Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam

Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam Abstract: Tổng quan về G protein; họ tachykinin ở động vật có vú; thụ thể họ tachykinin và th

Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam

Abstract: Tổng quan về G protein; họ tachykinin ở động vật có vú; thụ thể họ tachykinin

và thụ thể neurokinin-1; ứng dụng của thụ thể neurokinin-1 trong điều trị bệnh; vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Trình bày nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: Tách RNA tổng số; phản ứng phiên mã ngược; phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction); Tinh sạch DAN bằng phương pháp thôi gel; nối ghép các đoạn DNA vào vector; kỹ thuật biến nạp; sàng lọc khuẩn lạc; tách plasmid kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn; ký thuật điện di; phân tích trình tự cDnA của cDNA-NK1 Đưa ra kết quả và thảo luận: Tách dòng gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ phổi người; thiết kế

vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Người Việt Nam; Thụ thể

neurokinin-1; Cấu trúc protein

Content

MỞ ĐẦU

Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein Khi thụ thể này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về trung ương thần kinh, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt khác chúng cũng có tác dụng gây kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của

cơ thể

Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh nhân ung thư, … Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam còn rất

ít hoặc chưa được công bố Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hoàn chỉnh

mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật để có

thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam,

chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam” Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh

học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein và Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN

1.1.1 G protein

G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cứu tác động của adrenaline đối với tế bào Với công trình này, hai ông đã giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4]

G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào

1.1.2 Thụ thể liên kết với G protein

Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine, chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức năng [52]

1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ

Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong cơ thể của tất cả các loài động vật Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không xương và có xương sống [15, 45]

Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi Euler và Gaddum khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn Dịch chiết này có tác dụng kích thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm huyết áp ở thỏ [21] Tuy nhiên, rất nhiều thí nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công Bốn mươi năm sau đó (năm 1970), Chang và Leeman mới tinh sạch được SP từ vùng dưới đồi

của bò [14] và đến năm 1973, Studer và cộng sự đã phân lập, tinh sạch SP, đồng thời giải trình tự gene mã hóa cho SP từ ruột ngựa [50] Năm 1983, Kangawa và Kimura đã phân lập được thêm hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP là neurokinin A (NKA) và neurokinin B (NKB) từ vùng thần kinh trung ương và ngoại vi [31, 33] Hiện nay, tachykinin trong mô động vật có vú đã được xác định gồm có chất P (hay SP), neurokinin A (hay neuromedin L hoặc chất K) và neurokinin B (hay neuromedin K) Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng là neuropeptide

K và neuropeptide γ

1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1

1.3.1 Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin

Thụ thể của họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với G protein (Hình 1) Tương tự như thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 vùng xuyên màng đặc trưng được nối với nhau bởi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh chất (exoloop và cytoloop) Những vòng ở phía ngoài màng tế bào của thụ thể liên kết với G protein có chức năng lựa chọn cấu tử gắn đặc hiệu trong khi các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoạt tính của thụ thể Người ta phân loại TACR dựa vào sự sai khác trong các trình tự này [45]

1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH

Từ những hiểu biết về chức năng của thụ thể neurokinin 1 hứa hẹn đây sẽ là đích tác động hiệu quả cho các phương pháp điều trị một số căn bệnh có liên quan Do đó cũng không có gì ngạc nhiên khi nhiều hãng dược phẩm lớn tập trung nghiên cứu về thụ thể tachykinin nhằm tìm ra các chất đối vận của chúng để ứng dụng trong điều trị bệnh: làm thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm cảm, chữa các bệnh đường hô hấp,… Sự phát hiện ra các chất đối vận với thụ thể NK1 cũng là một mắt xích quan trọng trong việc thay đổi hướng điều trị trong việc ngăn ngừa chứng buồn nôn

và sự nôn mửa do tác dụng của hóa trị liệu ung thư Tuy đến nay các nghiên cứu về chất đối vận với thụ thể tachykinin vẫn chưa đạt được kết quả như mong đợi và gặp rất nhiều khó khăn, nhưng việc sử dụng thụ thể NK1 làm đích tác động của thuốc vẫn là một bài tóan hay và khó cho nhiều nhà nghiên cứu Trong đó các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào những phân tử không có bản chất peptide có khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thần kinh Trong tương lai, chất này hứa hẹn sẽ cho phép điều trị bệnh liên quan tới chứng nghiện rượu [13], …

1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1

Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein được dung hợp vào nhiều hệ vector và nhiều dòng tế bào khác nhau Người ta đã thử biểu hiện chúng trên cả tế bào nhân sơ và cả trên tế bào nhân thực Tuy nhiên, do thụ thể liên kết với G protein thường được biến đổi sau dịch mã bằng cách gắn thêm carbonhydrate hoặc lipid hóa… nên việc biểu hiện trên hệ thống tế bào nhân

sơ thường không cho kết quả như mong muốn

Theo các nghiên cứu đã công bố, NK1 được biểu hiện trong vector pCDNA [24], pMAM-neo [24; 28], pVLl393 [32], pAHygCMV1 [49]… ở các chủng tế bào HEK293, COS-7, CHO, … đều cho kết quả khả quan Một nghiên cứu gần đây năm 2006 của Farahdiba và cộng sự khi nghiên cứu truyền tin của thụ thể β-arrestin 1 đã tiến hành dung hợp gen mã hóa cho thụ thể này với gen mã hóa cho NK1 và biểu hiện chúng trong hai hệ vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1 cũng cho kết quả tốt Đây là tiền đề cho chúng tôi lựa chọn và thiết kế vector biểu hiện pCDNA3

và pEGFP-N1 trong đề tài

pCDNA3 và pEGFP-N1 là vector biểu hiện ở tế bào động vật với các đặc điểm được trình bày trong phụ lục

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

Mẫu phổi tươi của người bị ung thư phổi được cung cấp bởi Viện Quân Y 103 (kí hiệu H211 lấy ngày 25/1/2011)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Tách RNA tổng số Mẫu phổi tươi

Tổng hợp cDNA

Khuếch đại đoạn 3’-NK1 Khuếch đại đoạn 5’-NK1

Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã hóa cho

thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƯỜI

3.1.1 Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người

RNA tổng số từ mẫu phổi tươi được tách chiết bằng kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit

(Bioneer) Sau đó, cDNA được tổng hợp nhờ phản ứng phiên mã ngược sử dụng RNA tổng số và mồi hexamer Thành phần và điều kiện của phản ứng tổng hợp cDNA được trình bày trong Bảng

dNTPs (10 mM) 2.5

AMV RTase 3.0 - Kéo dài: 370 trong 90 phút

- Bất hoạt enzyme: 850 trong 5 phút

Sản phẩm cDNA được bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

3.1.2 Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Đoạn cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 sẽ được tách dòng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và đoạn 3’-NK1 Hai đoạn này sau đó sẽ được nối với nhau để tạo nên cDNA hoàn chỉnh như sơ đồ Hình 6

Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1

Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA được tổng hợp từ phản ứng phiên

mã ngược để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1 Thành phần

và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 10

Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

72 0 C, 10 phút

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose Kết quả điện di cho một băng DNA có kích thước xấp xỉ 800 bp (Hình 7) Đây là kích thước đúng với tính toán cho đoạn 5’-NK1

Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1 Giếng ĐC: đối chứng âm không có cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để chuẩn bị cho phản ứng tách dòng đoạn 5’-NK1 của cDNA

3.1.3 Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Tuy nhiên, sản phẩm PCR gồm các băng DNA không đặc hiệu và không có băng DNA với kích thước 728 bp như mong đợi (Hình 8)

Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1 Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500 Lặp lại phản ứng nhiều lần và thay đổi các điều kiện về nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,… chúng tôi vẫn không thu được băng mong muốn Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện phản ứng phiên mã ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số Thành phần và điều kiện của phản ứng phiên mã ngược được thực hiện như trong Bảng 11, chỉ thay đổi mồi hexamer bằng mồi oligoT Sau đó, cDNA này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 11

Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

đoạn 3’–NK1 Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sạch đoạn 3’-NK1

Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại

đoạn 3’-NK1 Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn

SY-100

3.1.4 Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Sau khi đã tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng phản ứng nối sử dụng kit Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas) Thành phần của phản ứng

nối được trình bày trong Bảng 12

Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1 vào vector pJET1.2

Sau đó, từng hỗn hợp nối được biến nạp vào dòng tế bào khả biến E.coli DH5α Với mỗi đĩa môi

trường thạch chứa kháng sinh để sàng lọc các khuẩn lạc nhận plasmid tái tổ hợp, chúng tôi chọn

8 khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chèn bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

Để kiểm tra đoạn chèn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 13

Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 5’-NK1

của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

788 bp

Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1 Giếng 1-8

lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có khuôn; M: thang chuẩn SY-500

Tương tự như sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chúng tôi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R Thành phần

và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 14

Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1

của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 11) Kết quả cho thấy 5 trong 8 khuẩn lạc (số

2, 4, 6, 7, 8) đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 3’-NK1 Như vậy, chúng tôi đã tách dòng thành công đoạn 3’–NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Chúng tôi kí hiệu năm khuẩn lạc này là 3’-NK1-1 đến 3’-NK1-5

728 bp

Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp mồi

NK1 F1/ NK1 R Giếng 1-8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng

âm không có khuôn; M: thang chuẩn SY-500

3.1.5 Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1

Quá trình tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được trình bày trong Hình 12

Hình 12 Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1

Đầu tiên chúng tôi chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tách chiết các plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1 Plasmid này được kí hiệu p5’-NK1-2 và p3’-NK1-6 Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi

NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1.2 Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 15

Bảng 15: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 trong vector tái tổ hợp

- Thời gian tổng hợp sau cùng:

Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1 R Giếng

1: sản phẩm PCR bằng cặp mồi pJET R/NK1 R; ĐC: mẫu đối chứng âm không có DNA khuôn; M: thang chuẩn SY-100

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) và được cắt bởi hai

enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghép nối với đoạn 3’-NK1 Tiếp theo, chúng tôi cũng tiến hành cắt vector tái tổ hợp p3’-NK1-6 với hai enzyme XbaI/ SmaI Thành phần phản ứng cắt

được trình bày trong Bảng 16

Bảng 16: Thành phần cắt và điều kiện cho phản ứng cắt với hai enzyme XbaI/SmaI

99

7