Phân tích bộ nhiễm sắc thể (karyotype) ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Phân tích bộ nhiễm sắc thể karyotype ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh Đặng Thị Nhâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Chuyên ngành:Sinh học thực ng

Phân tích bộ nhiễm sắc thể (karyotype) ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh

con bị dị tật bẩm sinh

Đặng Thị Nhâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Chuyên ngành:Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Rực

Năm bảo vệ: 2011

Abstract Trình bày tổng quan về Bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng sảy thai

liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh: Lược sử nghiên cứu về nhiễm sắc thể người; Tiêu chuẩn và qui định quốc tế về đặc điểm bộ nhiễm sắc thể người; Tình hình nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh trên thế giới; Tình hình nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh ở Việt Nam Trình bày các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu: Lập hồ sơ bệnh án di truyền; Phương pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi để thu hoạch cụm kỳ giữa, phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype; Xử lý số liệu Trình bày kết quả và thảo luận: Tuổi của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh; Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh; Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh; Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể giữa người vợ và người chồng ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh; Các biểu hiện về rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh; Các kiểu chuyển đoạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh; Sự phân bố các kiểu rối loạn

về số lượng nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Keywords Sinh học thực nghiệm; Di truyền học; Nhiễm sắc thể; Dị tật bẩm sinh;

Content:

1 Lý do chọn đề tài

Ở những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh có thể do nhiều nguyên nhân như nhiễm trùng, hocmon, các bệnh mãn tính, bất thường tử cung, bất thường NST… Đặc biệt đối với thai sảy sớm (dưới 3 tháng trong thời kỳ mang thai) thì phôi thai mang bất thường NST đóng vai trò chủ yếu Trường hợp này nguyên nhân có thể do bố hoặc mẹ mang rối loạn NST cân bằng dẫn đến không phân ly NST ở các cặp NST nào đó tạo nên những giao tử bất thường và nguy cơ mang thai bất thường cao có thể chết trong thời kỳ bào thai hoặc sinh ra những đứa trẻ dị tật bẩm sinh

Ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh ra con bị dị tật bẩm sinh sẽ tạo gánh nặng về tâm lý và kinh tế cho bệnh nhân, gia đình bệnh nhân và xã hội Xét nghiệm và phân tích NST ở những cặp vợ chồng này nhằm tìm ra nguyên nhân gây sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đồng thời đưa ra lời khuyên di truyền góp phần chăm sóc sức khỏe sinh sản ở cộng đồng và xã hội

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu NST và những báo cáo về những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh mang rối loạn NST cân bằng như chuyển đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn…

Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có nhiều phòng xét nghiệm di truyền tế bào như Viện nhi Trung ương, Viện Sản Trung ương, phòng Di truyền tế bào bệnh viện Từ Dũ, bộ môn Y Sinh học – Di truyền trường Đại học Y Hà Nội làm xét nghiệm và phân tích NST ở những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh góp phần trong chẩn đoán và đưa ra những lời khuyên di truyền

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích bộ nhiễm sắc thể (karyotype) ở

những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh”

2 Mục tiêu của đề tài

Phát hiện các trường hợp rối loạn NST ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

3 Đối tượng nghiên cứu

Từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 10 năm 2011, tổng số 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh từ các bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai… đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền , trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST

4 Tính cấp thiết của đề tài

Sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh là một vấn đề không ít các cặp

vợ chồng gặp phải và để lại tâm lý nặng nề, bất hành cho gia đình và xã hội Nhiều nghiên cứu đã đưa ra tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng

có hoàn cảnh nói trên

Việc tìm ra căn nguyên của sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh sẽ giúp cho các bác sỹ di truyền, bác sỹ sản khoa tư vấn di truyền và có những biện pháp giảm thiểu tỷ lệ sinh con dị tật

Vì vậy tiến hành đề tài nghiên cứu với mục tiêu là phát hiện các trường hợp rối loạn nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh là cần thiết

5 Bố cục luận văn

Luận văn dày 66 trang kể cả phụ lục, 75 tài liệu tham khảo Trong đó có 10 bảng, 12 hình

Đặt vấn đề 1,5 trang, tổng quan tài liệu 20 trang Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 5 trang Kết quả và bàn luận 31 trang Kết luận 1 trang Tài liệu tham khảo 8 trang

6 Nội dụng

Lược sử nghiên cứu về nhiễm sắc thể người

Công trình của Tjio, J.H và Levan (1956) kết hợp xử lý nhược trương và colchicine đã công bố nghiên cứu xác định lại bộ NST 2n của người là 46 NST chứ không phải là 48 NST và công trình này đã được Ford và Hamerton khẳng định

