Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm

Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm Vũ Thị Thu Hằng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 6

Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong

chọn giống lúa chịu ngập chìm

Vũ Thị Thu Hằng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70

Người hướng dẫn: TS Lưu Thị Ngọc Huyền

Năm bảo vệ: 2011

Abstract Tổng quan về ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, nước biển dâng đến sản

xuất lúa gạo; các vùng trồng lúa ở Việt Nam có khả năng bị ngập theo kịch bản biến đổi khí hậu Nghiên cứu về cơ chế tính chống chịu ngập của cây lúa: gen chịu gập của cây lúa và cơ chế hoạt động; sinh lý học tính chịu ngập của cây lúa; di truyền tính chịu ngập của cây lúa Tìm hiểu một số loại chỉ thị phân tử thường được sử dụng trong nghiên cứu Genome và chọn giống thực vật, đồng thời nghiên cứu chọn tạo giống chụi ngập trên thế giới và ở Việt Nam Nghiên cứu về giống lúa cho gen: IR64Sub1 và giống lúa nhận gen: AS996 trong môi trường chịu ngập nước ở Việt Nam Trình bày các phương pháp nghiên cứu: phương pháp lai hữu tính -lai trở lại giữa giống cho và nhận gen chịu ngập nước; phương pháp tách chiết ADN tổng số; phương pháp PCR với mồi SSR; phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%; phương pháp điện di trên gel polyacylamide; phương pháp xử lý số liệu Đưa ra kết quả nghiên cứu và thảo luận: tách chiết và tinh sạch ADN tổng số; khảo sát đa hình

giữa hai giống bố mẹ; quy tụ gen chịu ngập chìm SuB1 vào giống lúa AS996

Keywords Di truyền học; Phân tử; Giống lúa chịu ngập chìm; Cây lúa

Content

MỞ ĐẦU

Cây lúa (Oryza Sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng cho khoảng 2/3

dân số thế giới Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, thế giới có khoảng 156,1 triệu

ha đất dùng cho việc trồng lúa, sản lượng là 697,9 triệu tấn, 90% diện tích này thuộc các nước châu Á với 651 triệu tấn thóc chiếm 92% tổng sản lượng lúa gạo thế giới (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010)[3]

Trên thế giới, an ninh lương thực không chỉ là vấn đề với các nước nghèo mà nó đang trở thành vấn đề có tính toàn cầu Dân số thế giới liên tục tăng (khoảng 7 tỷ người năm 2011)

trong khi diện tích đất dành cho việc trồng lúa hầu như không tăng mà ngày càng giảm do đất được chuyển sang sử dụng cho các mục đích khác như xây dựng khu công nghiệp, trường học, nhà ở, khu du lịch

Bên cạnh đó, các dấu hiệu về sự biến đổi khí hậu hiện nay đã có thể nhận thấy như trái đất đang nóng lên, băng tan ở hai cực, bão lũ xảy ra thường xuyên Ở Việt Nam nhiệt độ trung bình hàng năm tăng 0,10C và mực nước biển tăng 2,5 – 3,0 cm mỗi năm trong thập kỷ qua Tính đến cuối thế kỷ 21, nhiệt độ ở Việt Nam sẽ tăng khoảng 2,30C và mực nước biển tăng 75 cm tính theo mức trung bình các năm 1980 – 1999

Đối với gen chống chịu ngập cho đến nay các nhà khoa học ở Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế đã xác định được một số các chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen có thể ứng dụng trong chọn giống, sử dụng phương pháp MABC để chọn giống chịu ngập chìm Để góp phần tạo ra giống lúa có khả năng chịu ngập chìm ứng phó với biến đổi khí hậu trong thời gian tới,

ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sản xuất, chúng tôi thực hiện đề tài: ―Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm”

Đề tài được đề ra với mục tiêu cụ thể sau:

- Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại để quy tụ

gen chịu ngập (Sub1) đã được xác định trước vào giống lúa năng suất cao đang được trồng

phổ biến ở Việt Nam với thời gian ngắn đáp ứng nhu cầu giống trong sản xuất

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu

- Giống lúa cho gen: IR64Sub1 là giống chịu ngập chìm là Giống lúa chống chịu ngập đầu tiên tại Philippines đã được công nhận trong cuộc Họp Hội đồng thư ký lần thứ 27 ngày 7 tháng 7 năm 2009

