Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây dó bầu ( aquilaria SP ) tại hà tĩnh

Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số; tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR; nhân bản gen với các cặp mồi; kết quả tách dòng gen; xác định và

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây Dó Bầu ( Aquilaria SP.) tại Hà Tĩnh

Hoàng Đăng Hiếu

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70

Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Hà

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Tổng quan về cây dó bầu; phương pháp sử dụng trong việc định danh loài

và xác định quan hệ di truyền; DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại; locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật; tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật Tìm hiểu một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới, Nghiên cứu thu thập 18 mẫu lá các cây dó dầu tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào, tách chiết tinh sạch DNA Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu Tách dòng đoạn gen và xác định trình tự gen Đưa ra kết quả và thảo luận: kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số; tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR; nhân bản gen với các cặp mồi; kết quả tách dòng gen; xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA

chỉ thị

Keywords Di truyền học; Cây dó dầu; Sinh học phân tử

Content

1 Đặt vấn đề

Cây dó bầu (Aquilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước ta, cây

dó bầu mang lại giá trị kinh tế rất lớn với mục đích chủ yếu là khai thác trầm hương, một mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong dược liệu, trong tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ

Tuy nhiên, hiện nay các loài dó bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi cá nhân,

dẫn đến năng suất và chất lượng trầm thu được không ổn định Do vậy, việc chọn lọc giống cây ban đầu để đưa vào triển khai là hết sức quan trọng và là nhiệm vụ cấp thiết trong công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý

Hiện nay phương pháp DNA barcode là một trong những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định loài bằng DNA chỉ thị

có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật trong đó có dó bầu ở Việt Nam khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Gồm 18 mẫu lá cây dó bầu được thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào

Chủng vi khuẩn Escherichia coli (DH5α) sử dụng cho mục đích tách dòng do Phòng

Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Các bước nghiên cứu:

- Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu

- Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu

- Sử dụng phương pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu

- Tách dòng đoạn gen quan tâm

- Xác định trình tự gen và phân tích kết quả

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA

Các mẫu dó bầu sau khi thu thập được tiến hành ách triết DNA theo phương pháp CTAB

T1 T2 T3 T4 T6 T7 T8 T9 T10 T11

Hình 1 Kết quả điện di DNA tổng số của một số mẫu dó bầu nghiên cứu

Kết quả sau khi điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm bằng Ethidium bromide (hình 1) cho thấy DNA thu được sau khi tách có chất lượng tốt, DNA không bị đứt gẫy, các băng vạch đều sáng rõ

3.2 Tìm nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của phản ứng PCR

Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu được thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou (2010) Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích thước nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu Sau quá trình thử nghiệm với các dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đoán ban đầu có sự thay đổi thể hiện trên bảng 1

Bảng 1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu

STT Vùng gen

nhân bản

Ký hiệu mồi

Kích thước đoạn gen nhân bản

Nhiệt độ bắt cặp mồi lý thuyết

Nhiết độ bắt cặp mồi thực tế

3.3 Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu

Sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành nhân bản bằng phản ứng PCR với 4 cặp mồi nghiên cứu Kết quả cho thấy 18 mẫu dó bầu nhân bản tốt với 4 cặp mồi nghiên cứu

Hình 2 Kết quả PCR gen ITS Hình 3 Kết PCR gen psbA – trnH

Hình 4 Kết quả PCR gen rpoB Hình 5 Kết quả PCR gen rbcL

3.4 Kết quả tách dòng gen

3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)

Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide, còn dư, và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình đưa gen vào vector tách dòng

Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 6

Hình 6 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB

M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch ở hình 6 cho thấy chỉ có một băng vạch

có kích thước tương ứng với đoạn gen được nhân lên bằng mồi barcode tương ứng Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng tiếp theo

Tương tự với các sản phẩm PCR của các gen còn lại cũng đã được tiến hành tinh sạch

và cho kết quả tốt tương tự gen rpoB

3.4.2 Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính toán hàm lượng DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase

3.4.3 Kết quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E coli

Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ được biến nạp vào vi khuẩn

E.coli DH5α, sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicilin 50 mg/l,

500 bp

X-gal 0,004% và IPTG 100μM Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm

Hình 7 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

Hình 7 cho thấy kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt, trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng mật độ và số lượng tương đối lớn

đủ để qúa trình chọn lọn khuẩn lạc diễn ra dễ dàng

3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp

Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony - PCR Với phương pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi vector pUC-18

Hình 8 Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL

M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24 : Các khuẩn lạc

Mồi pUC18 được thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm Khoảng cách giữa 2 mồi trên vector vào khoảng 200 bp Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vòng sẽ thu được băng có kích thước

khoảng 200 bp, còn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận được đoạn gen sẽ

có kích thước bằng kích thước gen cộng thêm 200 bp

Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thước vào khoảng 750 bp, kết quả điện

di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thước vào khoảng hơn 900 bp Như vậy bước đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm trừ dòng số 1, 4, 5, 7, 8, 9,

11, 12, 17, 24 vì những dòng khuẩn lạc này không có băng vạch chúng ta quan tâm

Các mồi còn lại cũng được tiến hành tương tự và đã thu được các dòng khuẩn lạc mang gen cần quan tâm

