Phân tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Phân tích và so sánh sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường thông qua biểu hiện của các điểm protein trên bản gel điện di

Phân tích proteomics mô ung thư của bệnh

nhân ung thư đại trực tràng

Abstract Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thường và mô

ung thư đại trực tràng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Phân tích và so sánh

sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường thông qua biểu hiện của các điểm protein trên bản gel điện

di hai chiều Nhận dạng được một số protein biểu hiện khác biệt đặc trưng giữa

mô ung thư đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thường

Keywords Sinh học thực nghiệm; Proteomics; Mô ung thư; Ung thư đại trực

tràng

Content

MỞ ĐẦU

Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên thế giới,

nó đứng thứ ba chỉ sau ung thư phổi và ung thư vú Đây là căn bệnh có tỷ lệ tử vong cao và

tỷ lệ mắc bệnh có xu hướng ngày càng tăng Theo thống kê, năm 2008 ước tính có khoảng 1,24 triệu người trên thế giới được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thư Số ca tử vong do ung thư đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lượng tử vong do ung thư

Việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư đại trực tràng có ý nghĩa rất quan trọng, giúp làm tăng hiệu quả điều trị bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do loại ung thư này gây ra Thực tế cho thấy, nếu phát hiện khối u đại trực tràng ở giai đoạn đầu và chữa trị kịp thời thì tỷ lệ sống sót của bệnh nhân sau 5 năm sẽ là 80 – 100% Hiện nay, một số phương pháp xét nghiệm lâm sàng đang được áp dụng để chẩn đoán ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, các phương pháp này là thường phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn, cho kết quả có độ chính xác không cao Nhu cầu đặt ra cho các nhà khoa học là làm thế nào để tìm ra được các chỉ thị sinh học đặc trưng để chẩn đoán, phát hiện ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm

Hiện nay, một trong những hướng nghiên cứu chỉ thị sinh học cho ung thư đại trực tràng đang được các nhà khoa học quan tâm là sử dụng công cụ proteomics Bằng việc phân tích sự biến đổi trong thành phần, số lượng các protein có mặt trong huyết thanh, dịch

cơ thể, mô ung thư của bệnh nhân ung thư, các nhà khoa học hi vọng tìm ra được các chỉ thị sinh học mới, dễ nhận biết để ứng dụng chẩn đoán ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm, nhằm phục vụ công tác chẩn đoán, điều trị bệnh một cách hiệu quả

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân tích

proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng“ với mục tiêu:

- Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

- Phân tích và so sánh sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường thông qua biểu hiện của các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều

- Nhận dạng được một số protein biểu hiện khác biệt đặc trưng giữa mô ung thư đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thường

Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Ung thư đại trực tràng là ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới chỉ sau ung thư phổi

và ung thư vú Năm 2008 ước tính có khoảng 1,24 triệu người trên thế giới được chẩn đoán

là mắc ung thư đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thư Số ca tử vong

do ung thư đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lượng tử vong do ung thư [16, 45]

Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng là loại ung thư đứng thứ năm trong các loại ung thư thường gặp, sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng và bệnh này có xu hướng ngày càng tăng cao Theo thống kê của Bệnh viện Ung Bướu TPHCM, năm 2007, bệnh viện có

218 ca bệnh ung thư đại trực tràng Năm 2008 con số này là 306 ca và tính đến tháng 9 năm 2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung thư đại trực tràng [54] Theo thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng là 9% tổng số bệnh nhân ung thư [55]

1.1.2 Nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng

Nguyên nhân chính xác dẫn đến ung thư đại trực tràng vẫn chưa được chứng minh rõ ràng Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng đã cho thấy một số yếu tố có khả năng làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng, bao gồm yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền

Yếu tố không di truyền

Theo một số nghiên cứu, số lượng người mắc ung thư đại trực tràng không liên quan đến các yếu tố di truyền chiếm 75 - 95% tổng số người mắc bệnh [41] Các yếu tố này bao gồm: lứa tuổi, giới tính, chế độ ăn uống, thuốc lá, chế độ vận động của cơ thể, các bệnh liên quan đến viêm đại tràng, polyp đại tràng…

