Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng cung

Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng cung Phạm Huy Cường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm;

Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng

cung Phạm Huy Cường

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Đô

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Xác định biểu lộ của IL-2 và TNF-α ở mức độ mARN và protein của tế bào

lympho nuôi cấy in vitro của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và người bình thường về lâm sàng với hai liều thuốc khác nhau Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol Cần phải tăng số mẫu nghiên cứu để

có thể đánh giá chính xác Thử tác dụng thuốc ở liều lượng khác nhau hơn Xây dựng

mô hình thực nghiệm ung thư do hóa chất để thử tác dụng miễn dịch in vitro

Keywords: Sinh học; Sinh học thực nghiệm; Miễn dịch; Cây Trinh nữ hoàng cung

Content

MỞ ĐẦU

Trinh nữ hoàng cung (THNC) là một loại cây thuốc được sử dụng là thuốc cổ truyền ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới TNHC (Crinium latifolium (L.) đã được dùng như loại thuốc y học cổ truyền để điều trị các bệnh Viêm khớp dạng thấp, ung thư,

lao, viêm do vi khuẩn sinh mủ

Viên nang Crila biệt dược của Nguyễn Thị Ngọc Trâm, chiết từ lá cây Trinh nữ Crila

được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học

Các phân đoạn đã chứng minh là có tác dụng tăng cường miễn dịch và chống ung thư mạnh nhất (gồm các alkaloid và flavonoid) cũng đã được chiết và làm thành viên nén có tên là

Crilin T Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro trên mô hình

bệnh nhân ung thư đã có suy giảm miễn dịch, bằng cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và thử các nồng độ thuốc khác nhau và theo dõi đáp ứng miễn dịch chống ung thư bởi các dấu ấn biểu lộ IL-2, TNFα ở mức độ ARN

và protein bằng phương pháp RT-PCR và ELISA một cách tương ứng Đề tài này nhằm mục

đích:

1 Xác định biểu lộ của IL-2 và TNF-α ở mức độ mARN và protein của tế bào lympho nuôi cấy

in vitro của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn và người bình thường về lâm

sàng với hai liều thuốc khác nhau

2 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây Trinh nữ hoàng cung

Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) còn được gọi là Náng lá rộng, Tỏi lá rộng, Tây nam

văn châu lan, Thập bát học sĩ - Crinum latifolium L., thuộc họ Náng Amaryllidaceae

TNHC là một loài có thân như củ hành tây to, đường kính 10-15 mm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài khoảng 10-15 cm, có chiều lá mỏng kéo dài từ 80-100 cm, rộng 3-8 cm, hai bên mép lá lượn sóng Gân lá song song mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá

có một có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tím Hoa mọc thành tán gồm

6-18 hoa, trên một cán dài 30-60 cm Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ

Cây TNHC có nhiều nước Đông Nam Á và Nhật bản, gồm Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào Ở Việt Nam cây mọc hoang ven suối trong rừng và cây thường phát triển mạnh ở các vùng có khí hậu nóng khô từ Đà Nẵng đến tận

mũi Cà Mau, đặc biệt là ở một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa - Vũng Tàu

Hình 1.1 Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

1.1.1 Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L

Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa học của

cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L

 Thành phần alkaloid của cây Crinum latifolium L

+ Crinum latifolium L Ấn Độ: 11-O-Acetylambelline, 11-O-Acetyl-1,2-

-epoxyambelline, Ambeline, Crinafolidine, Crinafoline, (-) 2-Epilycorine, 2-Epipancrassidine, 1,2--epoxyambelline, Hippadine (Pratorine, Alkalois N3), Latindine, Latisodine, Latisoline (Latisodine-O--D-glucopyranosyl), (-) Lycorine, (-) Lycorine-1-0--glucoside, Pratorimine, Pratorinine, Pratosine, Pseudolycorine-1-0--D-glucpside

+ Crinum latifolium L Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayne, (-) Acetyllycorine, Cherylline

(S), (+) Crinamine, (-) Crinine (Vittatine, Crinidine), Hamayne (Bulbispermine,

Demethylcrinamine), Hipeastrine, Latifine (S), Powelline, Undulatine

+ Cây TNHC Việt Nam với tên mới là Trinh nữ Crila (Crinum latifolium L.):