Từ năm 1968 đến năm 1970, là sự ra đời của các kỹ thuật nhuộm băng cho phép các nhà di truyền học đánh giá chính xác tới từng chiếc NST trong bộ NST và phát hiện rối loạn cấu trúc NST Từ sau 1970 trở đi, lần lượt với các kỹ thuật nhuộm băng Q, băng G, băng R, băng C, băng T, N và nhuộm băng có độ phân giải cao NST, dùng BrdU (Bromodeoxyuridin) gắn vào ADN trên NST và nhuộm phân biệt chromatit chị em đã mở ra thời kỳ phát triển mạnh mẽ của tế bào di truyền học người ứng dụng các kỹ thuật băng để phát hiện các bất thường tinh tế đặc trưng trên từng NST ứng với các bệnh, tật, các hội chứng trong lâm sàng

Từ năm 1980 đặc biệt là sau năm 1985 là thời kỳ phát triển mạnh mẽ, vượt bậc của di truyền tế bào lâm sàng và di truyền phân tử ứng dụng trong nghiên cứu

bộ gen loài người Trong di truyền tế bào lâm sàng thì việc nghiên cứu NST chủ yếu vẫn áp dụng các phương pháp nhuộm băng NST

Tiêu chuẩn để xếp loại nhiễm sắc thể trong lập karyotype

Lúc đầu người ta chỉ căn cứ vào chiều dài của NST để căn cứ và đặt tên cho chúng từ 1 đến 23 theo thứ tự từ dài đến ngắn (công ước Denver 1960), nhưng ngay sau đó cũng năm 1960 Patau không đồng ý và đề xuất thêm tiêu chuẩn vị trí phần tâm, sau này được quốc tế chính thức chấp nhận

Phân loại nhiễm sắc thể

Ở người bộ NST 2n = 46 trong đó có 22 cặp NST thường (autochromosome)

và 1 cặp NST giới tính (sex chromosome) Dựa vào đặc điểm hình thái như độ dài,

vị trí tâm động người ta sắp xếp các NST thành từng nhóm 46 NST người được chia thành 7 nhóm, kí hiệu là A, B, C, D, E, F và G trên nguyên tắc dài trước ngắn sau, nếu các NST bằng nhau thì tâm giữa đặt trước, tâm lệch đặt sau

 Nhóm A có 3 cặp NST có kích thước lớn nhất, gọi tên từ số 1 đến 3, cặp số 1 tâm giữa, cặp số 2 tâm lệch, cặp số 3 tâm giữa

 Nhóm B có 2 cặp NST số 4 và 5 Các NST này có kích thước lớn và đều có tâm lệch

 Nhóm C có 7 cặp từ số 6 đến 12 có chiều dài trung bình NST X cũng được xếp vào nhóm này Tất cả đều tâm gần giữa và khó phân biệt

 Nhóm D có 3 cặp từ số 13 đến 15 gồm các NST có nhánh ngắn rất ngắn, gần như không đáng kể gọi là các NST tâm đầu (acrocentric) Tất cả 3 cặp NST này đều có vệ tinh ở nhánh ngắn

 Nhóm E có 3 cặp 16, 17,18 tương đối ngắn NST số 16 tâm giữa, 17 và 18 tâm lệch

 Nhóm F có 2 cặp NST 19 và 20, ngắn và có tâm giữa

 Nhóm G có 2 cặp 21 và 22, kích thước ngắn và tâm đầu, có vệ tinh NST Y cũng được xếp vào nhóm này nhưng không có vệ tinh

Các rối loạn về bộ nhiễm sắc thể người

Rối loạn số lượng

* Đa bội thể: là hiện tượng tăng chẵn hoặc tăng lẻ cả bộ NST Ví dụ: ở người 3n =

69 NST = thể tam bội (3n) thuộc dạng thể đa bội lẻ, 4n = 96 NST = thể tứ bội (4n) thuộc dạng thể đa bội chẵn

Ở người, các trường hợp đa bội phần lớn phôi thai chết ở giai đoạn trước sinh, một vài trường hợp sống đến khi sinh hoặc sau sinh nhưng hầu hết là các sơ sinh bị dị tật

* Lệch bội: là hiện tượng số lượng NST của tế bào tăng lên hoặc giảm đi một hoặc

vài NST so với bộ NST lưỡng bội

Rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể

* Mất đoạn (deletion): là hiện tượng NST bị đứt rời ra một hoặc nhiều đoạn, đoạn

bị đứt rời ra không có tâm sẽ tiêu biến đi hoặc gắn sang NST khác, phần còn lại

mang tâm trở lên ngắn hơn bình thường Mất đoạn gồm các dạng: mất đoạn cuối đơn, mất đoạn cuối kép, mất đoạn giữa

