Phân tích đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Phân tìch đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Hoàng Thị Thùy Dung Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS.. Phân tìch đột biến mất đoạn 49

Phân tìch đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA

ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Hoàng Thị Thùy Dung

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: PGS.TS Trịnh Hồng Thái

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Tổng quan về DAN ty thể; đột biến DNA ty thể (MT DNA) chỉ thị sinh

học tiềm năng trong ung thu; ung thư đại trực trạng và mối liên hệ với đột biến mất đoạn 4977 BP xảy ra trong DNA ty thể Phân tìch đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Trính bày phương pháp nghiên cứu: Tách chiết DNA tổng số từ mô; khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng PCR; xử lý sản phẩm PCR khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng enzyme HaeIII; quy trính tinh sạch sản phẩm PCR sử du ̣ng kit QIAQUICK gel extraction; điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel; phương pháp giải trính tự; tình toán thống kê Đưa ra kết quả và thảo luận: Đặc điểm bệnh học lâm sàng của các bệnh nhân ung thu đại trực tràng; kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô ung thư đại trực tràng; kết quả khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA ty thể bằng kỹ thuật PCR; kaats quả xử lý sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977-2 bằng Enzyme giới hạn; kết quả giải trính tự sản phẩm PCR của đột biến mất đoạn 4977 bp của mtDNA; phân tìch mối liên quan giữa đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA ty thể và các đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng; thống kê

mức độ Heteroplasmy xảy ra trong DNA ty thể

Keywords Sinh học thực nghiệm; DNA; Bệnh nhân ung thư; Ung thư đại trực

tràng; Di truyền học hóa sinh; Đột biến gen

Content

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 DNA TY THỂ

Ty thể là những bào quan có thể được tím thấy trong gần như tất cả các tế bào có nhân Số lượng của ty thể trong mỗi tế bào ở mỗi loài là khác nhau [36] Ty thể là bào quan

có hính tròn hoặc hính trụ dài, có kìch thước đường kình 0,2-1 µm, chiều dài 2-5 µm Toàn

bộ cấu trúc của ty thể được bao bọc bởi hai lớp màng cấu tạo bởi protein và lớp phospholipid kép Không gian bên trong có chứa chất nền và có thể tím thấy các sợi DNA, ribosome …Tại đây chúng có thể mã hóa một phần các protein của chúng bằng chình bộ máy di truyền của riêng mính [18] Trong ty thể, ARN chiếm khoảng 0,5-3%, DNA khoảng 0,024 – 0,34% [18]

Ty thể là trung tâm hô hấp của tế bào là nơi sản sinh ra ATP, cung cấp năng lượng cho tế bào

Ty thể có hệ gen độc lập nên ty thể có khả năng tự sinh sản bằng các phân đôi ty thể mẹ để sinh ra các ty thể con [3]

1.1.1 Cấu trúc genome ty thể

DNA ty thể có cấu trúc sợi đôi, mạch vòng, một ty thể chứa khoảng 10 bản sao của mtDNA, nên trong mỗi tế bào có khoảng 100 – 10.000 bản sao mtDNA và mỗi phân tử mtDNA sợi đôi có kìch thước khoảng 15.000 – 17.000 bp Ở người, mtDNA có kìch thước 16.569 cặp bazơ, bao gồm 28 gen phân bố trên sợi nặng và 9 gen phân bố trên sợi nhẹ Trong số 37 gen này, có 13 gen mã hóa cho protein tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào, 22 gen mã hóa cho tRNA, 2 gen mã hóa cho rRNA [7]

1.1.2 Cơ chế di truyền của hệ gen ty thể

mtDNA được di truyền từ mẹ (di truyền theo dòng mẹ) [25]

