Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau

Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau Ngô Thị Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng

Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ

vector khác nhau

Ngô Thị Hà

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Võ Thị Thương Lan

Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Hệ thống hóa các vấn đề cần nghiên cứu: tổng quan về tình hình kháng kháng

sinh; Peptide kháng khuẩn (AMPs); Sản xuất cecropin theo con đường tái tổ hợp Trình bày nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: nguyên liệu; phương pháp Đưa ra một số kết quả nghiên cứu: tách dòng (subclone) chuyển các gen cecropin vào các vector biểu hiện; biểu hiện các cecropin

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Hệ Vector; Cecropin; Kháng kháng sinh; Sinh y

Content

Nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011, tổ chức Y tế Thế giới WHO đã đưa ra chủ đề

“Chống kháng kháng sinh: không hành động hôm nay, không còn thuốc chữa mai sau” nhằm thức tỉnh cộng đồng về vấn đề vi sinh vật kháng thuốc đang đe dọa toàn cầu Chống kháng kháng sinh không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên cấp bách, đòi hỏi nỗ lực tổng hợp giúp nhân loại tránh nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh

Cho đến nay, các giải pháp đưa ra nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh chưa phát huy tác dụng như mong đợi Trong khi hướng phát triển các loại kháng sinh mới đang trong tình trạng bế tắc, các nhà khoa học đã tìm ra một nguồn kháng sinh tự nhiên đầy tiềm năng, đó là các peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides, AMPs) Trong số các peptide này, cecropin chủ yếu được tách chiết từ côn trùng, có phổ kháng khuẩn rộng và có nhiều tiềm năng ứng dụng nên thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

Để sản xuất AMPs nói chung và cecropin nói riêng, có ba con đường tiếp cận chính là (1) tách chiết từ tự nhiên (2) tổng hợp trực tiếp từ các axit amin theo con đường hóa học và (3) biểu hiện protein tái tổ hợp Tuy nhiên, với yêu cầu thu được lượng lớn cecropin tinh khiết, hai phương pháp đầu đều có giá thành cao và khó áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển như Việt Nam Vì vậy, với mong muốn giảm chi phí và chủ động trong việc sản xuất cecropin được phân lập từ côn trùng ở Việt Nam cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi

tiến hành đề tài “Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau” Đây là

một hướng nghiên cứu còn khá mới ở Việt Nam nhưng hứa hẹn nhiều triển vọng Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y và Phòng Genomic, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Kháng kháng sinh là hiện tượng vi sinh vật (virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng) có khả năng vô hiệu hóa tác dụng của thuốc kháng sinh mà trước đó chúng vẫn mẫn cảm [63, 79] Khi các loại thuốc mất tác dụng điều trị, vi sinh vật gây bệnh vẫn tồn tại và phát triển khiến bệnh lây lan nhanh ra cộng đồng thành dịch bệnh rất khó kiểm soát Đặc biệt các nước nghèo và các nước đang phát triển phải đối mặt với hậu quả vô cùng nghiêm trọng do gánh nặng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền Thực trạng kháng kháng sinh đã, đang và sẽ là vấn đề mang tính toàn cầu, thách thức toàn nhân loại Điều này đã được Tổng giám đốc WHO Margaret Chan nhận định nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011: “Một trong những mối quan ngại hàng đầu trong việc chăm sóc sức khỏe y tế hiện nay chính là tình trạng bệnh kháng thuốc kháng sinh Đây chính là nguy

cơ hàng đầu gây thách thức trong công tác chăm sóc y tế và kiểm soát các bệnh truyền nhiễm, đồng thời làm tăng chi phí chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng”

Việt Nam là một trong những nước có tình trạng kháng kháng sinh cao nhất thế giới hiện nay Việt Nam cũng là nơi côn trùng có mức độ đa dạng và phong phú vào bậc nhất thế giới