- Giống lúa nhận gen: AS996 là giống lúa chất lượng cao được bộ Bộ môn Di truyền

chọn giống Viện nghiên cứu Lúa ĐBSCL, được công nhận giống chính thức theo Quyết định

số 5310 QĐ/BNN-KHCN, ngày 29 tháng 11 năm 2002 của Bộ Nông Nghiệp & PTNT

- Một số giống lúa đang được trồng phổ biến ở Việt Nam như Q5c, Q5l, OM5472, FL478, IR64SUB1, AS996, KDDB, BT

2.1.2 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm

- 372 chỉ thị SSR phân bố rải rác trên12 NST (phụ lục 1)

- Các vật tư, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng (phụ lục 2)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp lai hữu tính đối với các giống lúa cho và nhận gen kháng Kết hợp với phương pháp lai trở lại để chọn lọc và làm thuần nhanh những dòng mang gen kháng và nền gen tối đa của giống nhận gen

- Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB cải tiến

- Chọn lọc cây con mang gen kháng thông qua phương pháp PCR đối với các chỉ thị

SSR liên kết với QTL quy định tính chịu ngập chìm (Sub1) Chọn lọc nền gen thông qua

phương pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa

- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide

- Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc

- Điện di trên gel polyacrylamide không biến tính 6% nhuộm Syber safe

- Phân tích dữ liệu trên chương trình Graphical Genotyper (Van Berloo, 2008)[89] Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ADN TỔNG SỐ

Tách chiết ADN là bước đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bước nghiên cứu tiếp theo Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB Nồng độ và

độ tinh sạch của ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng với ADN chuẩn Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím

Hình 3 Kết quả kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB trên gel agarose 0,8%

Giếng số 1: Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/l), Các giếng từ 2 -17: ADN mẫu nghiên cứu

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

16 17

Kết quả tách chiết ADN cho thấy phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB cho hiệu

quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch Nồng độ trong khoảng từ 200 – 300ng/l khi so sánh với lambda ADN chuẩn nồng độ 200ng/l giếng số 1 Các mẫu ADN không bị đứt gãy, việc loại bỏ RNA bằng RNase tiến hành khá tốt thể hiện các băng điện di gọn, rõ Những mẫu ADN này đủ điều kiện để sử dụng cho những thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo

3.2 KHẢO SÁT ĐA HÌNH GIỮA HAI GIỐNG BỐ MẸ

Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR

Giống IR64Sub1 có mang gen chịu ngập Sub1 Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có

thể sử dụng để phát hiện gen chịu ngập trong các cá thể con lai tiến hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúa 1.Q5c; 2.Q5l; 3.OM5472; 4 IR64Sub1; 5.FL478; 6.KDDB; 7.AS996, 8 BT Sử dụng 372 chỉ thị SSR trên 12 nhiễm sắc thể kết quả có 53 chỉ thị cho băng đa hình giữa giống AS996 và IR64Sub1 được nêu ở bảng 7

Bảng7 Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống cho và nhận gen chịu ngập

Để lựa chọn gen đích (Sub1) tiến hành khảo sát một nhóm chỉ thị nằm ở vị trí của gen và

về hai phía của gen Sub1 trên nhiễm sắc thể số 9 Đã xác định được hai chỉ thị là ART5 và SC3

cho đa hình Hai chỉ thị này liên kết rất chặt với gen Sub1 Chỉ thị ART5 được thiết kế từ vùng promoter của gen Sub1 ở vị trí 6,3 Mb và chỉ thị SC3 ở ở vị trí 6,6Mb trên nhiễm sắc thể số 9

Sau đó, để lựa chọn các cá thể tái tổ hợp tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho đa hình trên

nhiễm sắc thể số 9, những chỉ thị này nằm về hai phía của gen Sub1 có khoảng cách gần nhất là

1,8 Mb ở đầu trên tại vị trí của R9M10 và 2,8Mb ở đầu dưới tại vị trí của RM24013 so với gen

Sub1 (vị trí của gen Sub1 là 6.3–6.6 Mb hoặc 4.4–6.8 cM) (Xu et al 2006)[93]