1.1.3 Các rối loạn ty thể

Các rối loạn ty thể (hay bệnh do ty thể) có thể phát sinh do những đột biến ở gen nhân hoặc

gen ty thể Một số rối loạn ty thể chỉ ảnh hưởng đến một cơ quan nhưng cũng có những rối

loạn ảnh hưởng đến rất nhiều cơ quan và thường có những đặc điểm nổi trội Cho đến nay có khoảng trên 150 bệnh di truyền khác nhau theo mẫu hệ do ty thể quyết định Các bệnh do rối loạn mtDNA thường được biểu hiện rất đa dạng [11]

1.2 ĐỘT BIẾN DNA TY THỂ (MT DNA)  CHỈ THỊ SINH HỌC TIỀM NĂNG

TRONG UNG THƢ

Tỷ lệ đột biến của mtDNAdo đó cũng cao hơn so với tỷ lệ đột biến của DNA nhân (khoảng

17 lần) [11]

1.2.1 Các đột biến trên mtDNA

Phân lớn các đột biến trên mtDNA là đột biến điểm, còn lại là đột biến mất đoạn, đảo đoạn, thêm hay sắp xếp lại [36]

Trong mô bính thường, tất cả các phân tử mtDNA giống hệt nhau (homoplasmy) Đột biến có hại của mtDNA thường chỉ ảnh hưởng đến một số bản sao không ảnh hưởng đến toàn bộ các mtDNA (heteroplasmy) Thông thườ ng hiê ̣n tươ ̣ng đa hình lành tính của mtDNA là da ̣ng homoplasmic và các đô ̣t biến gây bê ̣nh là heteroplasmic Sự biểu hiê ̣n của kiểu hình đô ̣t biến gây bê ̣nh có thể thay đổi phu ̣ thuô ̣c vào mức đô ̣ heteroplasmy và nhu cầu năng lượng của các

mô chi ̣u ảnh hưởng [32] Các đột biến mtDNA liên quan đến bệnh cần phải được nghiên cứu

kỹ về cơ chế đột biến cũng như ngưỡng gây bệnh (tỷ lệ heteroplasmy) nhằm ngăn ngừa bệnh, điều trị hiệu [17]

1.2.2 Mối liên hệ của đột biến mtDNA với bệnh ung thƣ

Đột biến mtDNA đã được ghi nhận có mối liên quan với các dạng bệnh ung thư khác nhau và các dòng tế bào ung thư khác nhau, đặc biệt là các loại đột biến điểm Các đột biến điểm thường gặp là các loại đột biến thay thế, mất hoặc thêm một số nucleotid và đột biến ở vùng thiếu ổn định như đoạn lặp nhỏ vi vệ tinh cả trong vùng mã hóa và vùng không mã hóa [12,14]

Những đột biến mtDNA này đã được tím thấy ở gen mã hóa rRNA, các tiểu phần của phức hệ

I, phức hệ III, phức hệ IV và tất cả đều là đột biến Soma Tương tự như vậy, những đột biến mtDNA trong vùng điều khiển D–Loop có khả năng xảy ra ở bệnh nhân ung thư buồng trứng, ung thư dạ dày và ung thư biểu mô tế bào gan [33] Cho đến nay, các phân tìch mtDNA đã được tiến hành trên nhiều loại ung thư khác nhau và được kết luận đóng vai trò nhất định trong sự hính thành và phát triển ung thư Trong giai đoạn đầu ung thư, do sự xâm nhập của các tác nhân gây ung thư hoặc do cơ chế sửa chữa DNA bị sai hỏng gián tiếp đã gây nên các đột biến ở mtDNA Theo thời gian, các loại đột biến này được tìch lũy trong tế bào, mô, và

cơ thể ở trạng thái heteroplasmy và là nguyên nhân tiềm tàng gây bệnh [24]

1.2.3 Mối liên quan đột biến mất đoạn của mtDNA với bệnh ung thƣ - chỉ thị sinh học

tiềm năng trong ung thƣ

Đột biến mất đoạn trên hệ gen của ty thể là một hướng nghiên cứu được quan tâm Đột biết mất đoạn lớn xảy ra trong hệ gen ty thể đã được nghiên cứu rộng rãi chỉ ra rằng đột biến mất đoạn liên quan đến nhiều bệnh như liệt mắt tăng tiến kinh niên CPEO, hội chứng Kearn –