Điều này có nghĩa chúng ta đang nắm trong tay nguồn gen cecropin quý giá (cecropin là một

trong những peptide kháng khuẩn điển hình, với phổ hoạt tính rộng và mang nhiều tiềm năng ứng dụng đặc biệt là tiềm năng trở thành “nguồn kháng sinh mới”) Tất cả các cơ thể đa bào đều tiến hóa qua hàng triệu năm trong môi trường có nhiều loại vi sinh vật Mặc dù thường xuyên tiếp xúc với các mầm bệnh qua những con đường khác nhau nhưng nhiều loài sinh vật vẫn không

có sự bảo vệ của kháng thể hoặc các tế bào miễn dịch Lý do mà chúng có thể tồn tại được là nhờ

hệ miễn dịch bẩm sinh tạo ra bởi hàng loạt AMPs tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Một thực tế quan trọng là các mầm bệnh vi sinh vật dường như không hình thành tính kháng với các peptide này Đây cũng chính là một trong những lý do để các nhà nghiên cứu và các hãng dược phẩm tin tưởng rằng AMPs sẽ trở thành liệu pháp chữa bệnh mới thay thế cho các loại thuốc kháng sinh dễ bị vi sinh vật gây bệnh kháng lại Trong đó đă ̣c biê ̣t phải kể tới peptide kháng khuẩn tích điện dương là cecropin Với nhiều đă ̣c điểm như phổ kháng khuẩn rô ̣ng , đích tác động đa dạng nên vi sinh vật khó hình thành tính kháng , khả năng giết tế bào ung thư cho ̣n lọc, vô ha ̣i đối với tế bào nhân chuẩn Vì vậy, cecropin đang là peptide kháng khuẩn được quan

tâm nghiên cứu hàng đầu Tuy nhiên, những nghiên cứu về cecropin được phân lập từ các loài

côn trùng ở Việt Nam còn hạn chế Trong những năm gần đây, nhóm nghiên cứu ở Phòng thí

nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã

phân lập một số gen cecropin từ nhộng, muỗi, ruồi giấm của Việt Nam Tiếp tục sử dụng các gen

cecropin đó để biểu hiện cecropin tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E coli là hướng nghiên cứu

cần thiết Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ

vector khác nhau” Ngoài ra, đề tài còn nghiên cứu với gen cecropin B được tổng hợp nhân tạo

(theo dữ liệu trên ngân hàng dữ liệu) để so sánh với cecropin từ các loài côn trùng ở Việt Nam Cecropin B được đánh giá là có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất trong số các cecropin đã được nghiên cứu Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi gồm hai bước chính: (1) tiến hành tách dòng

(subclone) chuyển gen cecropin B tổng hợp nhân tạo và gen cecropin phân lập từ các loài côn

trùng ở Việt Nam vào các vector biểu hiện và (2) nghiên cứu để biểu hiện các loại cecropin này

trong hệ thống vi khuẩn E coli

Với việc nghiên cứu về cecropin được phân lập từ các loài côn trùng ở Việt Nam, đồng thời với phương pháp thu nhận peptide mong muốn bằng con đường sản xuất protein tái tổ hợp,

đề tài “Tách dòng và biểu hiện cecropin tái tổ hợp trong các hệ vector khác nhau” mang

nhiều ý nghĩa Thứ nhất, đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về cecropin được phân lập

từ các loài côn trùng ở Việt Nam Từ đó có thể mở ra các hướng nghiên cứu nhằm đánh giá đúng tầm quan trọng nguồn gen cecropin quý giá của Việt Nam Từ nguồn gen quý này có thể được ứng dụng thực tế trong công tác chuyển gen Thứ hai, bằng phương pháp thu nhận cecropin tái tổ hợp giúp giảm chi phí, chủ động trong nghiên cứu và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam Có thể nói đây là một trong số ít nghiên cứu thu nhận peptide kháng khuẩn bằng con đường tái tổ hợp được thực hiện tại Việt Nam Cả 2 điều này đều cho thấy hướng đi của đề tài còn khá mới mẻ ở Việt Nam nhưng cũng hứa hẹn nhiều tiềm năng cho các nghiên cứu sau này

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Các hệ vector

- Các vector tái tổ hợp mang gen cecropin từ nguồn gen tái tổ hợp của Phòng thí nghiệm

Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên gồm có:

+ pJET1.2-cecH: vector pJET1.2 mang gen cecropin phân lập được từ ruồi giấm

Drosophila melanogaster

+ pJET1.2-cecN: vector pJET1.2 mang gen cecropin phân lập được từ nhộng Bombyx

mori

+ pCR2.1-cecT: vector pCR2.1 mang gen cecropin B được tổng hợp nhân tạo

- Vector nhân dòng: pBluescript II KS(+) (kí hiệu là pBS) của hãng Stratagene

- Vector biểu hiện: Vector pGEX-4T-1 của hãng GE Healthcare, vector pET-28a và vector pET-32b của hãng Novagen