9-Octadecenamideb, Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine,

Crinane-3--ol, Buphannidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6-hydroxybuphannidrine,

1,2-epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one, Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O--glucopyranoside

 Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L

+ Crinum latifolium L Nhật Bản có Glucan a và Glucan b

+ Cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có 32 chất bay hơi và saponin, acid

hữu cơ, amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl, keampferol-3-4-di-O--D-glucopyranosit

1.1.2 Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam

Viên nang Crila ra đời từ cụm công trình nghiên cứu về cây TNHC của

Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự trong và ngoài nước Viên nang Crila được sản xuất từ

các alkaloid có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ lá cây TNHC, điều trị u xơ tử cung và

phì đại lành tính tuyến tiền liệt Viên nang Crila đã được Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm định lượng hàm lượng alkaloid bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) “Nghiên cứu định tính, định lượng

crinamidin trong dược liệu và viên nang TNHC bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao”

1.2 Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thƣ

1.2.1 Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư

Ung thư là bệnh ác tính được sinh ra từ các tế bào bình thường bị biến đổi Các tế bào ác tính phát triển vô hạn định và sẽ giết chết cơ thể chủ Có nhiều bằng chứng cho thấy sự đáp ứng miễn dịch chống ung thư như: một số ít ung thư tự thoái triển, có rất nhiều lympho và đại thực bào thâm nhiễm khối u, thoái lui của di căn sau khi loại bỏ các khối u nguyên phát Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cao hơn sau ức chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch (AIDS, trẻ sơ sinh,

người già, bệnh nhân ghép tạng) Hệ miễn dịch tham gia bảo vệ cơ thể bằng hai cơ chế

1.2.2 Suy giảm miễn dịch

Suy giảm miễn dịch (SGMD) hay thiếu hụt miễn dịch cũng như mọi hệ thống, ngoài sự hoạt động bình thường thì trong những trường hợp nhất định do những nguyên nhân

đã biết hay chưa biết do những tổn thương tiên phát hay thứ phát của một cấu thành nào đó

mà dẫn đến những rối loạn Cho nên, hệ thống miễn dịch có thể hoạt động một cách quá mức gây nên tình trạng quá mẫn, hay hoạt động yếu không đạt yêu cầu gọi là thiểu mẫn, thiểu năng

miễn dịch hay suy giảm miễn dịch (SGMD)

1.2.3 Ung thư vòm mũi họng

Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là bệnh đứng hàng đầu trong các ung thư khu vực tai mũi họng - đầu mặt cổ UTVMH là bệnh mang đặc điểm vùng Trên thế giới hình thành 3

khu vực địa lý, ở tỷ lệ mắc bệnh hoàn toàn khác nhau

1.3 Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch

Tình trạng suy giảm miễn dịch có thể gặp ở hầu hết các loại bệnh lý do đó phạm vi chỉ định dùng thuốc kích thích miễn dịch rất rộng rãi Vì vậy từ khi phát hiện ra chất kích thích miễn dịch thì các nghiên cứu về chúng phát triển cả về chiều rộng lẫn chiều sâu

1.3.1 Vai trò của các cytokin

Một hệ thống phức tạp như hệ thống miễn dịch muốn hoạt động được cần phải có sự tương tác giữa các tế bào Để thực hiện được sự tương tác, các tế bào đó phải nhận biết được

và truyền đi các thông tin, với vai trò trung gian của các thụ thể Các thông tin được mang tới bởi những protein hay peptid rất nhỏ gọi là cytokin

1.3.2 Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư

1.3.2.1 Interleukin-2 (IL-2)

Năm 1976 một lymphokin gây phân bào giúp cho lympho bào tăng sinh và duy trì trong các mẫu nuôi cấy lympho T bình thường gọi là IL-2 IL-2 là một polypeptide có 133 acid amin và TLPT khoảng 15kD do tế bào Th1 hoạt hóa sản xuất ra