* Chuyển đoạn (Translocation) Chuyển đoạn là hiện tượng trao đổi các đoạn của

NST Chuyển đoạn NST đã được xác định là hay gặp nhất trong rối loạn cấu trúc của NST [63] Có hai kiểu chuyển đoạn là chuyển đoạn tương hỗ (reciprocal translocation) và chuyển đoạn hòa hợp tâm (Robertsonian translocation)

* Lặp đoạn (duplication) là hiện tượng một đoạn nào đó của NST được nhân đôi

lên Lặp đoạn xảy ra khi 2 NST tương đồng ghép đôi với nhau không tương xứng trong kỳ đầu của phân bào giảm phân, có sự đứt của 2 NST và trao đổi đoạn giữa 2 đoạn khác nhau của 2 NST trong cặp tương đồng Trong trường hợp này có 2 NST

bị thay đổi cấu trúc, nhưng không mất đi hoặc tăng thêm vật liệu di truyền trong tế bào Khi các NST trong cặp tương đồng này phân ly nhau trong giảm phân sẽ tạo ra hợp tử mang NST lặp đoạn (trisomi từng phần) hoặc NST thiếu một đoạn có liên quan (monosomi từng phần)…

* Đảo đoạn (invertion) là sự bất thường cấu trúc do NST bị đứt ở hai điểm, đoạn

giữa hai điểm đứt quay ngược 1800 rồi nối lại, do đó một số gen bị đảo ngược thứ

tự so với đoạn ban đầu Có ba kiểu đảo đoạn: đảo đoạn ngoài tâm, đảo đoạn quanh tâm đối xứng, đảo đoạn quanh tâm không đối xứng

- Đảo đoạn ngoài tâm: hai chỗ đứt ở cùng một nhánh của NST và đoạn đảo không chứa tâm, NST không thay đổi hình thái

- Đảo đoạn quanh tâm đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh và cách đều tâm, NST không thay đổi hình thái

- Đảo đoạn quanh tâm không đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh, khoảng cách tâm không đều nhau, NST có cấu trúc lại và thay đổi hình thái

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

Những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp ít nhất từ hai lần trở lên hoặc sảy thai và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Tiêu chuẩn loại trừ

Những cặp vợ chồng có tiền sử mắc các bệnh mãn tính (viêm gan siêu vi trùng, bệnh đái đường…) hoặc có tiếp xúc với các loại hóa chất độc, thuốc bảo vệ thực vật, nghiện rượu hoặc thuốc lá… hoặc những cặp vợ chồng đang mang thai nhưng bị tai nạn lao động hoặc giao thông v v.…

Phương pháp nghiên cứu

- Lập hồ sơ bệnh án di truyền

- Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A (1965) [39]

- Phương pháp nhuộm băng theo Seabright M (1971) [65]

- Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype: theo tiêu chuẩn ISCN (2005) [67]

- Xử lý số liệu : bằng chương trình Microsoft Excel 2007

Kết quả

Trong thời gian từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 10 năm 2011, tổng số 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh được thăm khám lâm sàng tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai…đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotype, chúng tôi thu được kết quả như sau:

Tuổi của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Tổng số 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh Trong đó:

- Tuổi của người vợ thấp nhất là 19 tuổi, cao nhất là 40 tuổi, trung bình 28,94  4,3

- Tuổi của người chồng thấp nhất là 23 tuổi, cao nhất là 50 tuổi, trung bình 33  6

Nhìn chung các bệnh nhân trong nghiên cứu này phần lớn nằm trong độ tuổi

mà khả năng sinh sản là cao nhất

Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Trong tổng số 350 cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đã được xét nghiệm, phân tích NST và lập karyotype bao gồm: cán bộ viên chức (CBVC), công nhân, làm ruộng, bộ đội, lao động tự do

Các cặp vợ chồng trong nghiên cứu của chúng tôi thuộc các nhóm nghề khác nhau nhưng nhìn chung đều không phải tiếp xúc với các chất đồng vị phóng xạ, các loại hóa chất độc hại, các thuốc bảo vệ thực vật Những bệnh nhân này đã được chỉ định xét nghiệm di truyền để xác định xem họ có bị rối loạn ở mức độ NST hay không, mà những bất thường này có thể là nguyên nhân gây sảy thai sớm và sinh con bị dị tật

Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con

bị dị tật bẩm sinh

Trong số 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp hoặc sảy thai và sinh con bị dị tật bẩm sinh được xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotype chúng tôi đã phát hiện có 24 cặp vợ chồng ở 1 trong 2 người (người vợ hoặc người chồng) mang rối loạn NST (chiếm tỷ lệ 6,86%), 326 cặp vợ chồng (chiếm tỷ lệ 93,14%) có karyotype bình thường (46,XX hoặc 46,XY)

Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể giữa người vợ và người chồng ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi, trong tổng số 24 cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh có biểu hiện rối loạn NST (hoặc ở người vợ hoặc ở người chồng), trong đó chúng tôi phát hiện có 16 người vợ (chiếm

tỷ lệ 66,67%) và 8 người chồng (chiếm tỷ lệ 33,33%)

Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng phát hiện trong số các cặp vợ chồng có biểu hiện rối loạn NST thì biểu hiện rối loạn gặp ở người vợ là cao hơn ở người chồng

Các biểu hiện về rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Khi phân tích NST của 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) chúng tôi phát hiện trong số 24 trường hợp mang rối loạn NST có 21 trường hợp (chiếm tỷ lệ 87,5%) có biểu hiện rối loạn về cấu trúc và 3 trường hợp (chiếm tỷ lệ 12,5%) là rối loạn về số lượng ở cặp NST giới tính và ở thể khảm với hai dòng tế bào Trong 21 trường hợp rối loạn về cấu trúc có 19 trường hợp là chuyển đoạn, 1 trường hợp mất đoạn và 1 trường hợp đảo đoạn

Các kiểu chuyển đoạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Khi phân tích NST ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh chúng tôi đã phát hiện có 19 trường hợp mang chuyển đoạn trong đó:

- 11 trường hợp chuyển đoạn tương hỗ bao gồm 6 người vợ và 5 người chồng

- 8 trường hợp chuyển đoạn hòa hợp tâm bao gồm 6 người vợ và 2 người chồng

Sự chuyển đoạn tương hỗ giữa các nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng mang nhiễm sắc thể chuyển đoạn

Trong số 21 cặp vợ chồng có biểu hiện về rối loạn cấu trúc mà chúng tôi phát hiện được thì rối loạn cấu trúc kiểu chuyển đoạn tương hỗ xảy ra ở 11 cặp vợ chồng (hoặc ở người vợ hoặc ở người chồng) chiếm tỷ lệ 52,38% tổng số các rối loạn cấu trúc Đó là sự chuyển đoạn xảy ra giữa 2 NST khác cặp tương đồng

Sự phân bố các kiểu chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa các nhóm

Trong 8 trường hợp mang chuyển đoạn hòa hợp tâm có 4 trường hợp có kiểu chuyển đoạn giữa các NST nhóm D với nhóm D: t(D/D) trong đó phát hiện 3

trường hợp ở người vợ và 1 trường hợp ở người chồng 3 trường hợp có kiểu chuyển đoạn giữa NST nhóm D với NST nhóm G: t(D/G) trong đó 2 trường hợp xảy ra ở người vợ và 1 trường hợp ở người chồng 1 trường hợp có kiểu chuyển đoạn giữa NST nhóm G với NST nhóm G: t(G/G) xảy ra ở người vợ

Chúng tôi cũng phát hiện các trường hợp mang chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa NST nhóm D với NST nhóm D phần lớn xảy ra giữa NST số 13 và NST số 14, một dạng chuyển đoạn thường gặp nhất ở người [13], trong 4 trường hợp mang chuyển đoạn giữa NST nhóm D với NST nhóm D được phát hiện có 3 trường hợp là chuyển đoạn giữa NST số 13 và NST số 14, t(13q;14q), gặp ở 2 người vợ và 1 người chồng, 1 trường hợp là chuyển đoạn giữa NST số 13 và NST số 13, t(13q;13q), gặp ở 1 người vợ

Sự phân bố các kiểu rối loạn về số lượng nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh

Tổng số 24 trường hợp có biểu hiện rối loạn NST, trong đó 21 trường hợp có biểu hiện về rối loạn cấu trúc (87,5%), 3 trường hợp có biểu hiện về rối loạn số lượng NST (12,5%) Trong số các rối loạn về số lượng chúng tôi phát hiện thấy có

sự rối loạn ở cặp NST giới tính và ở thể khảm với 2 dòng tế bào gặp ở người vợ hoặc ở người chồng Trong đó 1 trường hợp ở người vợ karyotype là 46,XX/47,XXX (96% là 46,XX, 4% là 47,XXX), 1 trường hợp ở người chồng karyotype là 46,XY/47,XXY (95% là 46,XY, 5% là 47,XXY) và 1 trường hợp người vợ karyotype là 45,X/46,XX (95% là 46,XX, 5% là 45,X)

Kết luận:

Kết luận 1: Phân tích karyotype của 350 cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con

bị dị tật đã phát hiện 24 cặp có rối loạn NST Những rối loạn này biểu hiện cả ở người vợ và cả người chồng, rối loạn về cả số lượng và cấu trúc

Kết luận 2: Đã phát hiện có sự rối loạn về số lượng NST ở 3 cặp (12,5%) tất cả đều

biểu hiện ở NST giới tính, trong đó 1 trường hợp 2n = 47 (XXX); 1 trường hợp 2n =

47 (XXY) và 1 trường hợp 2n = 45 (XO)