2.1.2 Các chủng vi khuẩn

- Chủng tế bào E coli DH5α dùng cho việc duy trì các vector tái tổ hợp

- Chủng tế bào E coli BL21 (DE3) và E coli JM109 dùng cho việc biểu hiện protein tái

tổ hợp

2.1.3 Các cặp mồi

Các cặp mồi dùng cho nghiên cứu được trình bày trong Bảng 5 Các cặp mồi này được cung cấp bởi hãng Invitrogen

Bảng 5 Thông tin về các mồi dùng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Vai trò của cặp mồi

Oligo 1 aattcatcgatggatgaatttctcaaggatatttttct

tcgtgttcgctttggttctggctttgtcaacagtttcg

Kiểm tra sự có mặt của gen cecropin

Oligo 6 tcgaggctagcttatcctagcgctttggcttcgcct

aaaaccgcgatcgctggtccagccttgac pJET1.2 F cgactcactatagggagagcggc Nhân bản các đoạn gen cecropin từ

vector tái tổ hợp pJET1.2-cecropin

pJET1.2 R aagaacatcgattttccatggcag

T7 aatacgactcactatag Nhân bản các đoạn gen cecropin

trong vector tái tổ hợp pBS-cecropin, pCR2.1-cecropin

M13/pUC

reverse

caggaaacagctatgac

pGEX-Bam-cec

actggatccatgaatttctcaaggatatttttcgtgtt cgctttggttctggct

Nhân bản các đoạn gen cecropin để

chuyển vào vector pGEX-4T-1 pGEX F gggctggcaagccacgtttggtg Nhân bản các đoạn gen cecropin

trong vector tái tổ hợp

pGEX-cecropin

pGEX R cctctgacacatgcagctcccgg

pET28a-Eco-cec

atagaattcatgtcccctatact Nhân bản các đoạn gen cecropin để

chuyển vào vector pET-28a pET32b-

Nco-cec

attccatggcaatgaatttctcaaggatatttttcgtgtt Nhân bản các đoạn gen cecropin để

chuyển vào vector pET-32b pET 28 ggtgatgtcggcgatatagg Sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ

hợp pET-28a-cecropin và

pET-32b-cecropin

pET 28 T7 gctagttattgctcagcgg

2.1.4 Gel sắc ký ái lực Glutathione Sepharose 4B, Ni-NTA agarose

Cecropin biểu hiện dưới dạng protein dung hợp với Tag được thiết kế để thuận lợi cho quá trình tinh sạch bằng các cột sắc ký ái lực Cột sắc ký ái lực Glutathione Sepharose 4B (GE Heathcare) với chất gắn (ligand) glutathione là cơ chất của enzyme glutathione S-transferase (GST) Glutathione được gắn với chất mang là agarose 4% thông qua cầu nối 10 carbon

Glutathione Sepharose 4B được thiết kế cho quy trình tinh sạch các enzyme GST, các protein phụ thuộc glutathione và các dẫn xuất tái tổ hợp với GST được sản xuất nhờ các hệ thống vector biểu hiện chủ yếu thuộc họ pGEX Cột sắc ký ái lực Ni-NTA agarose (QIAGEN) với chất mang

là agarose 6% và chất gắn là Ni2+

có ái lực cao với poly Histidine Vì vậy, cột sắc ký ái lực này được thiết kế cho quy trình tinh sạch các protein tái tổ hợp mang đuôi dung hợp là 6xHistidine chủ yếu được sản xuất nhờ hệ thống vector biểu hiện thuộc họ pET

2.1.5 Các hóa chất và thiết bị

 Hóa chất:

- Hóa chất cho phản ứng PCR: dNTPs (Takara), Taq DNA polymerase (Fermentas), AmpliTaq Gold® DNA polymerase (Applied Biosystems)

- Các enzyme giới hạn (Fermentas, New England Biolabs), enzyme T4 DNA ligase (Fermentas, Invitrogen)

- Protease: thrombin (GE Healthcare), enterokinase (New England Biolabs)

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lubertani Broth (LB) gồm 1% trypton, 0.5% cao nấm men, 0.5% NaCl

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR: QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)

- Các loại đệm trong xử lý tế bào và tinh sạch protein dung hợp: 100 mM sodium phosphate pH 7.4 (3.1 g NaH2PO4.H2O, 10.9 g Na2HPO4, thêm H2O cho đủ 1 L), PBS (150 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate), PBS lysis (150 mM NaCl, 20 mM sodium phosphate, 1 mM PMSF, 1% Triton-X100), GST elution (50 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM glutathione reduced), His lysis (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 1 mM PMSF, 1% Triton-X100), His wash (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole), His elution (50 mM NaH2PO4, 300

mM NaCl, 250 mM imidazole), EK buffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2)

