Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Abstract: Tổng quan về đột biến Gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:

Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN

ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Abstract: Tổng quan về đột biến Gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung

thư đại trực tràng: Ty thể; Ung thư đại trực tràng; Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư đại trực tràng Tiến hành nghiên cứu: Tách chiết ADN tổng số từ mô; Khuếch đa ̣i đoa ̣n gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR ; Phân tích RFLP; Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn; Tinh sạch ADN Trình bày và đánh giá các kết quả đạt được: Kết quả phân tích đột biến điểm A3243G của Gen tARN Ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP; Kết quả phân tích đa hình A10398G của Gen ND3 ADN Ty

thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Đột biến gen; Ung thư đại trực tràng; Ty thể; Di

truyền học hóa sinh

Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến các bệnh ty thể được xem

là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể như một chỉ thị sinh học đang phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các dấu chuẩn di truyền của mẹ… Trong số các lĩnh vực này phải

kể đến ung thư – đề tài thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học

Ung thư đại trực tràng là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản ở nam giới và ung thư vú ở nữ giới Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm khoảng 600000 trường hợp mới được phát hiện [79] Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thư đường tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thư dạ dày Để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt Với sự phát triển của khoa học, ngày nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể, đang ngày càng góp phần vào công tác chẩn đoán và điều trị bệnh có hiệu quả

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”

với mục đích:

 Phát hiện đột biến gen tARN và ND 3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP

 Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen tARN và ND 3 của ADN ty thể với các

đặc điểm lâm sàng của bê ̣nh ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam

Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 TY THỂ

1.1.1 Hệ genome ty thể

Ty thể có chứa ADN, do đó nó là một hệ di truyền tự lập khác với hệ di truyền của nhân

tế bào ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thước 16569bp, gồm hai chuỗi khác

nhau về thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể Trong 37 gen này có 13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch

mã của ty thể [10] (hình 1) Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng của ty thể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong ribosome của tế bào chất

Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trưng riêng, phân biệt với hệ gen nhân Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ, có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào Các tế bào khác nhau có số lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng trong mô [60] Hệ gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất ít các bazo không mã hóa ở giữa chúng Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các codon kết thúc mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen ty thể không tham gia mã hóa Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi polypeptide được mã hóa trong ty thể [41]

Hình 1 Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]

Các đặc điểm của hệ gen ty thể như không có intron, không có histon bảo vệ, lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của ADN ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51] Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại

(wild type) không bị đột biến, tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy) ADN ty thể

có thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể là như nhau Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện lâm sàng hay

cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới ngưỡng đột biến [51] Vì vậy, xác định được mức độ không đồng nhất của đột biến ADN ty thể có ý nghĩa cao trong chẩn đoán bệnh ty thể

1.1.2 Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể

Những đặc điểm của hệ gen ty thể được phát hiện từ đầu những năm 1980, và tới năm

1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các bệnh đã được tìm thấy [68] Bệnh ty thể là thuật ngữ được dùng để chỉ một nhóm các bệnh gây ra do các hư hại trong quá trình tạo ATP Khi lượng ATP được sinh ra thấp hơn nhu cầu tối thiểu của mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự

hư hỏng của các protein tham gia vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa Số lượng các phân tử ADN

ở các mô, các cơ quan là khác nhau do có nhu cầu năng lượng khác nhau Bởi vậy, các mô bị ảnh hưởng nhiều nhất của đột biến ADN ty thể là hệ thống thần kinh trung ương, cơ xương, tim, thận, gan, tụy Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm sàng, hình thái và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của bệnh rất biến đổi và khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa trẻ còn nhỏ [57] Tuy nhiên, hiện nay, do tiến

bộ của các phương pháp sinh học phân tử, việc xác định bệnh ty thể đã có nhiều khả quan Các nghiên cứu dịch tễ học trong những năm gần đây cho thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan đến đột biến gen phổ biến ở người, ảnh hưởng tới ít nhất 1 trên 5000 người trong quần

cư dân [22] (hình 2)

Hình 2 Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]

Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở người được phát hiện Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi Ngoài ra, nhiều đột biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một người có thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình [57] Các nghiên cứu cho thấy đột biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch Các đột biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới các bệnh ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và ngoại biên

1.1.3 Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thƣ

Mối liên quan giữa sự mất chức năng của ty thể với bệnh ung thư đã được Otto Warburg lần đầu tiên phát hiện ra từ những năm 1930, khi ông giả thiết rằng sự tăng tốc độ của quá trình đường phân hiếu khí trong nhiều loại mô u là do sự hư hại chuỗi hô hấp trong những tế bào này [70] Theo Warburg, một số biến đổi của ty thể có liên quan đến ung thư là những đột biến của ADN ty thể, những biến đổi trong sự biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp

Hoạt động của chuỗi hô hấp của ty thể có liên quan với sự tạo thành các loại oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS) Trong điều kiện các electron bị thừa quá mức (ví dụ như khi nhu cầu calo tăng lên), hoặc do sự ức chế phức hệ enzym chuỗi hô hấp, các ROS được tạo ra

rất nhiều Sự tăng của ROS, hoặc stress oxy hóa có thể gây đột biến ADN ty thể và nhân, làm hư hại các thành phần lipid và protein nội bào Hệ gen ty thể đặc biệt dễ dàng chịu tác dụng của ROS do phân bố gần chuỗi hô hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51] Đột biến ADN

ty thể có thể gây ra sự biểu hiện khác thường của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển điện tử được mã hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa Khi chuỗi vận chuyển điện tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và ROS, làm biến ðổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa protein và quá trình tổng hợp nucleotide của tế bào Như vậy biến đổi của hệ gen ty thể có liên quan đến bệnh ung thư [27] Một số đột biến ADN ty thể đã được xác định trong nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư vú, đại trực tràng, buồng trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở vùng ghi mã

và vùng không ghi mã [19] (hình 3) Cho đến nay nhiều dạng biến đổi ADN ty thể đã được xác định trong ung thư Các biến đổi này bao gồm: đột biến điểm, thêm hoặc mất base, lặp đoạn, mất đoạn và thay đổi số lượng bản sao ADN ty thể

Hình 3 Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thƣ [19]

Đột biến điểm

Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú, Tan và cs (2002) đã giải trình tự genome ty thể trên 19 cặp mô ung thư và mô bình thường của cùng bệnh nhân và đã cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81,5% đột biến thuộc vùng D-loop, phần còn lại (18,5%) được xác định trong các gen 16S rRNA, ND2 và ATPase 6 [58] Trong số các đột biến trên, đột biến thêm hoặc mất base chiếm 42% thuộc vùng D-Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng ghi mã và không ghi mã [55]

Đột biến ADN ty thể được tìm thấy ở bệnh ung thư đại trực tràng Polyak và cs đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5, cytochrome b, COXI, COXII

và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S và 16S [53]

Với bệnh ung thư buồng trứng, Liu và cs đã xác định được 60% đột biến ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột biến điểm T→C hoặc G→A Bốn vùng có các đột biến này là D-Loop, 12sRNA, 16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có khả năng bị đột biến cao trong bệnh ung thư buồng trứng [45]

Phân tích ở bệnh ung thư dạ dày, Wu và cs đã xác định được 48% mang đột biến soma ở vùng D-Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc mất base tại vị trí nucleotide 303-

309 (vị trí D310) [72]

Mất đoạn

ADN ty thể bị mất một đoạn lớn, như mất đoạn 4977 bp, đã được xác định ở ung thư vú [14], ung thư đại trực tràng [21] Trong một nghiên cứu khác, Burgart và cs đã tìm thấy đột biến mất đoạn nhỏ (50bp) trong vùng D-Loop ở 4/32 (12,5%) bệnh nhân ung thư dạ dày [17]

Thêm đoạn

Wu và cs đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp và ≈520bp) trong vùng Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của 1 bệnh nhân ung thư dạ dày [72] Hai đột biến này

D-đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau

Thay đổi số bản sao ADN ty thể

Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung thư Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung thư đại trực tràng [44] Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác định thấy ở bệnh ung thư vú [63],

ung thư biểu mô tế bào gan [42], ung thư buồng trứng [69] Như vậy biến đổi về hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung thư

Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó Ví dụ như các đột biến trong vùng D-Loop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy Mặt khác, đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa lại có thể làm tăng số bản copy, như là một cách để đáp ứng lại sự mất chức năng của ty thể [38]

1.2 UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1 Khái quát về ung thƣ đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng hay còn gọi là ung thư ruột kết (colon cancer) bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao gồm các đoạn ruột kết lên (ascending colon), đoạn ngang (transverse colon) và đoạn xuống (descending colon) Trực tràng

(rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối giữa đại tràng và hậu môn (hình 4) Ung thư

thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng, thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau vì thế thường được gọi chung là ung thư đại trực tràng [79]

Hình 4 Hình ảnh đại trực tràng [76]

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới hiện nay, chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong các trường hợp được chẩn đoán là do ung thư Hàng năm, trên thế giới có khoảng 1 triệu ca mắc mới và trên nửa triệu ca tử vong Tỉ lệ mắc bệnh không giống nhau, ước tính tỉ lệ bệnh nhân ở các nước phát triển (Mỹ, Nhật) cao gấp 4–10 lần các nước đang phát triển Trên thực tế, số lượng bệnh nhân ở cả hai nhóm nước đang gia tăng nhanh chóng do

sự già hóa dân số và đời sống ngày càng được nâng cao Ung thư đại trực tràng thường được phát

hiện ở giai đoạn sau 45–50 tuổi, ở tuổi 70 là đa số (khoảng ½ số người), tuy nhiên bệnh có xu hướng trẻ hóa do chế độ ăn uống, sinh hoạt, sử dụng nhiều rượu bia, thuốc lá [78]

1.3 ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.3.1 Đột biến gen tARN của ADN ty thể

Đột biến điểm tARN ty thể là đột biến chiếm phần lớn trong các đột biến ty thể gây ra bệnh ty thể Hai đột biến tARN được phát hiện đầu tiên là A8344G trên tRNALys và A3243G trên tARNLeu(UUR) là phổ biến và được nghiên cứu nhiều nhất Đột biến A3243G có liên quan đến rất nhiều biểu hiện lâm sàng và thường gây ra hội chứng MELAS [31] MELAS cũng có thể bị gây

ra bởi những đột biến khác trên tARNLeu(UUR) Đột biến A8344G liên quan đến chứng MERRF, cũng là bệnh về cơ thần kinh Bệnh này còn có thể bị gây ra bởi một vài đột biến khác trên tRNALys [56] Ngoài ra, có thể kể đến đột biến A7445G trên tARNSer(UCN) có liên quan đến bệnh mất thính giác [54], đột biến A4269G trên tRNAIle gây bệnh liệt cơ tim hoặc liệt mắt cơ ngoài tiến triển mãn (CPEO) [59] (hình 6)

Hình 5 Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59]

Đột biến A 3243G trên gen MT -TL1 mã hóa cho tRNA Leu (UUR)

đã được phát hi ện ra đầu tiên như là một nguyên nhân di truyền của b ệnh MELAS [31] Đột biến A 3243G liên quan tới MELAS là một tro ng số những đột biến gây bê ̣nh phổ biến nhất của ty thể với tần số đư ợc xác định trong khoảng từ 0,95- 18,4/100000 dân số B ắc Âu [22] Đột biến điểm mtDNA A 3243G được gây ra bởi sự thay thế Adenine ở vi ̣ trí 3243 thành Guanine trên gen mã hóa cho tRNALeu

của ADN ty thể Đột biến này làm thay đổi nucleotide của bộ ba đối mã dẫn đến ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp protein ty thể và giảm hoa ̣t đô ̣ng của các ph ức hệ của chuỗi hô hấp [28] 1.3.2 Đa hình A10398G

Vị trí nucleotide 10398 trên gen ND3 trong hệ genom ty thể người có tính đa hình cao

Đa hình này làm biến đổi Threonine (alen A) thành Alanine (alen G) ở đầu C của dưới đơn vị ND3 của phức hệ I của chuỗi hô hấp Đa hình 10398A tăng trong các bệnh thoái hóa thần kinh tuổi già như bệnh Parkinson [66], Alzheimer [65], và bệnh teo cơ xơ cứng [48] Ngoài ra trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc đã cho thấy alen G trong thay thế 10398AG làm tăng nguy cơ gây hội chứng chuyển hóa [34]

A10398G là một trong những SNP thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học bởi

nó có liên quan với việc tạo thành những khối u Canter và cs (2005) lần đầu tiên phát hiện mối liên quan giữa đa hình 10398A với bệnh ung thư vú trên những người phụ nữ Mỹ gốc Phi, nhưng không thấy mối liên hệ nào ở người Mỹ da trắng Các tác giả cho rằng sự tương tác giữa các yếu

tố gen và môi trường có thể gây ra sự khác nhau giữa các tộc người [18] Tuy vậy, trong một số nghiên cứu khác trên đối tượng là phụ nữ Mỹ gốc Phi không thấy vai trò của đa hình 10398A đối với sự phát triển của ung thư vú [55] Trong nghiên cứu này, các tác giả đã giải thích sự khác nhau về kết quả của các nghiên cứu này là do sự khác nhau của các điều kiện trong các khu vực địa lý khác nhau Bai và cs (2007) khi nghiên cứu trên 156 người phụ nữ Mỹ gốc Âu mắc bệnh ung thư vú và 260 mẫu đối chứng thấy rằng 10398G có liên quan với làm tăng nguy cơ ung thư

vú [12] Một nghiên cứu độc lập khác cũng phát hiện 10398G có liên quan với sự phát triển ung thư vú trên đối tượng là người Ba Lan [25] Khi nghiên cứu trên đối tượng là người Mỹ gốc Phi mắc ung thư tiền liệt tuyến, người ta thấy rằng 10398G làm tăng tỷ lệ và mức độ ác tính của bệnh Trong một nghiên cứu khác, 10398G được tìm thấy ở bệnh ung thư tuyến giáp [74] Nghiên cứu của Choi và cs (2011) đã xác định vị trí 10398 trên gen ND3 là điểm nóng gây đột biến ở bệnh ung thư phổi [23] Theo trình tự ADN ty thể sửa lại của Cambridge, base kiểu dại là

A, tuy vậy ở nhiều quần thể G lại là kiểu dại [11] Kết quả của các nghiên cứu về đa hình A10398G còn nhiều trái ngược và chưa kết luận được alen nào có liên quan đến bệnh lý

1.3.3 Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh

Các đột biến ADN ty thể phần lớn ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy), các đặc điểm lâm sàng của bệnh chỉ biểu hiện khi tỷ lệ không đồng nhất này đạt đến một mức độ nhất định tùy thuộc vào loại mô, tế bào Bởi vậy để chẩn đoán được bệnh chính xác và kịp thời, người ta thường sử dụng các kỹ thuật phân tích trực tiếp ADN ty thể

Phương pháp PCR-RFLP

Phương pháp cơ bản và được sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến điểm của ADN

ty thể là PCR-RFLP Đây là sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP) Đầu tiên, đoạn ADN ty thể có chứa đột biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau đó được cắt bởi enzym giới hạn thích hợp Cuối cùng, các đột biến sẽ được nhận biết qua phổ băng điện di Phương pháp PCR-RFLP giúp phát hiện đột biến thuận lợi, nhanh chóng và không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền

Phương pháp giải trình tự

Để khẳng định chính xác đột biến, người ta phải xác định trình tự nucleotide đoạn ADN mang đột biến Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy)

Phương pháp Realtime PCR

Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lượng ADN được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang PCR định lượng cho phép xác định số bản sao ADN ty thể ban đầu có trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)

Phương pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) tại nhiệt độ tối ưu Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường [43] Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ty thể, hoặc một vùng nhất định của ADN ty thể để xác định đột biến Để định lượng mức độ không đồng nhất của ty thể, người ta đã xác định mối quan

hệ giữa diện tích của đỉnh sắc ký có dị sợi kép và mức độ không đồng nhất của ty thể Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột biến ADN ty thể thấp tới 1% [43]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến ADN ty thể ở người Việt Nam vẫn chưa nhiều,

số liệu còn hạn chế và chưa có tính hệ thống

Phan Văn Chi và cs (2004) khi nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc người Việt Nam

đã tìm thấy một số biến đổi của ADN ty thể ở người Việt Nam thuộc vùng D-loop, các gen ND1,

ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA 16S, COXI, COXII, COXIII, ATP6, ATP8

Ngoài ra, trong nghiên cứu này đã tìm thấy đột biến A3243G ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột biến) [2]

Chu Văn Mẫn và cs (2009) đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp giải trình tự ADN và đã xác định thấy đột biến A3243G có mặt ở bệnh nhân và mẹ bệnh nhân trong một gia đình có người mắc hội chứng MELAS [4]

Phạm Hùng Vân và cs (2010) đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp ADN ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, và đã xác định thấy 9/12 ca có đột biến ADN ty thể, 7 trong số 9 ca này mang đột biến G11778A là đột biến nặng và thường gặp nhất, 2 ca còn lại mang đột biến T14484C [8]

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nghĩa đã sử dụng phương pháp giải trình tự tách dòng, và đã xác định thấy nhiều đột biến (tại 14 vị trí) trên vùng D-Loop ở một người lao động thường xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa [5]

Liên quan đến xác định đột biến ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư người Việt Nam, kết quả thu được còn rất ít Cho đến nay, chúng tôi chỉ tìm thấy 1 nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú [1] Nghiên cứu được thực hiện với số mẫu hạn chế (2 bệnh nhân) Kết quả phân tích đã cho thấy có đột biến điểm và đột biến mất đoạn 280 bp trong vùng D-loop của bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam

Như vậy, như đã tổng quan ở trên, các nghiên cứu điều tra trên thế giới đã cho thấy đột biến ADN ty thể liên quan chặt chẽ với nhiều loại bệnh, nhất là bệnh ty thể và bệnh ung thư Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh nhân cần được chẩn đoán càng sớm, càng tốt Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu những biến đổi của các gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng với mục đích tìm ra mối liên quan giữa những biến đổi này với các đặc điểm lâm sàng của bệnh, từ đó giúp cho việc việc chẩn đoán sớm và theo dõi sau điều trị của bệnh ung thư đại trực tràng được tốt hơn