3.4.5 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp

Sau khi các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên được lựa chọn sẽ được nuôi trong 3

ml môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200 vòng/phút qua đêm, sau đó tiến hành tách plasmid sau đó plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%

Hình 9 Kết quả điện di plasmid tách chiết

M : thang maker 1kb; T1,T2,T3,T4,T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14, M1, Qx, G1, PQ64 : các plasmid của mồi rbcL

Qua kết quả điện di plasmid hình 9 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy Để kiểm tra chính xác sự có mặt của DNA đã được biến nạp chúng tôi tiến

hành xử lý plasmid thu được bằng enzyme cắt giới hạn BamHI

3.4.6 Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp

Các plasmid sau khi tách chiết cần tiến hành cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới

hạn BamHI để khẳng định plasmid có mang đoạn gen quan tâm hay không Theo lý thuyết

sau khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn sẽ thu được 2 phân đoạn có DNA: i) đoạn DNA đã được biến nạp và ii) phần plasmid còn lại sau khi đã mất đoạn DNA

2500 bp

750 bp

Hình 10 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL

M : thang Marker 1Kb; T1, T2, T3, T4, T6, T7, T8 : Các sản phẩm cắt của các plasmid

được tách dòng đoạn gen rbcL

Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng BamHI ở các mẫu(T1,T2, T3, T4, T6, T7, T8)từ các plasmid được tách dòng đoạn gen rbcL cho thấy các mẫu plasmid đều phân thành

hai băng trong đó có băng DNA kích thước 750 bp quan tâm Với các mẫu còn lại của mồi rbcL và 3 mồi còn lại chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự

3.5 Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị

Các đoạn DNA sau khi được tách dòng thành công sẽ được gửi đọc trình tự tại công

ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen người) Trình tự được xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger Sau khi xử lý trình tự bằng phần mềm Bioedit và đối chiếu với những thông tin trên ngân hàng GenBank, chúng tôi đã tiến hành phân tích kết quả với cả 4 mồi nghiên cứu kết quả thu được như sau :

3.5.1 Kết quả xác định và phân tích trình tự gen trn-psbA

Trình tự đoạn gen phân tích được có kích thước 440 bp đúng so với kích thước dự đoán là 450 bp trong đó có một số những sai khác ở các vị trí của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu tuy nhiên những sai khác này là chưa đủ để xác định phân loại giữa các mẫu nghiên cứu

Phân tích trình tự đoạn gen trnH-psbA cho thấy độ tương đồng khi so sánh 18 mẫu Dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã được đăng trên ngân hàng GenBank có độ tương đồng rất

cao (99,1-100%) Điều này cho thấy hệ gen lục lạp ở dó bầu có tính bảo thủ rất cao giữa các

cá thể ở các khu vực cách xa nhau về mặt địa lý (Hà Tĩnh, Phú Quốc, Lào) Hơn nữa, theo bản chất của hệ gen lục lạp thì đây là hệ gen rất ít có những biến động giữa các cá thể thuộc các loài gần nhau

3.5.2 Kết quả xác định và phân tích trình tự gen rpoB

Trình tự đoạn gen phân tích được có kích thước 510 bp trong đó có một số vị trí sai khác giữa 18 mẫu nghiên cứu, tuy nhiên những sai khác này là những sai khác điểm nhỏ lẻ có thể bắt nguồn từ sự sai khác trong quá trình PCR vì emzym Taq polymerase không có hoạt

tính sửa chữa trong quá trình PCR Phân tích trình tự đoạn gen rpoB cho thấy độ tương đồng khi so sánh 18 mẫu dó bầu nghiên cứu và trình tự A.sinensis đã được đăng trên ngân hàng

GenBank có độ tương đồng rất cao (99,0 - 100%) Điều này càng khẳng định tính bảo thủ của

hệ gen lục lạp ở thực vật

3.5.3 Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL

Đoạn gen phân tích được có kích thước 734 bp phù hợp với kích thước ban đầu, trong kết quả phân tích trình tự thấy xuất hiện những vị trí sai khác của 18 mẫu dó bầu nghiên cứu đặc biệt ở vị trí 43 có sự thay đổi nucleotit A bằng G của với 6 mẫu Dó bầu nghiên cứu là AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 so với 12 loài dó bầu còn lại Đây là hai nhóm có xuất xứ cách xa nhau về mặt địa lý, các mẫu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 có xuất xứ từ Lào và Phú Quốc, các mẫu còn lại có xuất xứ từ Hà Tĩnh Đây có thể coi là một dấu hiệu để bước

đầu phân biệt 18 cá thể dó bầu mà chúng ta nghiên cứu dù hệ số tương đồng của 18 mẫu vẫn rất cao ( 99,0 - 100% )

3.5.4 Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS

Kết quả phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thước 655 bp, hệ số tương đồng di

truyền giữa các mẫu vẫn cao ( 91,1 - 100%) tuy nhiên trong trình tự xác định được xuất hiện nhiều sai khác có giá trị có thể sử dụng để phân loại đặc biệt là ở các vị trí 196, 455, 536, 596