Các yếu tố di truyền

Trường hợp ung thư đại trực tràng liên quan đến bệnh sử ung thư trong gia đình chỉ chiếm khoảng 20% trong tất cả các trường hợp mắc bệnh Trong đó, chỉ có 5% các trường hợp là do di truyền các gen gây ung thư từ bố, mẹ sang con cái Các bệnh di truyền liên quan đến việc hình thành ung thư đại trực tràng bao gồm hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous Polyposis – FAP), hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial Adenomatous Polypsis – AFAP), hội chứng ung thư đại tràng di truyền không phải đa polyp (Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer – HNPCC)

1.1.3 Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng

Hệ thống phân loại theo Duke [12]

Năm 1932, Cuthbert E Dukes, một nhà giải phẫu người Anh đã đưa ra hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng Theo hệ thống phân loại này, ung thư trực tràng được chia ra thành 4 giai đoạn:

Duke A: Khối u bị giới hạn ở thành của trực tràng

Duke B: Khối u xâm lấn qua thành của trực tràng nhưng chưa ảnh hưởng đến các hạch bạch huyết

Duke C: Khối u lan tới các hạch bạch huyết cạnh trực tràng

Duke D: Khối u di căn tới các bộ phận khác trên cơ thể như thận, gan, phổi…

Hệ thống phân loại TNM

Hệ thống phân loại ung thư đại trực tràng TNM (Tumor – Lympho node – Metastases) là hệ thống được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Hệ thống phân loại TNM phân giai đoạn ung thư đại trực tràng dựa vào kích thước khối u (T), mức độ lây lan của khối u tới các hạch bạch huyết (N) và mức độ di căn tới các cơ quan khác của cơ thể (M) Con số được thêm vào phía sau mỗi chữ cái cho biết kích thước hoặc phạm vi của khối u

và mức độ di căn Ở nhiều loại ung thư, các cách phối hợp TNM này tương ứng với một trong 5 giai đoạn (hình 2)

Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [50]

1.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ

Chỉ thị sinh học (Biomarker) được định nghĩa là các phần tử được tìm thấy trong máu, trong các loại dịch của cơ thể hoặc trong mô, đặc trưng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý

1.2.1 Chỉ thị sinh học đối với ung thư

Chỉ thị sinh học ung thư là những phần tử có trong tế bào hoặc mô ung thư, trong máu hay dịch cơ thể khác Chỉ thị sinh học gồm 2 loại chính là chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch Chỉ thị ung thư dạng tế bào bao gồm các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể hormone và thụ thể yếu tố tăng trưởng, những biến đổi ADN, mARN, yếu tố phiên mã của

tế bào Chỉ thị ung thư dạng thể dịch bao gồm các chất được phát hiện ở nồng độ bất thường có mặt trong huyết thanh, nước tiểu và các loại dịch khác của cơ thể [2] Một chỉ thị ung thư lý tưởng là chỉ thị có thể dễ dàng xác định được, cho kết quả đáng tin cậy, các xét nghiệm sử dụng loại chỉ thị này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, chi phí thấp

1.2.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thư

Hiện nay, có 3 kỹ thuật sinh học phân tử chính được ứng dụng trong nghiên cứu chỉ thị sinh học của ung thư bao gồm:

 Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng những biến đổi gen liên quan đến sự phát sinh ung thư

 Sử dụng kỹ thuật proteomics để xác định những biến đổi của các protein liên quan đến quá trình phát sinh, hình thành ung thư Ưu điểm của kỹ thuật proteomics là có khả năng nghiên cứu được mức độ biểu hiện của gen thông qua các phân tử protein tạo ra

 Sử dụng kỹ thuật metabolomics để nghiên cứu tất cả những chất chuyển hóa được tạo ra trong tế bào, trong mô

1.3 PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.3.1 Proteomic là gì?

Proteomics là môn khoa học nghiên cứu các protein được biểu hiện trong tế bào,

mô hoặc cơ thể trong những điều kiện và thời gian xác định [1] Không chỉ dừng lại nghiên cứu sự tồn tại của protein của một tế bào nào đó, proteomics còn đi sâu nghiên cứu tất cả các dạng protein đã được cải biến, tương tác giữa các protein, cấu trúc không gian và các phức hệ cao hơn của protein

1.3.2 Công cụ nghiên cứu proteomics

Để phân tích cả hệ gồm nhiều protein, kỹ thuật proteomics cần có sự hỗ trợ của 4 công cụ phân tích sau:

Công cụ đầu tiên là cơ sở dữ liệu Các dữ liệu về protein, các trình tự biểu hiện được đánh dấu và trình tự genome hoàn chỉnh là một dữ liệu đầy đủ và chọn lọc cho tất cả các protein biểu hiện trong các cơ thể

Công cụ thứ hai là khối phổ, đây là bộ phận trung tâm và cơ bản của phân tích proteomics Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ được lựa chọn

để phân tích hệ protein Kỹ thuật này phân tích các protein hay các mảnh peptide theo tỷ số m/z (khối lượng/độ tích điện)

Công cụ thiết yếu thứ ba là hệ thống phần mềm có thể so sánh, đối chiếu dữ liệu khối phổ với các trình tự protein đặc trưng trong cơ sở dữ liệu

Công cụ thiết yếu thứ tư trong nghiên cứu proteomic là các kỹ thuật phân tách protein Công việc phân tách protein nhằm hai mục đích chính Thứ nhất, nó làm đơn giản các phức hệ protein phức tạp bằng cách phân tách chúng thành các phân tử hay nhóm nhỏ protein độc lập Thứ hai, việc phân tách này cho cái nhìn tổng quan về sự khác biệt của hệ protein giữa hai mẫu khác nhau, nhờ đó xác định được các protein đặc trưng để phân tích Ngày nay, hai dạng phân tích proteomics chủ đạo được sử dụng là: điện di hai chiều kết hợp với khối phổ và sắc ký hai chiều kết hợp với khối phổ

1.3.3 Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng

Trên thế giới, sự phát triển của nghiên cứu proteomics được đánh dấu bằng sự ra đời của tổ chức nghiên cứu hệ protein người (Human Proteome Organisation–HUPO) tại Pháp năm 2002 Bên cạnh đó còn có các tổ chức khu vực, trong đó có tổ chức AOHUPO (Asia Oceania Human Proteome Organisation) thuộc châu Á-châu Đại Dương

Một trong những ứng dụng quan trọng đầu tiên của proteomics là trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư Việc tìm ra những biến đổi trong hệ protein của bệnh nhân ung thư có thể giúp các nhà khoa học tìm hiểu rõ hơn về cơ chế phát sinh bệnh ở mức độ phân tử Các protein biến đổi cũng có thể trở thành các chỉ thị sinh học mới góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển của bệnh

Phân tích proteomics huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Huyết tương tách từ máu người là một hệ protein tuyệt vời cho phân tích proteomics Nó tập hợp các protein từ các mô khác nhau trong cơ thể Những hiểu biết về

hệ protein huyết tương mang lại những thông tin quan trọng về nhiều quá trình sinh học diễn ra trong cơ thể

Chỉ thị sinh học được tìm thấy trong huyết tương là chỉ thị lý tưởng cho chẩn đoán ung thư do rất dễ dàng thu thập mẫu huyết tương của bệnh nhân và việc chẩn đoán sẽ dễ dàng hơn Hiện nay, chỉ thị CEA có mặt trong máu đang được ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên, sử dụng chỉ thị CEA chỉ có khả năng phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV) Hơn nữa, chi phí cho xét nghiệm CEA tương đối cao Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm thêm các chỉ thị sinh học trong máu để ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng là hết sức cần thiết

Năm 2004, Yu và cs đã tiến hành phân tích proteomics huyết tương của 182 mẫu khác nhau gồm 55 mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 35 mẫu huyết tương của bệnh nhân u tuyến đại trực tràng và 92 mẫu huyết tương của người bình thường Nghiên cứu đã chỉ ra 4 protein khác biệt giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và người bình thường Các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học với độ đặc hiệu 92% và

độ nhạy là 89% [39]

Năm 2005, với kỹ thuật SELDI-TOF/MS, Albrethsen và cs đã so sánh các protein

có trong mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư đại tràng với huyết tương của người khỏe mạnh và protein có trong mô ung thư đại tràng với mô đại tràng bình thường Nghiên cứu này cho thấy hàm lượng các protein HNP- 1, HNP- 2 và HNP- 3, còn được gọi là α-defensin-1, α-defensin-2, α-defensin-3 tăng lên trong huyết tương của người bệnh và trong

mô tại vị trí khối u Một phần của protein HNP 1-3 sẽ kết hợp với loại protein khối lượng lớn chưa xác định trong huyết tương Nhóm nghiên cứu đề xuất rằng HNP 1-3 có thể được

coi như chỉ thị sinh học trong máu của bệnh nhân ung thư đại tràng [4Error! Reference

source not found.]