1.3.2.2 Yếu tố hoại tử u - Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα)

TNFα được sản xuất chủ yếu bởi đại thực bào sau đó đi vào máu rồi đến các mô và cơ quan khác, TNFα còn được tổng hợp trong các tế bào giết tự nhiên (NK), các tế bào u hắc tố

và một vài dòng tế bào ung thư

1.3.3 Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch

Trên thực tế cũng như lâm sàng levamisole đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng Đến nay levamisol vẫn là thuốc kích thích miễn dịch cổ điển mà các nghiên cứu đã làm sáng tỏ mọi vấn đề về cơ chế tác dụng, công thức hóa học, cấu trúc phân tử Vì vậy, Levamisol được

sử dụng trong thực nghiệm nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi in vitro của công trình này,

với vai trò là chứng dương

1.3.4 Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC

Một số alkaloid của TNHC: Crinafolin và crinafolidin đã được Ghosal (1985) thử nghiệm với tế bào ung thư và cho kết quả tốt

Phan Thị Phi Phi và cs (2003), sử dụng mô hình chiếu xạ bán cấp để đánh giá khả năng phục hồi tế bào lympho T, NK cả về số lượng và chức năng tiết 2 cytokin IL-2 và TNFα của viên Crila cho thấy: Viên Crila kích thích khả năng hồi phục tế bào lympho T, NK về cả

số lượng và chức năng tiết

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2012 đến tháng 12/2012

 Các mẫu máu bệnh nhân được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội

 Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào, thu dịch nổi, chiết tách ARN và phân tích được tiến hành tại

Phòng thí nghiệm của Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà nội

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Bệnh nhân

10 ml máu được lấy từ bệnh nhân UTVMH giai đoạn trước điều trị tia xạ, hóa chất

nằm tại khoa xạ 1 và xạ 3, Bệnh viện K Hà Nội từ tháng 3/2012, tuổi từ 12 đến 78 tuổi

2.2.2 Người bình thường

10 ml máu được lấy từ người khỏe mạnh về lâm sàng, tuổi từ 20 đến 60 là cán bộ, sinh

viên trường Đại học Y Hà Nội

2.2.3 Vật liệu nghiên cứu

Thuốc viên nén Crilin T hàm lượng 250 mg/viên, được cung cấp bởi Nguyễn Thị

Ngọc Trâm, Công ty Thiên dược, Bình Dương, Việt nam

2.3 Phương pháp nghiên cứu

 Nuôi cấy tế bào lympho

 Đếm số lượng bạch cầu và dòng bạch cầu lympho

 Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy

 Tổng hợp cADN

 Kỹ thuật RT-PCR

 Kỹ thuật ELISA định lượng IL-2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào lympho

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kiểm tra chất lượng ARN chiết tách được

Chúng tôi kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR với mồi của gen B2M thì vẫn cho kết quả dương tính với các băng đậm rõ nét (Hình 3.1A) Như vậy việc xác định sự biểu lộ các gen

IL-2 và TNFα bằng phản ứng RT-PCR có độ nhạy cao là khả quan

3.2 Phản ứng RT-PCR đơn mồi của gen B2M, IL-2 và TNFα

Các cặp mồi này đều được khuếch đại đơn mồi với các tế bào dòng CTLL-2 (IL-2) và L929 (TNFα), chúng đều được thử điều kiện tối ưu và cho kết quả dương tính với 01 băng duy nhất cho

mỗi gen nghiên cứu và gen nội chuẩn B2M (Hình 3.1 A, B, C)

Hình 3.1 RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL-2 và TNFα ở các tế bào dòng

chuẩn

3.3 Phản ứng RT-PCR đa mồi của gen B2M với IL-2/TNFα

Các cặp mồi sẽ được khuếch đại đồng thời và tránh được sự gắn mồi không đặc hiệu

và tạo ra nhiều sản phẩm không mong muốn Kết quả cho thấy không có băng không đặc hiệu (Hình 3.2 A và 3.2 B)

Hình 3.2 Hình ảnh PCR đa mồi của cặp gen nội chuẩn

Với kết quả này, PCR đa mồi sẽ được dùng để xác định sự biểu lộ gen IL-2 và TNFα ở

các mẫu nuôi cấy lympho bào của người bình thường và bệnh nhân ung thư vòm

3.4 Sự biểu lộ IL-2 ở mức độ mARN của lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với

thuốc thử

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho người bình thường nuôi cấy

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho nuôi cấy của bệnh nhân ung

thư vòm mũi họng

Cả bệnh nhân và người thường đều cho kết quả như nhau và điều đặc biệt là Crilin T cho kết quả kích thích tăng tiết IL-2 cao hơn so với chứng dương và chứng âm Để đánh giá

sự tiết IL-2 của bệnh nhân so với người thường bằng RT-PCR (Hình 3.3 và Hình 3.4) có khác nhau hay không thì không phải dễ vì hình ảnh có độ phân dải, đậm nhạt khác nhau Cần phải

đối chiếu với kết quả ELISA, sẽ bàn luận sau

3.5 Sự biểu lộ mARN của TNFα ở lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho người bình thường nuôi

cấy

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho bệnh nhân ung thư vòm

mũi họng nuôi cấy

Sản phẩm của phản ứng RT-PCR đối với biểu lộ mARN TNFα ở lympho bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng chỉ ra trong Hình 3.6 Các băng của B2M cũng tương đương

nhau, trong khi đó ở hai nồng độ Crilin T đều cho biểu lộ nhiều hơn so với nhóm chứng

Nếu so sánh sự biểu lộ mARN của TNFα ở bệnh nhân và người thường thì thấy rằng Crilin T làm tăng biểu lộ TNFα ở cả 02 nhóm lympho bào người bệnh và người bình thường Đây là tín hiệu cho thấy rằng thuốc có tác dụng tốt trong việc kích thích miễn dịch Điều này

sẽ được chứng minh ở mức độ protein

3.6 So sánh biểu lộ protein của gen IL-2 ở dịch nuôi cấy lympho bào đƣợc xác định bởi ELISA

Hình 3.7 So sánh sự biểu lộ IL-2 của Levamisol với chứng âm ở bệnh nhân (p=0,045)

Trong 9 mẫu nuôi cấy lympho bào của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Hầu hết Levamisol có tác dụng tăng tiết IL-2, tuy nhiên vẫn chưa cao hơn nhiều so với nhóm chứng

âm (Hình 3.7) Kết quả này cũng phù hợp với kết quả RT-PCR ở trên Điều này cho thấy sự

biểu lộ ở hai mức độ mARN và protein là đồng biến Sự khác biệt này có ý nghĩa thông kê p<0,05

Hình 3.8 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở tế bào bệnh nhân in vitro

(p= 0,14)

Hình 3.9 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy in vitro tế

bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39)

Hình 3.10 So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro

(p=0,23)

Khi so sánh sự biểu lộ IL-2 ở lympho bào bệnh nhân với các nồng độ Crilin T với

levamisol, cho thấy 6/9 mẫu liều thấp và 7/9 (77.7%) mẫu liều cao có sự biểu lộ cao hơn so với Levamisol (Hình 3.8 và hình 3.9) Với tỷ lệ này, chứng tỏ Crilin T có tác dụng kích thích miễn dịch cao hơn Levamisol Khi xem xét các liều thuốc Crilin T khác nhau, liều thấp cho đáp ứng khá hơn so với liều cao (Hình 3.10) Tuy nhiên, những sự khác biệt này đều không có ý nghĩa thống kê, do cỡ mẫu còn thấp Các kết quả này cũng phù hợp với sự biểu lộ mARN phát hiện

bằng RT-PCR

Vì đối tượng nghiên cứu là máu của những bệnh nhân ung thư vòm họng giai đoạn muộn hay người bình thường đã khác nhau về di truyền học, do đó khả năng đáp ứng của các

tế bào lympho nuôi cấy với các tác nhân sinh học có thể khác nhau, sẽ cho kết quả khác nhau Đối với đối tượng người thường, chúng tôi thu được kết quả như sau: Nhóm chứng có biểu lộ tốt, Levamisol cao hơn chứng âm (Hình 3.11), liều thấp và cao kích thích cao hơn Levamisol (4/5) (Hình 3.12 và hình 3.13) và liều cao lại cho biểu lộ cao hơn liều thấp (Hình 3.14) Tuy nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

Hình 3.11 So sánh sự biểu lộ Il-2 của lympho được kích thích bởi Levamisol với

chứng âm ở người thường (p=0,18)

Hình 3.12 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người

thường in vitro (p=0,42)

Hình 3.13 So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người

thường in vitro (p=0,30)