Những mồi cho đa hình trên các nhiễm sắc thể còn lại không liên kết với gen Sub1

được sử dụng để kiểm tra nền di truyền của giống nhận gen Kết quả đánh giá đa hình được tổng kết lại ở bảng 8

Bảng 8 Các bước chọn lọc sử dụng chỉ thị SSR cho đa hình trong các quần thể lai trở lại

hợp RM257, RM215, RM296, R9M30

3 Lựa chọn nền di

truyền cây nhận gen

RM6, RM17, RM18, RM60, RM109, RM124, RM149, RM154, RM206, RM224, RM228, RM237, RM311, RM287, RM300, RM307, RM310, RM341, RM6318, RM7558, RM10115, RM7102, RM25271, SO6061, SO6065A, SO7053, S1117C, SO1132A, R4M13, R4M17, R5M20, RM7075, SO3068, RM3367, RM3867, RM437, RM508, RM19840, RM3635, RM337, RM7102

3.3 QUY TỤ GEN CHỊU NGẬP CHÌM SUB1 VÀO GIỐNG LÚA AS996

Sub1 là SC3, ART5 Kết quả kiểm tra xác định cá thể mang gen được minh họa ở hình 10

Trong tổng số 22 cá thể F1 được đánh số từ 1-22 tương ứng từ giếng số 3 đến giếng số

24, ghi nhận có 11 mẫu ADN của 11 cá thể có mang 2 băng: 1 băng đặc trưng cho AS996, một băng đặc trưng cho IR64Sub1 là các cá thể số: 4, 5, 6, 7, 9, 16, 17, 19, 20, 21, 22 Các cá thể này được chọn làm mẹ để tiến hành lai trở lại với giống nhận gen tạo thế hệ BC1F1

3.3.2 Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC 1 F 1

Dựa trên bản đồ vùng QTL chịu ngập thì chỉ thị tốt nhất trong khu vực Sub1 là ART5 được thiết kế từ vùng promoter của gen và SC3 được thiết kế ở phía dưới của gen Sub1 trên

NST số 9 được sử dụng để lựa chọn những cá thể mang gen Phản ứng PCR được tiến hành giữa ADN các giống lúa AS996, IR64Sub1 và các con lai với hai chỉ thị trên

Tổng số 497 cá thể của quần thể BC1F1 được tiến hành tách chiết ADN và

kiểm tra sự có mặt của gen đích (Sub1) bằng hai chỉ thị liên kết chặt là ART5 và SC3 Kết

quả được minh họa ở hình 11 và 12

Kết quả trên hình 11 thể hiện khi phân tích các cá thể BC1F1 với chỉ thị SC3 những cá

thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 49 và giống cho gen ở giếng số

50 là các giếng số 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 18, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 42,

44, 48

Giếng số 5, 11, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 41, 46, 47 chỉ mang băng của giống nhận gen, những cá thể này không mang gen kháng được loại bỏ ở các bước sàng lọc sau

Hình 11 Kết quả sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 (AS996/IR64Sub1) với

chỉ thị SC3 Giếng 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể

BC 1 F 1 Giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1

Hình 12 Kết quả sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị

ART5.Gi ếng 1, 50: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3:IR64Sub1, 4-49:

Kết quả trên hình 12 thể hiện khi phân tích các cá thể BC1F1 với chỉ thị ART5 những

cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 2 và giống cho gen ở giếng số

3 là các giếng số 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24,26, 27, 33, 34, 39, 45, 47, 48

Kết quả thu đƣợc 165 cá thể BC1F1 dị hợp tử với cả hai chỉ thị ART5 và SC3 Những

cá thể dị hợp tử mang cả hai băng của giống nhận gen và giống cho gen với cả hai chỉ thị ART5 và SC3 đƣợc lựa chọn để chọn lọc các cá thể tái tổ hợp Sàng lọc cá thể tái tổ hợp từ

165 cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho đa hình trên nhiễm

sắc thể số 9

Kết quả phân tích để sàng lọc cá thể tái tổ hợp trên NST 9

Sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM23662 ở hình 13 cho thấy cá thể tái tổ hợp

mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 44 và giếng số 46

Sàng lọc các cá thể BC1F1với chỉ thị RM240113 ở hình 14 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 14, 27, 34, và giếng số 46

Tương tự sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM7175 ở hình 15 cho thấy cá thể tái

tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 2, 6, 10, 11, 14, 15, 16, 18, 20, 24,

27, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 42 và giếng số 46

Sử dụng 10 chỉ thị lựa chọn được tổng số 14 cá thể tái tổ hợp, trong đó 5/14 cá thể tái tổ hợp mang trao đổi chéo tại vị trí của R9M10 và RM24013; 9/14 cá thể tái tổ hợp tại

1 đầu của NST tại vị trí của RM24013 Kết quả này đã xác định được đoạn trao đổi chéo

mang gen Sub1 ở cả hai đầu trên và dưới của gen Sub1 đã được chuyển vào các dòng BC1F1 Kết quả 14 cá thể tái tổ hợp được lựa chọn để tìm cá thể mang nền di truyền cây mẹ lớn nhất

là các cá thể số 5, 6, 39, 62, 63, 103, 153, 166, 215, 327, 340, 412, 422, 428

Đối với thế hệ BC1F1, tổng số 26 chỉ thị cho đa hình không liên kết với gen

Sub1 trên 11 nhiễm sắc thể còn lại để lựa chọn nền di truyền của cây nhận gen

Số liệu của từng cá thể được đưa vào phân tích trên chương trình Graphical Genotyper để lựa chọn Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ được lựa chọn để lai tạo thế hệ BC2F1 Kết quả được nêu ở bảng 10, hình 16, và hình 17

Bảng 10 Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 14 cá thể BC 1 F 1 tái tổ hợp

Cây số 5 6 39 62 63 103 153 166 215 327 340 412 422 428

A 66.67 54.17 62.50 41.67 54.17 45.83 58.33 45.83 66.67 58.33 66.67 72.00 75.00 72.00

H 25.00 45.83 37.50 58.33 45.83 33.33 41.67 54.17 33.33 41.67 33.33 24.00 25.00 24.00

R% 79.17 77.08 81.25 70.83 77.08 62.50 79.17 72.92 83.33 79.17 83.33 84.00 87.50 84.00

Từ kết quả trên cho thấy 14 cá thể tái tổ hợp có mang gen Sub1 và chứa tối đa

nền gen của giống nhận gen từ 62,5% đến 87,5% Các cá thể có nền di truyền cao nhất là P422 với 87,5% ngoài ra còn có các cá thể P412 (84%) P428 (84%), P215 (83,33) và P39 (81,25)

Kết quả đã lựa chọn được 5 cá thể BC1F1 có mang vùng gen Sub1 và chứa tối đa nền

gen của giống nhận gen (R%) trong khoảng từ 80 - 86% để tiếp tục lai tạo thế hệ BC2F1 Gen Sub1 là một trong những gen chính quy định tới 70% tính chống chịu ngập chìm trong hầu hết các giống lúa đã được các nhà khoa học IRRI thử nghiệm từ trước tới nay

3.3.3 Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC 2 F 1

Từ 5 cá thể BC1F1 được lựa chọn đã lai tạo được quần thể thế hệ BC2F1 với

506 cá thể Tiến hành tách chiết ADN, làm phản ứng PCR với các bước như ở thế hệ BC1F1 Kết quả được minh họa ở hình 18 và hình 19

Khi phân tích các cá thể BC2F1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống cho gen và giống nhận gen là giếng số 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19,

22, 25, 27, 29, 31, 35, 36, 39

Những giếng còn lại các cá thể chỉ cho 1 băng của giống nhận gen là AS996 những cá

thể này không mang gen Sub1

Khi phân tích các cá thể BC2F1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng

của cả giống là giếng số 3, 5, 10, 16, 18, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

42, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 60, 61

Những giếng còn lại mang băng của AS996

Hình 18 Sàng lọc các cá thể BC 2 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3

Hình 19 Sàng lọc các cá thể BC 2 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5

Sau bước sàng lọc gen đích với hai chỉ thị ART5 và SC3 để kiểm tra sự có mặt của gen đích Sub1 trong các cá thể con lai thu được 245 cá thể dị hợp tử mang hai băng của

cả giống cho và nhận gen

Sau đó,Tiến hành chọn lọc các cá thể tái tổ hợp bằng 10 chỉ thị kề hai bên gen Sub1

trên nhiễm sắc thể số 9 được nêu ở bảng 8 với 245 cá thể mang gen Kết quả được minh họa