Sayre, hội chứng Pearson và quá trính lão hóa [8,9,16] Các đột biến mất đoạn trong hệ gen ty thể phần lớn được nghiên cứu theo hướng sử dụng phương pháp phân tử xác định các đột biến mất đoạn, sử dụng các phương pháp định lượng nhằm xác định số bản sao đột biến và sử dụng phương pháp thống kê nhằm tím ra mối liên quan của các đột biến với bệnh ung thư Các kết quả thu được liệt kê:

 Năm 1995, Đột biến mất đoạn 50 bp xảy ra trong vùng điều khiển D – Loop của hệ gen ty thể trong ung thư dạ dày [8]

 Đột biến mất đoạn 4977bp, 3938bp, 4388bp, 4576bp xuất hiện trong ung thư vú, đặc biệt mất đoạn 4576bp không xuất hiện trong các mô vú bính thường, mà xuất hiện với tần số 13% ở các mô vú lân cận mô bính thường và 77% ở các mô ung thư [42]

 Đột biến mất đoạn 3895 bp xảy ra giữa 2 đoạn trính tự dài 12 bp lặp lại ở hai đầu tại

vị trì 536 – 548 và 4430 – 4442 trên những vị trì da khác nhau tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng trên cơ thể và các mô da được lấy ở các vị trì không có biểu hiện ác tình và bệnh nhân ung thư da [32] Sự khác nhau về số bản sao (hàm lượng) mtDNA trong tế bào ung thư và tế bào bính thường, việc định lượng đột biến mất đoạn mtDNA trong các khối u và dịch cơ thể có thể là những chỉ thị sinh học tiềm năng trong chẩn đoán và phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm [23,24,41]

1.3 UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG VÀ MỐI LIÊN HỆ VỚI ĐỘT BIẾN MẤT

ĐOẠN 4977 BP XẢY RA TRONG DNA TY THỂ

1.3.1 Ung thƣ đại trực tràng

Khái niệm: Ung thư là một bệnh lý ác tình của tế bào, khi bị kìch thìch bởi các tác

nhân gây ung thư, tế bào tăng sinh một cách vô hạn, không theo cơ chế kiểm soát và phát triển của cơ thể Các tế bào ung thư có thể lan truyền đến các bộ phận khác của cơ thể qua máu và hệ bạch huyết [2] Các dạng ung thư có thể xuất hiện từ nhiều loại mô khác nhau của

cơ thể và hầu hết được đặt tên theo cơ quan hoặc loại tế bào, nơi bắt đầu hính thành ung thư [30] Ung thư đại trực tràng hay còn gọi là ung thư ruột kết (colon cancer) là ung thư biểu

mô, bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng, thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau ví thế thường được gọi chung là ung thư đại trực tràng [2,29] Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới hiện nay, chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong các trường hợp được chuẩn đoán là do

ung thư

Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng: Ung thư đại trực tràng bắt nguồn từ một polyp tuyến

khởi sinh Có 2 dạng polyp phổ biến ở ung thư đại trực tràng là: polyp không phải khối u, không phát sinh ung thư sau này và polyp ác tình, sẽ phát triển thành u tuyến nhỏ với mức độ loạn sản cao rồi thành u tuyến lớn và dần hính thành ung thư xâm lấn Tuy nhiên, một vài nghiên cứu lại cho rằng nguy cơ mắc ung thư trực tràng tăng lên ở một số gia đính nhiều thành viên là do ảnh hưởng của dạng polyp không phải khối u [21, 35] Có 2 nhóm nguyên nhân chình gây ra bệnh

này đó là:

 Yếu tố di truyền: Hoạt hóa các gen tiền ung thư, bất hoạt các gen ức chế khối u, sai hỏng trong sửa chữa DNA và di truyền gia đính

 Yếu tố không di truyền: các tác nhân vật lì, hóa học; quá trính lão hóa, chế độ ăn uống ìt xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá thường xuyên có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm loét đại tràng

Ngoài 2 nhóm nguyên nhân chình trên còn có các nguyên nhân khác như tuổi, giới tình, chủng tộc hay nhiễm vinyl chlorid, anabolic steroid hoặc các rối loạn trao đổi chất cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực tràng [21,35]

Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học:

Theo phân loại mô học của Tổ chức Y tế thế giới năm 2000, các u biểu mô đại trực tràng gồm các dạng: u tuyến, ung thư biểu mô, carcinoid (u nội tiết biệt hóa cao), ung thư

biểu mô tuyến – carcinoid kết hợp Ngoài ra, một số dạng hiếm gặp khác như sacom, u hắc tố

ác tình, ung thư biểu mô tế bào hính thoi, ung thư biểu mô tế bào sáng, ung thư biểu mô vảy đơn thuần [5]…

Hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng

Hiện nay có một số hệ thống phân giai đoạn ung thư được sử dụng rộng rãi trên thế giới Sự khác nhau giữa các hệ thống này phụ thuộc vào mục đìch của từng người sử dụng trong việc chẩn đoán và bệnh án của từng bệnh nhân [2, 9] Trong khuôn khổ luận văn này, tôi đề cập

đến Hệ thống TNM (Tumor–Lymph Node–Metastases) Hệ thống TNM phân giai đoạn ung

thư đại trực tràng dựa vào kìch thước, mức độ lan rộng của khối u đến các hạch bạch huyết

Trong đó:

T cho biết kìch cỡ, mức độ lan sâu vào thành ruột của khối u

N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chưa và số lượng hạch bạch huyết bị

lây nhiễm

M cho biết mức độ di căn của ung thư đến các cơ quan hoặc bộ phận khác của cơ thể

Các phương pháp chẩn đoán

Các phương pháp chẩn đoán bệnh này bao gồm:

 Chẩn đoán lâm sàng có thể dựa trên các triệu chứng

 Chẩn đoán hình ảnh: nội soi đại tràng sigma bằng ống soi mềm, làm sinh thiết

 Chẩn đoán mô học và tế bào học: kỹ thuật chọc hút kim nhỏ

 Chẩn đoán phân tử: PCR và một số các xét nghiệm sinh hóa CEA, xét nghiệm máu trong phân FOBT

1.3.2 Mối liên hệ giữa đột biến mất đoạn 4977 bp xảy ra trong mtDNA và ung thư đại

trực tràng

Trong số các mất đoạn xẩy ra trong mtDNA, mất đoạn 4977 bp xảy ra giữa 2 đoạn trính tự dài 13 bp lặp đi lặp lại ở hai đầu tại vị trì 8470–8482 và 13447–13495 thu hút được sự quan tâm lớn [31] Đoạn mất từ các nucleotide từ vị trì 8470 đến 13446, gồm gen mã hóa cho 4 polypeptide của phức hệ I (ND3, ND4, ND4L and ND5), 1 polypeptide của phức hệ IV và 2 polypeptide của phức hệ V và 5 tRNA, làm ảnh hưởng đến các gen mã hóa cho 13 polypeptide tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào và 5 trong số 22 tRNA cần thiết cho quá trính tổng hợp protein trong ty thể [51]

Đột biến mất đoạn 4977 bp xảy ra phổ biến trong hệ gen ty thể và được tím thấy trong nhiều loại ung thư khác nhau bao gồm ung thư vú, niêm mạc tử cung, thực quản, dạ dày, đại trực tràng, gan, phổi, miệng, thận, da và tuyến giáp Vai trò của loại đột biến mất đoạn này trong

sự hính thành khối u phần lớn chưa rõ ràng

1.3.3 Các phương pháp nghiên cứu biến đổi của gen trong ung thư

PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism): Nguyên lì cơ bản của phương pháp này là dựa vào tình chất của enzyme giới

hạn, có thể nhận biết một trính tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh nhỏ có chiều dài khác nhau Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo chiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel và được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot Phân tìch RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen cần phân

tìch [24,34]

SSCP (Single strand conformation polymorphism): Phương pháp phân tìch đa hính cấu hính

sợi đơn (SSCP) của phân tử AND Cấu trúc của DNA phụ thuộc vào trính tự nucleotide và bất cứ thay đổi nào trong đó cũng làm thay đổi cấu hính sợi đơn Khi điện di trên gel polyacrylamide không biến tình, các cấu hính khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau

và phân tách ra [28, 29]

DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography): Đây là phương pháp phân

tìch ADN dị sợi kép Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hính thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không

chình xác Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bính

thường [26, 27]

Realtime PCR: Trong sinh học phân tử, đây là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN

được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Kĩ thuật này cho phép phát hiện và định lượng tuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trính tự cụ thể của một mẫu ADN Hai phương pháp để định lượng là nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu với trính tự ADN kép

và lai sản phẩm với một đầu dò ADN đặc hiệu có gắn huỳnh quang Qua mỗi chu kí của phản ứng, lượng sản phẩm tăng lên dẫn đến sự gia tăng tỉ lệ phát huỳnh quang Qua đó có thể dựa

vào số đo huỳnh quang để định lượng chình xác lượng sản phẩm [19]

Giải trình tự: Giải trính tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide

A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) trên phân tử DNA Các phương pháp giải trính tự gene:

 Phương pháp hóa học giải trính tự DNA:

(1) Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trính tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P)

(2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA

(3) Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base ví phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung

(4) Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trên gel polyacrylamide biến tình các mạch đơn sẽ

bị dừng tại các vị trì khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau Từ đó, có thể đọc được trính tự của các nucleotide của đoạn DNA

 Phương pháp enzyme giải trính tự DNA (phương pháp dideoxyribonuleotide)

(1) Chèn các đoạn DNA cần phải xác định trính tự vào một vector là phage hay plasmid đã biết trính tự vị trì Đưa các vector vào tế bào vi khuẩn để nhân bản, sau đó tách chiết và tinh sạch

(2) Dùng các đoạn mồi hay dNTP được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ đặc hiệu Bổ sung DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (dNTP) và một lượng nhỏ ddNTP Sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trì mà ddNTP được bổ sung vào thay cho dNTP Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trì trính tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc

(3) Điện di trên gel polyacrylamide biến tình để xác định trính tự của đoạn gen bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trính tự của đoạn DNA

Ngày nay, Chỉ cần PCR là có thể nhân bản đoạn gene muốn giải trính tự thành hàng tỷ bản sao hoàn toàn giống hệt nhau và sản phẩm khuếch đại này có thể đưa vào giải trính tự trực tiếp mà không cần phải chèn vào một plasmid giải trính tự nữa [58]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu đột biến mtDNA ở Việt Nam

Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng đứng thứ năm trong số các dạng ung thư thường gặp, sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng và bệnh này có xu hướng ngày càng tăng cao Cần thiết trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm Tuy nhiên, các nghiên cứu về ung thư đại trực tràng ở Việt Nam hiện nay chủ yếu tập trung vào các dạng bệnh lý

và quá trính phát triển bệnh đơn thuần, rất ìt các nghiên cứu hướng tới việc tím ra các chỉ thị sinh học cho các giai đoạn phát triển bệnh để có những liệu pháp trị liệu kịp thời giúp tăng khả năng sống sót của bệnh nhân

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu: Mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng lấy tại vị trì khối u và mẫu

lân cận u lấy tại vị trì cách khối u khoảng 5-10 cm

Mẫu được cung cấp bởi: Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp – Hà Nội và Khoa

Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức – Hà Nội

Số lượng: 65 cặp mẫu

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất chình sử dụng trong quy trính: tách chiết DNA, điện di, PCR, RFLP… Các hóa chất đều có độ sạch phân tìch

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị và máy móc của phòng thì nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thì nghiệm trọng điểm Cộng nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên sử dụng trong nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ mô

Tiến hành: tách chiết DNA tổng số sử dụng kit tách chiết DNA từ mô QIAamp DNA Mini

Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trính của nhà sản xuất

2.2.2 Khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng PCR

Thiết kế 4 cặp mồi: mtDNA, 49771, 49772 và ND3 Các că ̣p mồi được thiết kế đặc hiệu sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer Premier 5 với trính tự mtDNA được tham khảo từ cơ sở

dữ liệu trong NCBI Trính tự các cặp mồi được trính bày ở Bảng 7

Bảng 7: Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

phẩm (bp) mtDNA f 5’ GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC  3’

433

r 5’ GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG  3’

49771 f 5’ TCA ATG CTC TGA AAT CTG TGG  3’

496

r 5’ GTT GAC CTG GGG TGA GAA G  3’

49772 f 5’ ACA GTT TCA TGC CCA TCG TC  3’

381

r 5’ GCG TTT GTG TAT GAT TTT GC  3’

ND3 f 5’ CCT GCC ACT AAT AGT TAT GTC  3’

246

r 5’ GAT ATG AGG TGT GAG CGA TA  3’

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Mồi mtDNA, 4977–1, ND3 Mồi 4977–2

2.2.3 Xử lý sản phẩm PCR khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng

enzyme HaeIII

Enzym HaeIII là enzyme endonuclease nhận biết DNA vớ i trính tự: 5’…G G C C…3’ Để kiểm tra tình chình xác của sản phẩm PCR của cặp mồi 4977–2 kìch thước 381bp Sản phẩm PCR

được xử lý với enzyme giới hạn HaeIII Trong trường hợp sản phẩm PCR thu được là chình xác sẽ chứa 2 vị trì nhận biết của HaeIII Khi cắt sẽ tạo thành 3 đoạn có kìch thước 141 bp,

183 bp và 57 bp Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc để quan sát kết quả

2.2.4 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR sử du ̣ng kit QIAQUICK gel extraction

Kit này được dùng để tinh sạch DNA có kìch thước từ 70bp đến 10kb từ gel agarose dạng chuẩn hoặc dạng low-melt trong đệm TBE hoặc TAE Với lượng agarose < 400mg có thể được tiến hành trên một cột Các thao tác được tiến hành theo quy trính của nhà sản xuất cung cấp

2.2.5 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose hay trên gel polyacrylamide: tùy thuộc vào

kìch thước sản phẩm sử dụng loại gel ở các nồng độ khác nhau để đạt hiệu quả cao nhất Sản

phẩm PCR được trộn với loading dye và nạp lên giếng điện di Bản gel sau điện di được nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia tử ngoại (UV) Hoặc nhuộm bạc và quan sát

dưới ánh sáng trắng

2.2.6 Phương pháp giải trình tự

Để khẳng định chình xác đột biến hay biển đổi người ta phải giải trính tự trực tiếp Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trính tự hiện nay đều dựa trên phương pháp enzyme giải trính tự Cấu tạo của một máy tự động giải trính tự gồm hai phần chình yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel Phần phát hiện

vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó

2.2.7 Tính toán thống kê

Xử lý các số liê ̣u phân tìch theo các phương pháp thống kê thường dùng So sánh các đă ̣c trưng thống kê mẫu bằng phép kiểm định thống kê 2 với mức ý nghĩa α = 0,05

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC LÂM SÀNG CỦA CÁC BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI

TRỰC TRÀNG TRONG NGHIÊN CỨU

Mẫu mô c ủa các bê ̣nh nhân ung thư đ ại trực tràng sử dụng trong nghiên cứu được thống kê

với các đă ̣c điểm bê ̣nh ho ̣c lâm sàng trong Bảng 12

Từ kết quả trong Bảng 12 cho thấy tính trạng mắc ung thư đại trực tràng tập trung nhiều hơn

hẳn ở nhóm tuổi trên 50 (76,9%), 100% là ung thư biểu mô tuyến

Bảng 12: Thống kê mẫu tách chiết DNA cu ̉ a bê ̣nh nhân ung thư đa ̣i trực tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng

Vị trì ung thư

Hạch

Loại mô bệnh học khối u Ung thư biểu mô tuyến 65 100

3.2 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ UNG THƢ ĐẠI

TRỰC TRÀNG

Sử dụng kit tách chiết DNA QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức) 65 cặp mẫu

mô (mẫu u và mẫu lân cận u) của 65 bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã được tách chiết thu

DNA tổng số Các mẫu DNA tổng số đã được tách chiết thành công sẽ được sử dụng để tiến

hành các bước nghiên cứu tiếp theo

3.3 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦA DNA TY

THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR

Sử dụng DNA tổng số đã được tách chiết ở trên làm khuôn cho phản ứng PCR Sử dụng các 4

cặp mồi mtDNA, 4977-1, 4977-2 và ND3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Kết quả đã

khuếch đại thành công đoạn gen trong vùng trính tự bảo thủ của mtDNA (433bp), đoạn gen

nằm trong vùng ND3 (246bp) và đoạn gen 381bp của các bản sao mtDNA bị mất đoạn

4977bp

Hình 11: Ảnh điện di sản phẩm PCR ở cả

mẫu u và lân cận u

1: Sản phẩm PCR cặp mồi mtDNA mô u

2: SP PCR cặp mồi mtDNA mô lân cân u

3: Sản phẩm PCR cặp mồi 4977–2 mô u

4: SP PCR cặp mồi 4977–2 mô lân cân u

5: Thang chuẩn 100bp fermentas

6: Thang chuẩn 250bp Biolab

7: Sản phẩm PCR cặp mồi ND3 mô u

8:Sp PCR cặp mồi ND3 mô lân cân u

Hình 12: Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR có đối chứng âm

1: SP PCR cặp mồi mtDNA mô u 2: SP PCR cặp mồi mtDNA mô lân cận u 3: Đối chứng () cặp mồi mtDNA

4: Sp PCR cặp mồi 4977–2 mô u 5: Sp PCR cặp mồi 4977–2 mô lân cận u 6: Đối chứng () cặp mồi 4977–2

7: Sp PCR cặp mồi ND3 mô u 8: Sp PCR cặp mồi ND3 mô lân cận u 9: Đối chứng () cặp mồi 10398

Mặt khác, trên cùng một bệnh nhân mà cho cả sản phẩm PCR đột biến mất đoạn 4977-2 và

cho cả sản phẩm ND3 Chứng tỏ mtDNA có cả bản sao đột biến mất đoạn và cả bản sao

không xuất hiện đột biến mất đoạn có hiện tương không đồng nhất heteroplasmy ở các bản

sao mtDNA

Đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA có thể xuất hiện ở cả mẫu mô u và lân cận u hay

chỉ xuất hiện ở mô u hoặc mô lân cận u mà không xuất hiện ở loại mô còn lại Và cũng có

trường hợp đột biến không xẩy ra ở cả mô u và mô lân cận u

Hình 13: Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trường hợp có đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA

Giếng 1: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cân u bệnh nhân số 1

Giếng 2: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u của bệnh nhân số 1

Giếng 3: Đối chứng âm của cặp mồi 4977-2

Giếng 4: Thang chuẩn 100bp của fermentas

Giếng 5: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cận u của bệnh nhân số 2

Giếng 6: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u bệnh nhân số 2

Giếng 7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô lân cân u của bệnh nhân số 3

Giếng 8: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 mô u của bệnh nhân số 3

Đột biến 4977-2 có thể xẩy ra với các mức độ biểu hiện khác nhau, có thể xuất hiện ở cả 2 loại mô (mô u và mô lân cận u) như trườn hợp bệnh nhân ở giếng 1 và 2 Nhưng cũng có thể chỉ xuất hiện ở mô lân cận u như trường hợp bệnh nhân ở giếng số 5, 6 Ngược lại, có trường hợp đột biến chỉ xuất hiện ở mô u như trường hợp bệnh nhân ở giếng 7, 8

3.4 KẾT QUẢ XỬ LÝ SẢN PHẨM PCR SỬ DỤNG CẶP MỒI 4977–2 BẰNG

ENZYME GIỚI HẠN

Để kiểm tra tình chình xác của sản phẩm PCR kìch thước 381 bp (cặp mồi 4977–2), chúng tôi

tiến hành xử lý sản phẩm PCR với enzyme giới hạn HaeIII Trong trường hợp sản phẩm PCR thu được là chình xác sẽ chứa 2 vị trì nhận biết của HaeIII nên khi cắt sẽ tạo thành 3 đoạn có

kìch thước 141 bp, 183 bp và 57 bp Sản phẩm của quá trính xử lý với enzyme cắt được điện

di kiểm tra cùng với sản phẩm PCR trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium và quan sát dưới

tia UV bước sóng 245 nm (Hình 14)

Hình 14: Ảnh kết quả xử lý sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 với enzyme giới hạn (điê ̣n di trên gel agarose 1,3%, nhuộm ethidium bromide)

Giếng 1: Sản phẩm PCR cặp mồi 4977–2 trước khi cắt bằng HaeIII của mô lân cận u

Giếng 2: Sản phẩm PCR được cắt bằng HaeIII của mẫu mô lân cận u

Giếng 3 : Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 trước khi cắt bằng HaeIII mô u

Giếng 4: Sản phẩm PCR được cắt bằng HaeIII của mẫu mô u

Giếng 5: Thang ADN chuẩn 100 bp

Từ kết quả thu được trong Hình 14 chúng tôi nhận thấy: sản phẩm PCR trước khi cắt bằng

HaeIII chỉ xuất hiện trên bản điện di 1 băng duy nhất kìch thước 381 bp, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng HaeIII trên bản điện di xuất hiện 3 băng kìch thước 141, 183 bp, 57 bp Tiến hành xử lý sản phẩm PCR (cặp mồi 4977–2) trên tất cả các mẫu có đột biến mất đoạn chúng tôi đều thu được các kết quả tương tự nhau Như vậy, sản phẩm 381 bp thu được nhờ kỹ thuật PCR một lần nữa lại được khẳng định, không có sự khuếch đại nhầm và đạt độ tin cậy để tiến hành các phân tìch tiếp theo

3.5 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ SẢN PHẨM PCR CỦA ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN

4977 bp CỦA mtDNA

Sau khi cha ̣y PCR thu s ản phẩm đột biến mất đoạn 4977-2, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm bằng kìt tinh sạch DNA của QIAgen Sản phẩm thu được kiểm tra trên gel polyacylamide 8%, nhuộm ethidium bromide Sản phẩm đạt độ tinh sạch mong muốn được gửi đi giải trính tự trực tiếp Đọc kết quả giải trính tự dựa trên phần mềm Sequence scanner

V1.0 So sách trính tự bằng phần mềm bioedit Trính tự thu được từ việc giải trính tự được so

sánh với trính tự mtDNA trên cơ sở dữ liệu NCBI

Hình 15: Phần mềm đọc kết quả giải trình tự bioedit so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu NCBI

Sau khi kiểm tra trính tự thu được, so sánh chúng với nhau và so sánh với trính tự mtDNA của NCBI, kết quả giải trính tự đã chỉ rõ đoạn DNA bi ̣ mất nằm giữa vi ̣ trí 8470 và 13446 3.6 PHÂN TÍCH MỐI LIÊN QUAN GIƢ̃A ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦA DNA TY THỂ VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC LÂM SÀNG CỦA BÊNH UNG THƢ ĐẠI TRƢ̣C TRÀNG

Từ các kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi tiến hành phân tìch mối liên hệ giữa đột biến mất đoạn 4977 bp của mtDNA và đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

3.6.1 Khảo sát đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân ung thƣ đại

trực tràng theo vị trí mô

Nhằm đánh giá mối liên hệ giữa đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA với vị trì của mô đại

trực tràng, chúng tôi đã thống kê tỷ lệ % đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA theo mẫu mô

u và mẫu mô lân cận u Kết quả trính bày ở Hình 16