Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn hà nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS MS

Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS Trần Thị Hồng Trường Đạ

Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp

sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Trần Thị Hồng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Hóa phân tích; Mã số: 60 44 29

Người hướng dẫn: TS Lê Thị Hồng Hảo

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran; tác dụng của các chất kháng

sinh nhóm nitrofuran; dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm Xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tươi sống bằng LC-MS/MS Ứng dụng phương pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tươi sống cụ thể trong thi ̣t lơ ̣n , thịt bò,

thịt gà, gan Tìm hiểu kết quả đạt được

Keywords Hóa phân tích; Dư lượng kháng sinh; Thực phẩm

Content

MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang được cả xã hội quan tâm, đặc biệt là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát hiện trong thực phẩm khiến dư luận lo ngại Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề đáng lo ngại, như việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử dụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện Từ đó đã để lại tồn dư các hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thường được sử dụng trong thức ăn gia súc như kích thích tăng trưởng và là phương pháp điều trị dự phòng, điều trị các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong chăn nuôi gia súc, gia cầm Chúng cũng đã được sử dụng để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên chúng gây tác hại cho sức khỏe con người, đặc biệt là gây ung thư và đột biến ở người Năm 2002 – 2003 phát hiện dư lượng chất chuyển hóa của nitrofuran trong số lượng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khẩu vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nước Nam Mỹ Từ đó đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc gia bao gồm Mỹ, Canada

và EU Các nước này đã đặt lệnh cấm trên tất cả các loại thực phẩm nhập khẩu có chứa dư

lượng nitrofuran Tháng 3 năm 2003 EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29] Năm

2002, ở Việt Nam, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong đó có nitrofuran [9]

Hiện nay việc sử dụng dư lượng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động ảnh hưởng tới sức khỏe con người và động vật Vì vậy với nhu cầu bức thiết về vấn đề đảm bảo

VSATTP hiện nay, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp “Xác định

đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có ch ứa nhóm 5-nitro, thường được sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trưởng, chủ yếu đối với gia súc (như gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng như viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu [12]

Các chất nhóm n itrofuran bao gồm Furazolidone, furaltadone, furazolidone, nitrofurazone, khi đi vào cơ thể sinh vâ ̣t nó tạo thành các chất chuyển hóa tương ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kết trong các mô tồn ta ̣i trong nhiều tuần sau khi sử du ̣ng [12]

1.2 Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran

McCracken và các cô ̣ng sự 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tương ứng liên kết trong các mô

Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa từ nitrofuran đã kìm hãm hoặc phá hủy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn Do đó vi khuẩn không phát triển và không sinh sản được nữa Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram dương Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác dụng tốt trong viê ̣c giê ̣t trừ giun đũa [7]

Với nồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn

Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong việc diê ̣t khuẩn salmonellosis, colisepticeamia Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dưỡng Trộn nitrofuran với thức

ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng nhanh

Nitrofuran ảnh hưởng đến sức khỏe con người như gây ung thư và đột biến [7], khi thực phẩm có tồn dư nitrofuran và các dẫn xuất của nó

Do đó hầu hết các nước trên thế giới đã cấ m sử du ̣ng kháng sinh nhóm nitrofuran trong chăn nuôi Ở Việt Nam, bô ̣ Nông nghiê ̣p và phát triển nông thôn đã quyết đi ̣nh cấm sử dụng nitrofuran cho vào trong thức ăn chăn nuôi [9] EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phương pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]

1.3 Dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm

Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thường xuyên được phát hiện thấy trong thịt gia cầm

và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nước EU từ Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25]

Hơn nữa, dư lượng nitrofuran cũng được tìm thấy trong sản phẩm gia súc và gia cầm

ở Châu Âu như: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari Sau đó EU đã kiểm tra và cho

thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn 9 quốc gia trong năm 2007,

tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc (37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm tôm, mật ong và thịt hộp [25]

Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê, cá ba sa cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran trong tôm [11]

Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS Nguyễn Quốc Ân , phó trưởng phòng quản

lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lấy ta ̣i ao nuôi nhiễm SEM (3 mẫu tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lô ̣t) với hàm lươ ̣ng từ 0 – 3,55 ng/g Năm 2008 phát hiê ̣n 1 mẫu tôm thẻ chân trắng ta ̣i Phú Mỹ – Bình Định nhiễm AOZ với hàm lượng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lột ta ̣i Cần Guô ̣c – Long An nhiễm SEM với hàm lượng từ 2 – 2,2 ng/g [1]

1.4 Các phương pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran

Hiê ̣n nay có nhiều phương pháp để xác đi ̣nh kháng sinh nhóm nitrofuran , bao gồm: phương pháp sắc ký lỏng với detector UV , phương pháp vi sinh (kỹ thuật Elisa ), phương pháp sắc ký lỏng với detector MS/MS

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng, mục tiêu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các chất chuyển hóa của nitrofuran, bao gồm: AOZ, AMOZ, SEM và AHD

Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tươi sống bao gồm thịt và gan của gia súc gia cầm

Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực phẩm tươi sống bằng

kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS Các mục tiêu cụ thể như sau:

- Xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm tươi sống bằng LC-MS/MS

- Ứng dụng phương pháp để xác định các chất chuyển hóa của nitrofuran trong thực phẩm

tươi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

2.1.2.1 Xây dựng phương pháp

 Khảo sát phương pháp bao gồm:

 Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,

 Điều kiện tách chiết lấy chất phân tích

 Thẩm định phương pháp:

 Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ,

 Khoảng tuyến tính,

 Độ chụm (độ lặp lại),

 Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch)

2.1.2.2 Ứng dụng phương pháp

Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tươi sống đang bán trên địa bàn Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

Khảo sát phương pháp xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn

2.2.3 Thẩm định phương pha ́ p

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

2.3 Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

2.3.1 Dụng cụ và thiết bị

2.3.1.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt

- Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm)

- Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB)

- Máy lắc vortex VELP

- Máy đồng nhất mẫu

- Máy li tâm MIKRO 22R

- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg)

- Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g)

- Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt

- Bể điều nhiệt

2.3.1.2 Dụng cụ

- Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml

- Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml

- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 µl; 1000 µl; 5 ml…đầu côn

- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm

- Vial loại 1,8 ml

- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml

- Ống nghiệm thủy tinh…

2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

2.3.2.1 Chất chuẩn

- AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- SEM.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5%

- d4-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d5-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d2-AHD.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99%

- 13C15N2-SEM.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98%

2.3.2.2 Hóa chất

- Methanol (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)

- Amoni acetate (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 98%)

- 2-NBA (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%)

- K2HPO4.3H2O (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99%)

- NaOH (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 37% (Merck hoặc tương đương, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nước cất

- 2-NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2-NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằng methanol Dung dịch chuẩn bị hằng ngày

- K2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000 ml bằng nước cất 2 lần

- NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng nước cất

2 lần

- CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình định mức

1000 ml bằng nước cất 2 lần

2.3.3 Pha chế chất chuẩn

- Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng được trong 6 tháng

- Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200

C sử du ̣ng được trong 6 tháng

- Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml

- Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200

C sử du ̣ng được trong 6 tháng

- Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lượt 1 ml chuẩn AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng được trong 3 tháng

- Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 µg/l: hút 200 µl hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng được trong 1 tháng

- d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng được trong 6 tháng

- d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 µl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức

10 ml Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng được trong 6 tháng

- d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d5-AMOZ định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng được trong 6 tháng

- d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 µl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng được trong 6 tháng

- Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 1 mg/l: hút lần lượt 1 ml chuẩn d4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-AHD.HCl 10 mg/l và 13C15N2 -SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sử dụng được trong 3 tháng

- Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13C15N2-SEM.HCl) 20 µg/l: hút lần lượt 200 µl hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, 13C15N2-SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml Bảo quản ở - 200C sử du ̣ng được trong 1 tháng

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS

Phân tích dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các chất chuyển hóa của nhóm nitrofuran Các chất chuyển hóa của nitrofuran có khối lượng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đặc hiệu cho sự phân mảnh (chủ yếu là mất nước, NH3, CO2), độ nhạy phát hiện bằng MS tương đối thấp Vì vậy sử dụng 2-nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran để có được các hợp chất dẫn xuất (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM) với nhiều đặc tính thuận lợi

3.1.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ khối

3.1.1.1 Khảo sát ion mẹ

Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lượng phân tử nhỏ và phân cực Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM bằng kỹ thuật ion hóa phun

điện tử ESI với chệ độ bắn phá ion dương Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh

500 µl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD, SEM 500 ng/ml đã được dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte , sau đó đưa vào detector để khảo sát Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất, tối ưu hóa từng ion mẹ, thu được điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Nhiệt độ mao quản (TEM) 4000C

Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 50 psi

Áp suất của luồng khí nóng (GS2) 40 psi Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion mẹ có dạng (MH)+ vớ i số khối m = (M+1) theo phản ứng:

M0 + H+ → (MH)+

Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, kết quả được chỉ ra ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ

Chuyển hóa nhóm nitrofuran Khối lượng phân tử M Ion mẹ (M+H)

13

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện bắn phá ion me ̣ để thu đươ ̣c ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hệ kh ối phổ 2 lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn được ion con là rất quan trọng Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp Dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn đã được dẫn xuất vào detector khối phổ và lựa chọn 2 ion con đặc trưng có cư ờng độ tín hiệu cao nhất để định tính

và định lượng Mảnh ion con m/z có cường độ lớn nhất dùng để định lượng, mảnh ion con thứ 2 có cường độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ion con đặc trưng có cường độ cao nhất Kết quả thu được ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các chất chuyển hóa nitrofuran

Chuyển hóa

nhóm

nitrofuran

Ion mẹ (M+H) + Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V)

C- 15 N 2

Nhâ ̣n xét:

Theo qui định của Châu Âu 2002/657/EC, số điểm nhâ ̣n da ̣ng (IP) được tính đối với kỹ thuâ ̣t LC/MS/M, tương ứ ng với 1 ion me ̣ và 2 ion con , số điểm nhâ ̣n da ̣ng (IP) là 4 Như vâ ̣y phương pháp đã đáp ứng được yêu cầu của Châu Âu [phụ lục 4] Phù hợp với các nghiên cứu khác của một số tác giả như tác giả Leitner, tác giả D.Tyler của phòng thí nghiê ̣m của Anh…

3.1.2 Lựa chọn cột tách

Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thời theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực trung bình như methanol, acetonitrile, nước, acid formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%)…cột tách nên sử dụng là cột tách pha đảo Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 với các thông số dưới đây cho các nghiên cứu tiếp theo:

- Cột C18 của Agilent có:

- Chiều dài 150mm,

- Đường kính 2,1mm,

- Cỡ ha ̣t 3,5µm

3.1.3 Khảo sát chương trình gradient pha đô ̣ng

Các dẫn xuất của nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợp Chúng tôi tiến hành khảo sát một số chương trình rửa giải gradient Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17, 24] chúng tôi sử dụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol Cố định các điều kiện sắc ký:

- Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm),

- Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol,

- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút,

- Mẫu phân tích: hỗn hợp dẫn xuất nitrofuran, nồng độ: 20 ng/ml

Tiến hành thí nghiê ̣m theo:

a) Chương trình Gradient 1, thu đươ ̣c sắc đồ như trong hình 3.1 :

Thời gian (phút) 0,01 12,00 14,00 15,00 20,00

Hình 3.1: sắc đồ hỗn hợp chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 1 ở nồng độ 20 ng/ml

b) Chương trình Gradient 2, thu đươ ̣c sắc đồ trong hình 3.2:

Hình 3.2: sắc đồ hỗn hợp chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 2 ở nồng độ 20 ng/ml

c) Chương trình Gradient 3, thu đươ ̣c sắc đồ trong hình 3.3 :

Thời gian (phút) 0,01 8 10 13 13,01

Hình 3.3: sắc đồ hỗn hợp chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 3 ở nồng độ 20 ng/

d) Chương trình Gradient 4, thu đươ ̣c sắc đồ trong hình 3.4:

Thời gian (phút) 0,01 10 12 15 15,01

Hình 3.4: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 4 ở nồng độ 20 ng/ml

e) Chương trình Gradient 5, thu đươ ̣c sắc đồ trong hình 3.5:

Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00

Hình 3.5: sắc đồ hỗn hơ ̣p chuẩn khi cha ̣y chế đô ̣ gradient 5 ở nồng độ 20 ng/ml

Bàn luận :

- Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thời gian ngắn (chương trình gradient 1, gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc của AOZ rất xấu và bị chẻ píc Hiê ̣n tượng chẻ pic này là do hàm lươ ̣ng MeOH cao , AOZ tồn ta ̣i đồng thời ở hai da ̣ng là amin bâ ̣c nhất R -NH2 và dạng R

-NH3+ Do đó , nồng đô ̣ MeOH cần phải đươ ̣c khống chế phù hơ ̣p , đồng nghĩa với tăng nồng

đô ̣ CH3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin thành dạng R-NH3+

- Chương trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng và có tín hiê ̣u píc rõ ràng Do đó chúng tôi lựa chọn chương trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiếp theo

3.1.4 Khảo sát quy trình chiết mẫu

Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26] có một số quy trình đã và đang được ứng dụng để tách chiết các chất nhóm nitrofuran bao gồm : quy

trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng, quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát 2 quy trình chiết mẫu sau đây để tiến hành thí nghiê ̣m

3.1.4.1 Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng

Dự kiến quy trình xử lý mẫu như sau:

Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm



Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml



Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống



Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu



Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400

C



Trung hòa axit bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây



Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lấy dung dịch mẫu



Chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 4 ml ethylactetate, ly tâm hút lấy lớp trên thổi khô bằng N 2



Hòa tan cặn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)



Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích bằng LC/MS/MS

3.1.4.2 Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn

Thực hiê ̣n theo sơ đồ sau:

Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm



Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml



Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống



Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu



Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400

C



Trung hòa mẫu bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc vortex 20 giây