Ngoài các nghiên cứu nhằm tìm kiếm chỉ thị sinh học để chẩn đoán bệnh trong giai đoạn sớm, các nhà khoa học còn tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc trưng cho tình trạng di căn của ung thư đại trực tràng Năm 2010, Xue và cs đã tiến hành nghiên cứu với mục đích như vậy Bằng kỹ thuật LC-MS/MS, các nhà khoa học đã so sánh mức độ thay đổi lượng các chất tiết vào trong máu từ các dòng tế bào ung thư ban đầu và dòng tế bào đã di căn được lấy trên cùng bệnh nhân ung thư đại trực tràng 6 protein khác biệt đặc trưng đã được xác nhận bằng

kỹ thuật Western blot Trong đó, yếu tố trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trưởng 15 là 2 protein có biểu hiện tăng ở các dòng tế bào đã di căn Sử dụng kỹ thuật ELISA bánh kẹp cũng chỉ ra rằng 2 protein này có mức độ biểu hiện tăng lên đáng kể trong huyết tương ở ung thư đại trực tràng đã di căn tới hạch bạch huyết Kết quả thu được từ nghiên cứu này có thể

cho thấy trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trưởng 15 có trong huyết tương có thể ứng dụng được để chẩn đoán ung thư đại trực tràng đã di căn [37]

Phân tích proteomics mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Với mục đích nghiên cứu, tìm kiếm chỉ thị sinh học cho ung thư đại trực tràng, năm

2005, Alfonso và cs đã tiến hành phân tích proteomics ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng nhờ kỹ thuật 2D-PAGE kết hợp MS Nghiên cứu được tiến hành với mẫu mô tại vị trí khối

u và đối chứng là mẫu mô tại vị trí cận khối u của 7 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Nghiên cứu đã chỉ ra 72 protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư và mô bình thường Nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt bằng phân tích khối phổ đã xác định được 41 protein Các protein khác biệt liên quan đến quá trình điều hòa phiên mã, các protein tín hiệu (annexins IV và V, relaxin, APC), các protein tham gia tổ chức khung xương tế bào (vimentin, cytokeratins, beta actin) và các protein liên quan đến quá trình tổng hợp và cuộn

Nghiên cứu của Bai và cs sử du ̣ng kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với khối phổ, thực hiê ̣n trên mẫu mô tại vị trí khối u đại trực tràng và mẫu mô tại vị trí gần khối u trên cùng một bệnh nhân Mẫu mô đại trực tràng từ 12 bệnh nhân đã được sử dụng cho nghiên cứu này Kết quả điện di 2 chiều cho thấy có 60 protein biểu hiện khác biệt (hàm lượng chênh lệch 1,5 lần) giữa mô ung thư và mô thường Tiếp tục tiến hành phân tích khối phổ

để nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt, 10 protein đã được nhận dạng, bao gồm 2 protein biểu hiện giảm và 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thư 2 protein biểu hiện giảm

ở mô ung thư bao gồm carbonic anhydrase II và protein disulfide isomerase 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thư bao gồm APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor, phosphoglycerate kinase 1, fumarate hydratase, aldolase A, activator protein 2B, glutathione S-transferase A3, Arginase và zinc finger protein 64 homolog [8]

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là 10 mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được lấy tại vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5 – 10 cm)

Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội cung cấp Mẫu mô được đựng trong ống đựng mẫu, được bảo quản trong nitơ lỏng để vận chuyển từ bệnh viện về phòng thí nghiệm Các mẫu mô sau đó được bảo quản trong tủ âm sâu (-

80C) cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo

2.1.2 Hóa chất

Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được đề cập ở bảng 2

Bảng 2 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

1 Bio–Lyte 4-7 ampholyte, Bio–Lyte 3-10 ampholyte GE Health Care, Mỹ

2 Các peptide chuẩn Insuline B (Mw = 3494,65 Da),

Angiotensine II (Mw = 1046,5423 Da) Sigma – Aldrich, Mỹ

3 Chất nền CHCA (α–Cyano–4- hydroxycinnamic acid) Sigma – Aldrich, Mỹ

4 Enzyme trypsin Sigma – Aldrich, Mỹ

6 Agarose low melting, Glycine, Urea Sigma, Mỹ

7 SDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide Pharmacia - Mỹ

Tất cả các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ sạch phân tích

2.1.3 Thiết bị

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các thiết bị, dụng cụ trong Phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xử lý mẫu mô đại trực tràng

Mẫu mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư được lấy ra từ tủ -80o

C, rã đông Cân 2 mẫu mô với lượng tương đương (khoảng 0,1g) cho vào hai cối sứ riêng biệt để trên

đá Quy trình xử lý mẫu mô đại trực tràng được thực hiện như sau:

Bước 1 Thu các phân đoạn dịch chiết protein

 Mẫu mô được cắt nát bằng kéo cho đến khi mẫu nát nhỏ Bổ sung 100 µl đệm muối phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4 Chuyển toàn bộ mẫu mô đã cắt và dịch đệm vào ống eppendorft để trong 30 phút, ở 4oC Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o

C

để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 1

 Cặn thu được sau ly tâm lần 1 được bổ sung 200µl đệm PBS 0,05M, pH 7,4 để ở

4oC trong 30 phút Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu dịch nổi

là phân đoạn PBS 2

 Cặn thu được sau ly tâm lần 2 được hòa tan bằng 100 µl đệm lysis (Urea 7M, Tris 30mM, CHAPS 4% và DTT 65mM), để ở 4oC trong 30 phút Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o

C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 1

 Cặn thu được sau ly tâm lần 3 được hòa tan bằng 100 µl đệm lysis, để ở 4o

C trong

30 phút Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o

C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 2

 Cặn thu được sau ly tâm lần 4 được hòa tan bằng 200 µl đệm lysis, để ở 4o

C trong

60 phút Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o

C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 3

Bước 2 Loại mỡ trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được

Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu được (PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2 và lysis 3) ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và hút loại lớp mỡ phía trên Bước loại mỡ được lặp lại ít nhất 2 lần để đảm bảo loại mỡ tối đa

Bước 3 Loại cặn tế bào, ADN, ARN trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được

Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu được sau quá trình loại mỡ ở tốc độ 60.000g trong 30 phút ở 4oC, thu dịch nổi phía trên, loại bỏ cặn Bước này được lặp lại 2 lần để đảm bảo loại cặn tối đa

Bước 4 Kiểm tra thành phần protein có trong các phân đoạn chiết và độ sạch của mẫu

Dịch chiết protein thu được từ các phân đoạn sẽ được điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành phần protein có trong mẫu và độ sạch của mẫu Các mẫu chưa đạt độ sạch sẽ được tủa bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100% Các dịch chiết của cùng một mẫu được trộn lại

để chuẩn bị cho điện di hai chiều

2.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Để đảm bảo hàm lượng protein tổng số giữa các mẫu nghiên cứu là tương đương nhau, trước khi điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành định lượng protein trong mẫu dịch chiết protein từ mô ung thư và mô bình thường bằng phương pháp Bradford Sau khi đã xác định hàm lượng protein có trong mẫu, chúng tôi tiến hành tính toán sao cho hàm lượng protein có trong dung dịch sử dụng cho điện di hai chiều của mẫu bệnh và mẫu đối chứng

là tương đương nhau

2.2.3 Điện di hai chiều

Quá trình này được bắt đầu bằng việc làm trương thanh strip có gradient pH cố định bằng đệm trương gel có chứa protein Sau 1,5 giờ dung dịch sẽ ngấm vào thanh strip Lượng protein tối đa mà sợi gel IPG strip pH 3 - 10 dài 17cm có thể thấm được là 400µg

Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell hoặc Ettan

IPGphor3 để tập trung các phân tử protein vào vị trí tương ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 bước được trình bày trong bảng 3