- Các hoá chất thông dụng khác như: IPTG, X-gal, PMSF, Triton X-100, SDS, ure, isopropanol, ethanol, methanol, Coomassie Brilliant Blue, sodium bicarbonate, Tris base, HCl, acrylamide, glutathione reduced, imidazole, … đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

 Thiết bị:

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y-Khoa Sinh học, Phòng Genomic-Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme-Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Phương pháp

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Toàn bộ quá trình nghiên cứu của đề tài được tóm tắt theo sơ đồ trên Hình 9

Hình 9 Sơ đồ nghiên cứu

Các bước trong sơ đồ nghiên cứu được tiến hành cụ thể như sau:

2.2.1.1 Tách dòng (subclone) các gen cecropin từ các vector nhân dòng sang vector biểu

hiện

Các gen cecH, cecN và cecT được chuyển trực tiếp từ vector nhân dòng sang các vector

biểu hiện hoặc chuyển thông qua vector nhân dòng trung gian pBS Cụ thể các bước chuyển được trình bày trong Hình 10

Hình 10 Sơ đồ thiết kế các hệ thống vector biểu hiện cecropin

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ

Có thể tóm tắt các kết quả thu được của luận văn như sau:

1 Thiết kế thành công 3 hệ thống vector biểu hiện 3 cecropin: hệ thống pGEX-4T-1

(pGEX-cecH, pGEX-cecN, pGEX-cecT); hệ thống pET 28a (pET cecH, pET

28a-cecN, pET 28a-cecT) và hệ thống pET 32b (pET cecH, pET 28a-cecN, pET 32b-cecT)

2 Biểu hiện thành công:

a CecH, cecN và cecT dưới dạng dung hợp với GST trong cả 2 chủng tế bào

biểu hiện E coli BL21 (DE3) và E coli JM109

b CecH và cecN dưới dạng dung hợp với 2 Tag His+GST trong chủng tế bào

biểu hiện E coli BL21 (DE3)

c CecH, cecN và cecT dưới dạng dung hợp với Trx trong chủng tế bào biểu

hiện E coli BL21 (DE3)

3 Xác định được trạng thái biểu hiện của các cecropin dung hợp:

a GST-cecH, GST-cecN, GST-cecT; His+GST-cecH, His+GST-cecN ở dạng thể vùi

b Trx-cecH, Trx-cecN, Trx-cecT ở dạng tan

4 Làm tan thành công các cecropin dung hợp với GST dạng thể vùi bằng SDS 0.5% và ure 8 M

5 Tinh sạch thành công các cecropin dung hợp với Trx (Trx-cecH, Trx-cecN, Trx-cecT)

và cecropin dung hợp với GST (GST-cecH, GST-cecN, GST-cecT) sau khi làm tan bằng ure 8 M Hiệu suất tinh sạch cecropin dung hợp với Tag Trx cao hơn hẳn so với Tag GST

6 Bước đầu xử lý được cecropin dung hợp bằng protease thrombin (cecropin dung hợp với GST)

Từ đó chúng tôi đưa ra hướng nghiên cứu tiếp theo như sau:

1 Chuẩn hóa điều kiện giải phóng cecropin khỏi GST và Trx bằng protease tương ứng

là thrombin và enterokinase

2 Loại bỏ GST và Trx để thu các cecropin tinh sạch

3 Thử hoạt tính kháng khuẩn của 3 loại cecropin: cecH, cecN và cecT trên các chủng vi sinh vật kiểm định Từ đó đánh giá sự khác biệt về hoạt tính kháng khuẩn của 3 cecropin này cũng như sự khác biệt về hoạt tính của cùng 1 cecropin nhưng theo hai cách làm tan biến tính và không biến tính

References

Tiếng Việt

1.GARP-Nhóm nghiên cứu Quốc gia của Việt Nam (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng

sinh và kháng kháng sinh ở Việt Nam, Hà Nội

2.Nguyễn Thị Thu Hường (2011), Tách dòng cecropin từ nhộng Bombyx mori và biểu hiện

cecropin tái tổ hợp trong Escherichia coli, Luận văn cử nhân Sinh học, Trường đại học Khoa

học Tự nhiên, Hà Nội

Tiếng Anh

3.Arnau J., Lauritzen C., Petersen G E., Pedersen J (2006), “Current strategies for the use of

affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins”, Protein

Expression and Purification, 48, pp 1-13

4.Boman H G (1995), “Peptide antibiotics and their role in innate immunity”, Annual Review of

Immunology, 13, pp 61-92

5.Boman H G., Faye I., Gan R., Gudmundsson G H., Lidholm D A., Lee J Y., Xanthopoulos

K G (1987), “Insect immunity-a gene system for antibacterial proteins”, Mem Inst

Oswaldo Cruz, 82(3), pp 115-124

6.Bondos S E., Bicknell A (2003), “Detection and prevention of protein aggregation before,

during, and after purification”, Analytical Biochemistry, 316, pp 223-231

7.Breithaupt H (1999), “The new antibiotics”, Nature Biotechnology, 17, pp 1165-1169

8.Brogden K A (1992), “Ovine pulmonary surfactant induces killing of Pasteurella

haemolytica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae by normal serum”, Infection and Immunity, 60, pp 5182-5189

9.Brogden K A (2005), “Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in

bacteria?”, Nature, 3, pp 238-250

10 Brogden K A., Ackermann M., McCray P B., Jr., Tack B F (2003), “Antimicrobial

peptides in animals and their role in host defences”, International Journal of Antimicrobial

Agents, 22, pp 465-478

11 Brown K L., Hancock R E W (2006), “Cationic host defense (antimicrobial) peptides”,

Current Opinion in Immunology, 18, pp 24-30

12 Bulet P., Charlet M., Hetru C (2003), Innate Immunity, Humana Press, Totowa, pp 89-107

13 Bulet P., Stöcklin R (2005), “Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene

regulation”, Protein and Peptide Letters, 12, pp 3-11

14 Bulet P., Stöcklin R., Menin L (2004), “Anti-microbial peptides: from invertebrates to

vertebrates”, Immunological Reviews, 198, pp 169-184

15 Callaway J E., Lai J., Haselbeck B., Baltaian M., Bonnesen S P., Weickmann J., Wilcox G., Lei S P (1993), “Modification of the C terminus of cecropin is essential for broad-spectrum

antimicrobial activity”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 37(8), pp 1614-1619

16 Chen Y Q., Zhang S Q., Li B C., Qiu W., Jiao B., Zhang J., Diao Z Y (2008), “Expression

of a cytotoxic cationic antibacterial peptide in Escherichia coli using two fusion partners”,

Protein Expression and Purification, 57, pp 303-311

17 Cromwell M E M., Hilario E., Jacobson F (2006), “Protein aggregation and bioprocessing”,

The AAPS Journal, 8(3), pp E572-E579

18 Fei D., Wei X., Xueyin D., Xianxiu X (1999), “The terminal structure plays an important

role in the biological activity of cecropin CMIV”, Science in China, 42(5), pp 494-500

19 Ganz T (1999), “Defensins and host defense”, Science, 286, pp 420-421

20 Ganz T (2003), “The role of antimicrobial peptides in innate immunity”, Integrative and

Comparative Biology, 43, pp 300-304

21 Hancock R E W (1997), “Peptide antibiotics”, Lancet, 349, pp 418-422

22 Hancock R E W., Sahl H G (2006), “Antimicrobial and host-defense peptides as new

anti-infective therapeutic strategies”, Nature Biotechnology, 24(12), pp 1551-1557

23 Holak T A., Engstrom A., Kraulis P J., Lindeberg G., Bennich H., Jones T A., Gronenborn

A M., Clore G M (1988), “The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin

A: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study”, Biochemistry,

27(20), pp.7620-7676

24 Hong R W., Shchepetov M., Weiser J N., Axelsen P H (2003) “Transcriptional profile of

the Escherichia coli response to the antimicrobial insect peptide Cecropin A”, Antimicrobia

agents and Chemotherapy, 47(1), pp 1-6

25 Hongbiao W., Baolong N., Mengkui X., Lihua H., Weifeng S., Zhiqi M (2005), “Biological

activities of cecropin B-thanatin hybrid peptides”, The journal of peptide research official

journal of the American Peptide Society, 66(6), pp 382-386

26 Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Kapur R., Boman H G (1982), “Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and fourminor antibacterial components from cecropia

pupae”, European Journal Biochemistry, 127, pp 207-217

27 Jan P S., Huang H Y., Chen H M (2010), “Expression of a synthesized gene encoding cationic peptide Cecropin B in transgenic tomato plants protects against bacterial diseases”,

Applied and Environmental Microbiology, 76(3), pp 769-775

28 Jenssen H., Hamill P., Hancock R E W (2006), “Peptide antimicrobial agents”, Clinical

microbiology reviews, pp 491-511

29 Jin F., Xu X., Zhang W., Gu D (2006), “Expression and characterization of a housefly

cecropin gene in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris”, Protein Expression and

Purification, 49(1), pp 39-46

30 Kamysz W., Okrój M., Lukasiak J (2003), “Novel properties of antimicrobial peptides”,

Acta Biochimica Polonica, 50(2), pp 461-469

31 Kang C S., Son S Y., Bang I S (2008), “Biologically active and C-Amidated

HinnavinII-38-Asn produced from a Trx fusion construct in Escherichia coli”, The Journal of

Microbiology, 46(6), pp 656-661

32 Li L., Wang J X., Zhao X F., Kang C J., Liu N., Xiang J H., Li F H., Sueda S., Kondo H (2005), “High level expression, purification, and characterization of the shrimp antimicrobial

peptide, Ch-penaeidin, in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 39, pp

144-151

33 Li Y (2009), “MINIREVIEW Carrier proteins for fusion expression of antimicrobial

peptides in Escherichia coli”, Biotechnology and Applied Biochemistry, 54, pp 1-9

34 Liang Y., Wang J X., Zhao X F., Du X J., Xue J F (2006), “Molecular cloning and

characterization of cecropin from the housefly (Musca domestica), and its expression in

Escherichia coli”, Developmental and Comparative Immunology, 30, pp 249-257

35 Liu Z., Zhang F., Cai L., Zhao G., Wang B (2003), “Studies on the properties of

Cecropin-XJ expressed in yeast from Xinjiang silkworm”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 43(5), pp 635-641

36 Lu X M., Jin X B., Zhu J Y., Mei H F., Chu F J., Wang Y., Li X B (2010), “Expression

of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme in Escherichia coli”,

Applied Microbiology and Biotechnology, 87(6), pp 2169-2178

37 McDermott A M (2004), “Defensins and other antimicrobial peptides at the ocular surface”,

Ocul Surf., 2(4), pp 229-247

38 Mookherjee N., Hancock R E W (2007), “Cationic host defence peptides: innate immune

regulatory peptides as a novel approach for treating infections”, Cellular and molecular life

sciences, 64(7-8), pp 922-933

39 Melo M N., Ferre R., Castanho M A (2009), “Antimicrobial peptides: linking partition,

activity and high membrane-bound concentrations”, Nature Reviews, Microbiology, 7, pp

245-250

40 Mercado-Pimentel M E., Jordan N C., Aisemberg G O (2002), “Affinity purification of

GST fusion proteins for immunohistochemical studies of gene expression”, Protein

Expression and Purification, 26, pp 260-265

41 Moore A J., Beazley W D., Bibby M C., Devine D A (1996), “Antimicrobial activity of

cecropins”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 37, pp 1077-1089

42 Moore A J., Devine D A., Bibby M C (1994), “Preliminary experimental anticancer

activity of cecropins”, Peptide research, 7(5), pp 265-269

43 Nakajima Y., Qu X.M., Natori S (1987), “Interaction between liposomes and sarcotoxin IA,

a potent antibacterial protein of Sarcophaga peregrina (flesh fly)”, The Journal of Biological

Chemistry, 262, pp 1665-1669

44 Pryor K D., Leiting B (1997), “High-level expression of soluble protein in Escherichia coli

using a His6-Tag and Maltose-Binding-Protein double-affinity fusion system”, Protein

Expression and Purification, 10, pp 309-319

45 Sallum U W., Chen T T (2008), “Inducible resistance of fish bacterial pathogens to the

AMPs Cecropin B”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 52(9), pp 3006-3012

46 Sambrook J., Russel D W (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Habor laboratory Press, New York

47 Sarmasik A., Warr G., Chen T T (2002), “Production of transgenic Medaka with increased

resistance to bacterial pathogens”, Marine Biotechnology, 4, pp 310-322

48 Sato H., Feix J B (2006), “Peptide–membrane interactions and mechanisms of membrane

destruction by amphipathic α-helical antimicrobial peptides”, Biochimica et Biophysica Acta,

1758, pp 1245-1256

49 Schmitt P., Mercado L., Díaz M., Guzmán F., Arenas G., Marshall S H (2008),

“Characterization and functional recovery of a novel antimicrobial peptide (CECdir-CECret)

from inclusion bodies after expression in Escherichia coli”, Peptides, 29, pp 512-519