611, 612 Một số sai khác được liệt kê trong bảng 2 Với những sai khác ở những vị trí trên

đã bổ xung thêm cơ sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu

Bảng 2 Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS

STT Tên

mẫu

Vị trí dùng để phân loại

113 131 196 217 239 455 536 596 616 617

QX

A crassna AY920326 M1

Al8

A crassna AY920327 T11

T8

A sinensis FJ980392

A sinensis EF645836 G1

PQ64 Al6 Al2

A sinensis GQ891956

A sinensis EF645834

A sinensis EF645833 T6

T10 T9 T2

A yunnanensis EF645835

A rugosa AY920328

A rugosa AY920330 T1

T4 T3

T14 51

40 100

99 99

51

94

86

82

64 83 47 38 25

0.005

Hình 10 Cây phân loại giữa trên kết quả mồi ITS

Nhìn trên cây phân loại ta nhận thấy 18 mẫu dó bầu nghiên cứu có thể chia thành 2 nhóm lớn, với chỉ số bootstrap 80,5 Nhóm thứ nhât bao gồm các mẫu AL2, AL6, AL8, G1,

Qx, PQ64, M1, T6, T7, T8, T9, T10, T11 cùng với A.crassna và A sinensis, nhóm thứ hai

bao gồm các 5 mẫu còn lại Các mẫu T1, T2, T3, T4, T14 phân thành 1 nhóm phân loại riêng

với so với các loài A.crassna, A.sinensis, A.rugosa, A.yunasensis với chỉ số bootstrap 99,9%,

có thể kết luận các mẫu này không thuộc 4 loài trên Ở Việt Nam hiện nay ngoài 4 loài trên

còn có 2 loài Dó Bà Nà (A.banacensis) và Dó Mã Lai (A malacensis), tuy nhiên trình tự hai

loại này chưa được nghiên cứu Nhiều khả năng các mẫu này là một trong hai loài trên vì vậy cần sử dụng thêm các chỉ thị khác và các mồi barcode khác để có thể có kết luận chính xác

hơn Trình tự đoạn ITS của các mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, các mẫu M1, QX, PQ64, G1

thu thập tại Phú Quốc và 3 mẫu thu thập ở Lào không có khác biệt tin cậy (25-47%) so với

trình tự này của các loài A crassna và A sinensis

Từ kết quả phân tích chúng tôi nhận thấy rằng mối tương quan di truyền giữa 18 mẫu

dó bầu được nghiên cứu là tương đối cao, Chỉ số tương đồng di truyền khoảng (91,1-100%) Các mẫu dó bầu có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều này đã được chứng minh rõ ràng khi chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ thị đối với hệ gen lục lạp như trên

3 Kết luận và kiến nghị

4.1 Kết luận

- Đã tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu trong đó có 3 loài của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh

- Đã nhân bản thành công các đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phương pháp PCR từ DNA tổng số của 18 mẫu dó bầu

- Đã xác định được trình tự nucleotide của 4 đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, trnL của 18 mẫu dó bầu

- Xuất hiện được những sai khác ở 4 gen này tuy nhiên gen trnH-psbA và rpoB khó có thể sử dụng để phân loại vì những sai khác này là do quá trình nhân bản

- Với rbcL gen và ITS đã tìm được những sai khác có tính hệ thống và có giá trị trong việc sử dụng để phân loại

4.2 Kiến nghị

- Tiếp tục sử dụng phương pháp DNA bacode trong phân loại và xác định loài ở Việt Nam

- Sử dụng gen rbcL và ITS vào việc xác định các loài dó bầu ở Việt Nam đồng thời

tiến hành nghiên cứu với các mồi barcode khác để tìm ra các dấu hiệu xác định loài khác nhằm phân loại một cách chính xác và cụ thể hơn

References

Tài liệu tiếng Việt

`1 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2002), Báo cáo tổng kết đề tài: “Nghiên cứu

xác định phương pháp tạo trầm bằng tác nhân vi sinh trên cây dó bầu Aquilaria crassna”, Nha Trang

2 Hoàng Cảnh (2006), Trầm hương và loại cây tạo ra trầm hương, lợi ích, thách thức và

triển vọng Hội trầm hương Việt Nam

3 Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung

tâm nghiên cứu tài nguyên môi trường, NXB Nông nghiệp

4 Bùi Công Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu các chất tạo trầm nhân tạo trên cây dó bầu

Aquilaria crassnatại Việt Nam, Nha Trang

5 Thái Thành Lượm (2000), “Bảo vệ nguồn gen và khai thác kết qủa tạo trầm nhân tạo trên

cây trầm hương”, Tạp chí khoa học phổ thông - Liên hiệp các hội khoa học kỹ thuật

TP HCM, số 518

6 Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, “Báo cáo kết quả ánh giá sơ bộ về tiềm năng

sản xuất bột giấy của cây dó bầu”, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa

học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Công nghiệp giấy và Cenlulose

7 Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử , Nhà xuất bản

Đại học Huế, Huế

8 Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2005), Di truyền học, NXB

Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội