, type 2 phân bố địa trung hải và Trung Đông, type 3 chủ yếu ở Châu Âu, type 4 phân bố ở trung đông, type 5 ở Nam Phi, type 6 ở Hồng Kông và Việt Nam [42,44]

Một mô hình khác về tính đa dạng của chuỗi được quan sát thấy trong khu vực châu Phi

và Đông Nam Á, Ở đây có những kiểu gen gần gũi và khu vực địa lý cụ thể Ví dụ, sự lây nhiễm HCV ở miền tây Châu Phi là do genotype 2, trong khi những người ở Trung Phi, chẳng hạn như Cộng hòa Dân chủ Congo và Gabon, lại có sự lưu hành của kiểu gen 1 và 4,còn kiểu

Kiểu gen 1a được phân bố rộng rãi ở bắc Âu và Mỹ, các nước có nền công

nghiệp hóa

Kiểu gen 1b thường thường phân

bố toàn thế giới

Type 4a phân bố rộng rãi ở Trung

Đông

Type 5a thường tìm thấy duy nhất

ở Nam Phi

Type 6a tìm thấy ở Việt Nam, các

khu công nghiệp ở Hồng Kông và

gần đây tìm thấy ở Autralia

Kiểu gen 3a được phân bố ở các khu

vực công nghiệp hóa ở Châu Âu

Kiểu gen 2 [2a,2b,2c] tìm thấy

chủ yếu ở các nước vùng Địa

Trung Hải và viễn Đông

gen 6 sự lưu hành ở khu vực Đông Á là phổ biến Phân tích ở mức độ phân tử cho thấy rằng

sự có mặt của các kiểu gen này có thời gian lưu hành tại các khu vực địa lý tương ứng ít nhất vài thế kỷ [42,44]

Kiểu gen 6 là một ví dụ nổi bật của sự đa dạng HCV trong vùng lưu hành Thật vậy, kiểu gen HCV được phân lập đầu tiên từ Đông Á rất khác nhau mà ban đầu các nhà nghiên cứu phân loại là kiểu gen 7,8,9 và 11[42] Những chủng này khi được phân loại như là phân nhóm của kiểu gen 6 Lây nhiễm kiểu gen 6 là một con số đáng kể trong vùng dịch tễ: tổ chức WHO xác định có 62 triệu người bị nhiễm trong khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây nhiễm các kiểu gen trên toàn thế giới [42] Kiểu gen 6 phân lập đã thu được từ các cư dân của Thái Lan, Ấn Độ, Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông và Indonesia [42,44] Sự lưu hành của HCV trong cộng đồng có sự thay đổi giữa các nước Đông

Á, từ khoảng 0,5% tại Singapore và Hồng Kông, khoảng 6% tại Việt Nam và Thái Lan [42]

và vượt quá 10% tại Myanma, tỷ lệ báo cáo tại Trung Quốc là khoảng 2-3% xấp xỉ khoảng 30 triệu người [42] Tất nhiên,không phải nhiễm HCV ở Đông Á là do kiểu gen 6 và sự phân bố kiểu gen HCV có thể thay đổi giữa các nước trong khu vực Đông Á

Các genotype của HCV có sự khác nhau về độc lực, khẳ năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị bằng interferon (genotype 1 đáp ứng thấp hơn các genotype khác: 18,1% so với 54,9%)[2]

Hậu quả về tính đa dạng gen của HCV:

+Làm virut có khả năng né tránh đáp ứng miễn dịch của vật chủ dẫn đến tỉ lệ nhiễm HCV mạn cao (>80%)

+ Sau khi khỏi bệnh, cơ thể không có miễn dịch bảo vệ và vẫn có nguy cơ bị tái nhiễm + Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh rất khó khăn hiện chưa có vacin (do thiếu

hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, do HCV đột biến gen tạo ra chủng virut mới)

1.3 Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV

Hiện nay kỹ thuật được ứng dụng trong xác định kiểu HCV ở Việt Nam là kỹ thuật

Real-time PCR và giải trình tự gen ( InoLIPA và Sequencing)

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2011 đến tháng 1/2012

Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm - Khoa truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là những mẫu huyết thanh các bệnh nhân đã xác định Anti HCV dương tính đến xét nghiệm tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai

2.2 Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu

Mẫu có đủ các điều kiện như trên sẽ được tách chiết và tinh sạch ARN sau đó tổng hợp thành cDNA nhờ men phiên mã ngược Reverse Transciptase, sản phẩm cDNA của các mẫu bệnh nhân sẽ được định lượng bằng phương pháp Real-time

Kĩ thuật tách chiết ARN

Kĩ thuật tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên

Kỹ thuật Real - time PCR sử dụng Taqman Probe phát hiện và đinh lượng HCV-RNA

Kĩ thuật Real-time PCR sử dụng taqman probe để xác định kiểu gen HCV

Kỹ thuật sequencing trong xác định kiểu gen HCV

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả có đối chứng

Thống kê mẫu theo độ tuổi giới tính, sự phân bố lưu hành kiểu gen trong mẫu đã được lựa chọn

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu

3.1.1 Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính

3.1.2 Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C mạn

3.2 Tỉ lệ kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật RT-PCR

3.2.1 Mối tương quan giữa kết quả định lượng với kết quả định type

3.2.2 Tỉ lệ kiểu gen trong 228 bệnh nhân được xác định genotype

Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV

Kiểu gen

HCV

định được

Tổng

Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì tỉ lệ type

1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ

lệ thấp nhất là type 2 chỉ có 5 mẫu chiếm tỉ lệ là 2.19%, không xác định được type có 2 mẫu

với tỉ lệ là 0.88%, trong đó không phát hiện được type 3 trong 228 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu

Tỉ lệ phân bố kiểu gen được biểu diễn ở hình 3.3

Hình 3.3 Tỉ lệ phân bố các kiểu gen

Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy cùng cộng sự năm 2006, tác giả đã sử dụng kỹ thuật Real-time Rever Transcription PCR trong định kiểu gen HCV đã ghi nhận có 28 trường hợp là type 1 chiếm 56 %, 15 trường hợp là type 6 chiếm 30%, và 7 trường hợp là type 2 chiếm 14%, không có trường hợp nào là type 3[50]

Cũng tương đồng với kết quả trên trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng cộng sự tại trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả đã sử dụng kỹ thuật LIPA để xác định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan siêu vi C mạn tính, tác giả cũng đã xác định được 3 kiểu gen chính là 1,2 và 6 Trong đó kiểu gen 1 chiếm 58,4% ( type 1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type 1b:45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6 (toàn bộ là 6a) 23,9% và kiểu gen 2 là 13,1% (type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), chỉ có một trường hợp là kiểu gen 3b (0,3%)[ 50]

Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy và luận văn của tôi là sử dụng kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại trên vùng 5’NC còn trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen cũng trên vùng 5’NC, cho thấy kết quả nghiên cứu của tôi có sự tương đồng về kết quả cùng với hai tác giả trên, như vậy nếu dựa trên vùng gen 5’NC đa số kiểu gen của HCV tập trung ở genotype 1 và 6 trong đó genotype 1 là chiếm cao nhất Tuy nhiên tỉ lệ này chưa thể phản ánh thật sự phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV trên những người nhiễm HCV tại Việt Nam

Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV

Kiểu gen

HCV

định đƣợc

Tổng

Qua bảng 3.4 ta thấy rằng trong số 228 mẫu huyết thanh được định genotype thì tỉ lệ type

1 chiếm nhiều nhất là 151 mẫu chiếm 66.23%, sau đó là type 6 gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ

lệ thấp nhất là type 2 chỉ có 5 mẫu chiếm tỉ lệ là 2.19%, không xác định được type có 2 mẫu với tỉ lệ là 0.88%, trong đó không phát hiện được type 3 trong 228 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu

Tỉ lệ phân bố kiểu gen được biểu diễn ở hình 3.3

Hình 3.3 Tỉ lệ phân bố các kiểu gen

Trong nghiên cứu của Hồ Thị Thanh Thủy cùng cộng sự năm 2006, tác giả đã sử dụng kỹ thuật Real-time Rever Transcription PCR trong định kiểu gen HCV đã ghi nhận có 28 trường hợp là type 1 chiếm 56 %, 15 trường hợp là type 6 chiếm 30%, và 7 trường hợp là type 2 chiếm 14%, không có trường hợp nào là type 3[50]

Cũng tương đồng với kết quả trên trong nghiên cứu của Hồ Tấn Đạt cùng cộng sự tại trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả đã sử dụng kỹ thuật LIPA để xác định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan siêu vi C mạn tính, tác giả cũng đã xác định được 3 kiểu gen chính là 1,2 và 6 Trong đó kiểu gen 1 chiếm 58,4% ( type