Bảng 3 Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm

Bước Hiệu điện thế V Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng U

Điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS Kết thúc điện di chiều hai, các protein được cố định 45 phút trong dung dịch chứa axít phosphoric 1,3%, methanol 20%, sau đó nhuộm bằng dung dịch Coomassie G250 qua đêm theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988) Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein [43]

2.2.4 Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều

Đầu tiên bản gel điện di hai chiều được quét vào máy tính có phần mềm phân tích chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản) Bước đầu phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và đánh số thứ

tự cho các spot Tiếp đó, phần mềm Phoretix sẽ xác định vị trí, thể tích của từng spot và giá trị cường độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel từ đó giúp chỉ ra các spot tương ứng trên từng bản gel và các spot có biểu hiện khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel mẫu đối chứng

2.2.5 Cắt và thủy phân spot

Các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai chiều được cắt ra khỏi bản gel Trước tiên cần phải loại bỏ chất màu Coomassie từ các spot protein Protein trong các spot được thủy phân thành các peptide để chuẩn bị cho phân tích khối phổ Loại enzyme được sử dụng để thủy phân protein là trypsin Khi đó, phân tử protein được cắt thành các mảnh peptide có kích thước từ 6 – 20 acid amin, thích hợp cho phân tích khối phổ về sau [1]

2.2.6 Phân tích khối phổ và nhận dạng protein

Tiến hành phân tích khối phổ MALDI – TOF MS để xác định khối lượng của tập hợp các peptide thu được sau quá trình thủy phân các spot protein bằng enzyme trypsin Mẫu peptide được phân tích đồng thời với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide Angiotensin II (Mw 1046,54 Da) và Insulin B (Mw 3494,65 Da) Hỗn hợp peptide được trộn với chất nền CHCA, để khô và đưa vào máy phân tích khối phổ AXIMA – CRFPLUS

Protein được nhận dạng bằng phương pháp PMF (Peptide Mass Fingerprint) Phương pháp này nhận dạng protein bằng việc so sánh khối lượng của tập hợp các peptide thu sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu có sẵn, sử dụng phần mềm Mascot

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng điện di SDS - PAGE (hình 4)

Hình 4 Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng trên cùng bản gel polyacrylamide 10% có SDS

Giếng 1, 2, 3, 4, 5: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis

2, lysis 3 thu được từ mô đại trực tràng bình thường

Giếng 6, 7, 8, 9, 10: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2, lysis 3 thu được từ mô ung thư đại trực tràng

Hình 4 cho thấy kết quả điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết thô protein từ mẫu mô đại trực tràng Nhìn vào kết quả điện di chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất

hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dưới chứng tỏ đã tách chiết thành công protein từ mô đại trực tràng và thành phần protein thu được trong mẫu là đa dạng và phong phú Trong các mẫu, phân đoạn PBS 2, lysis 2 và lysis 3 (giếng số 2, 4, 5 và 7, 9, 10) có các băng vạch rõ nét và không có hoặc ít có vệt kéo dài từ trên xuống dưới Điều này chứng tỏ các phân đoạn này là tương đối sạch, ít bị lẫn các thành phần phi protein Bên cạnh đó, các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 (giếng số 1, 3 và 6, 8) của các mẫu có các băng protein hiện lên chưa rõ ràng và xuất hiện hiện tượng kéo vệt dọc theo chiều dài giếng Điều này chứng tỏ các phân đoạn này có thể lẫn các thành phần phi protein trong mẫu Do

đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu của các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100% ở -20oC Protein sau khi tủa được hòa tan lại bằng chính đệm lysis và được điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide 10% có SDS Kết quả điện di kiểm tra mẫu tủa được cho trong hình 5

Hình 5 Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1 từ

mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng trên bản gel

Các phân đoạn khác nhau của mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư được trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein đầy đủ của mô đại trực tràng dùng để tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo

3.2 PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN

DI HAI CHIỀU

Protein trong dịch chiết mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được phân tách thành các spot protein riêng rẽ bằng kỹ thuật điện di hai chiều Chiều thứ nhất là điện di đẳng điện trên thanh IPGstrip, pH 3-10, dài 17cm Điện

di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS