Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Trịnh Hồng Thái Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Tìm hiểu về ung thư đại trực tràng; chỉ thị sinh học trong ung thư đại trực tràng; các phương pháp nghiên cứu biến đổi gen liên quan đến bện

Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh

nhân ung thư đại trực tràng

Phạm Thị Bích

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: PGS TS Trịnh Hồng Thái

Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Tìm hiểu về ung thư đại trực tràng; chỉ thị sinh học trong ung thư đại trực

tràng; các phương pháp nghiên cứu biến đổi gen liên quan đến bệnh ung thư; Chemokine CXCL12 và vai trò trong ung thư đai trực tràng Nghiên cứu các mẫu mô, mẫu máu, hóa chất và các hóa chất khác Tìm hiểu các phương pháp nghiên cứu: tách chiết AND tổng số tứ mô, từ máu, khuyếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR Phân tích RFLP, khuyếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP cũng như dự đoán cùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phien mã của gen CXCL12 Đưa ra kết quả phân tích PCR-RFLP và kết quả phân

tích tình trạng METHYL hóa gen CXCL12

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen CXCL12; Bệnh nhân; Ung thư

Content

1.Mở đầu

Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư Bệnh tiến triển tương đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% Tuy nhiên bệnh thường được phát hiện ở giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế

Trên thế giới ung thư đại trực tràng luôn được các nhà sinh y học quan tâm, có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã được tiến hành Mục tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhưng chi phí cho xét nghiệm còn rất tốn kém[7].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát hiện chính xác giai đoạn ung thư là cần thiết Genomics và proteomics là những lĩnh vực nghiên cứu cho phép xác định các chỉ thị đặc trưng cho bệnh, phục vụ cho công tác chẩn đoán, điều trị và tìm nguyên nhân bệnh

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh

nhân ung thư đại trực tràng”, nhằm mục tiêu:

1 Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:

- Xác định được tính đa hình của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, so sánh với

các mẫu đối chứng

- Đánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXCL12 với các đặc điểm lâm sàng

của bệnh ung thư đại trực tràng ở Việt Nam

2 Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:

- Xác định được sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong các đảo CpG thuộc

vùng promoter của gen CXCL12

- Xác định được tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12

- Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc điểm bệnh học

lâm sàng của ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam

2 Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu :Gồm mẫu mô và mẫu máu

Mẫu mô ung thư đại trực tràng lấy tại vị trí khối u Mẫu so sánh là mô đại trực tràng lân cận, cách 5-10cm so với vị trí khối u đó Tổng cộng 25 mẫu mô được phân tích

Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội cung cấp Mẫu mô được cho vào ống eppendorf, vận chuyển về phòng thí nghiệm trong ni tơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu -80o

C

Máu người bình thường và người mắc bệnh ung thư đại trực tràng đã được chống đông bằng EDTA Mẫu máu người bệnh được lấy từ bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, Hà Nội gồm 42 mẫu (19 nữ và 23 nam) trong đó có:

Mẫu bệnh có độ tuổi từ 19 đến 87 tuổi, tập trung nhiều nhất ở khoảng trên 60 tuổi

Mẫu đối chứng gồm 44 mẫu, được lấy từ những người cho máu tình nguyện tại Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương

Hóa chất

- Cặp mồi CXCL12 dùng cho phân tích đa hình (F, R) (IDT, Mỹ), Agarose do hãng Invitrogen (Mỹ) cung cấp

- Enzyme: Proteinase K, Fastdigest® MspI của hãng Fermentas (Đức)

- Cặp mồi CXCL12 (U-f, U-r, M-f, M-r) (IDT, Mỹ) dùng cho phân tích methyl

- Sodium bisulfite (Sigma, Mỹ)

- Hydroquinone (Sigma, Mỹ)

- Enzyme HotStarTaq ADN Polymerase (QIAGEN, Đức)

- Enzyme CpG Methyltrasferase (M.SssI) (New England Biolabs, Mỹ)

- Kit tách chiết ADN từ mô: QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức)

- Kit tinh sạch ADN: QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức)

- dNTPs của Fermentas, Taq polymerase của hãng Biorad (Mỹ) cung cấp

- Phenol, Chloroform, Isopropanol của hãng Sigma Aldrich (Mỹ)

- Hóa chất nhuộm bạc: AgNO3, Na2CO3, HCHO…

- Acid boric, Tris-base, ETDA, ethanol,

- Tất cả các hóa chất được sử dụng đều có độ sạch phân tích

Thiết bị

- Máy li tâm, li tâm lạnh (Eppendorf, Đức)

- Thiết bị điện di ngang: Mini-Subcell GT (Bio-Rad, Mỹ)

- Thiết bị điện di đứng Mini-protein 3 (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy nhân gen PCR (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy Speed vac (Thermo Scientific, Mỹ)

- Ngoài ra còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tích, cân kỹ thuật, tủ lạnh -20o

C, máy vortex …

2.Phương pháp nghiên cứu

2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô

- Sử dụng kit tách chiết ADN từ mô QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất

2.2 Tách chiết ADN tổng số từ máu

ADN tổng số được tách chiết từ máu theo phương pháp của PitroChomczy và Nicoleta Sacchi [5] bằng cách dùng phenol: chloroform: isopropanol (25:24:1)

- Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8-1%

2.3 Phương pháp phân tích PCR- RFLP

Trình tự cặp mồi được tham khảo theo tài liệu công bố của Dimberg va cs, (2007) [1] để nhân đoạn gen CXCL12 dùng cho phân tích đa hình

Mồi xuôi: 5'- CAGTCAACCTGGGCAAAGCC -3'

Mồi ngược: 5'- AGCTTTGGTCCTGAGAGTCC -3'

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 2%, nhuộm ethidium bromide, và được soi trên đèn UV có bước sóng 245nm

Sau phản ứng PCR, chúng tôi thu được đoạn ADN có độ dài 302 bp Sản phẩm PCR được sử dụng để phân tích RFLP

2.4 Phân tích RFLP

Lọai enzyme được sử dụng là FastDigest® MspI của hãng Fermentas có tác dụng cắt nhanh

chỉ trong 5 -10 phút ủ ở 37o

C

2.5 Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP

Xử lý bisulfite ADN bằng kit DNA Methylation-Gold TM kit và xử lý bisulfite ADN theo phương pháp của Herman và cs (1996) [2]

Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen CXCL12

Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng là cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho phản ứng khuếch đại trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa ADN, được tham khảo từ bài báo của Wendt và cs, (2006) [3] và đã được kiểm tra lại sử dụng phần mềm MethBLAST và MethPrimer

Cặp mồi được thiết kế để nhân đoạn gen thuộc đảo CpG số 4 (theo MethPrimer) nằm trong

vùng promoter của gen CXCL12 với trình tự như sau:

CXCL12-Methyl (kích thước sản phẩm là 242 bp)

Mồi xuôi (M- f ): 5’- GGA GTT TGA GAA GGT TAA AGG TC - 3’

Mồi ngược (M - r) :5’- TTA ACG AAA AAT AAA AAT AGA CGA T - 3’

CXCL12-Unmethyl (kích thước sản phẩm là 241 bp)

Mồi xuôi (U-f) 5’ - GAG TTT GAG AAG GTT AAA GGT TGG - 3’

Mồi ngược (U- r) 5’ - TAA CAA AAA ATA AA ATA CAA CAA T - 3’j

2.6 Phân tích kết quả bằng phương pháp thống kê Sử dụng phép kiểm định thống kê χ2

với mức ý nghĩa α = 0,05 để đánh giá mối liên quan giữa tính đa hình gen CXCL12 và tình

trạng methyl hóa promoter của gen với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

3 Kết quả

3.1 Kết quả phân tích PCR- RFLP

3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu

Hình1 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu

(Điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide)

Giếng 1, 2, 3, 4: Mẫu thường

Giếng 5, 6, 7, 8: Mẫu bệnh

Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu được sạch, khá sắc nét và ít bị đứt gẫy Do đó, ADN tách chiết theo phương pháp này đủ điều kiện để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR

Hình2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

(Điện di trên gel agarose 2% và nhuộm ethidium bromide)

Giếng M: : thang chuẩn ADN 100bp; Giếng (-): Đối chứng âm

Giếng 1, 2, 3: Mẫu đối chứng; Giếng 4, 5, 6: Mẫu bệnh

Từ hình ảnh điện di, ta thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước 302 bp Các băng sáng rõ nét, không xuất hiện các băng phụ, chứng tỏ, không xảy ra hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu

1 2 3 4 5 6 7

8

3.1.3 Kết quả phân tích RFLP

Để phát hiện được tính đa hình trong đoạn gen CXCL12 sau khi khuếch đại đoạn gen này bằng phương pháp PCR, chúng tôi tiến hành ủ sản phẩm PCR với enzyme MspI Sau khi ủ 10

phút ở 37oC, sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel polyacrylamide 10% Kết quả được thể hiện

ở hình 5

Hình3 ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp, 202bp và

100bp

(Điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp

Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trước khi cắt bằng enzyme MspI

Giếng 2, 4, 6: sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme MspI của các giếng 1, 3, 5

Trên bản gel ta thấy xuất hiện những băng có kích thước khác nhau, có những mẫu sản phẩm PCR sau cắt chỉ cho 1 băng 302bp, có những mẫu cho 2 băng 202bp và 100bp lại có những mẫu sản phẩm bị cắt thành 3 băng 302bp, 202bp, 100bp Điều này chứng tỏ đã có sự đa hình nucleotide trong đoạn gen này Ta thấy sản phẩm cắt xuất hiện các băng có kích thước 302 bp,

202 bp và 100 bp, chứng tỏ đoạn gen 302 bp chỉ có một trình tự nhận biết duy nhất của

enzyme MspI và vị trí cắt chính là vị trí xảy ra đa hình nucleotide

Như vậy, có ba kiểu đa hình khác nhau như thể hiện trên bản gel Đó là đa hình kiểu dại, trên gel điện di chỉ xuất hiện hai băng (giếng 4), đột biến hoặc biến đổi dị hợp tử (xuất hiện 3 băng như ở giếng 6) và đột biến hoặc biến đổi đồng hợp tử (chỉ có một băng điện di ở giếng 2)

3.1.4 Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê

Qua quá trình nghiên cứu và sử lý số liệu chúng tôi nhận thấy ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng và mẫu đối chứng có sai khác mang ý nghĩa thống kê về kiểu gen và tần suất alen, điều

đó chứng tỏ đã có sự thay đổi đáng kể trong kiểu gen giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và

mẫu đối chứng, và sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của CXCL12 trong ung

thư đại trực tràng

3.2 Kết quả phân tích MSP

3.2.1 Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô

Sử dụng kit tách chiết ADN QIAamp ADN Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức), chúng tôi đã tách chiết được ADN từ 25 cặp mẫu mô của 25 bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Hình4 ảnh điện di ADN tổng số tách từ mô

(điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide)

Giếng 1, 2, 3, 4: Mẫu mô lấy cách khối u 5-10 cm

Giếng 5, 6, 7, 8: Mẫu mô lấy tại trung tâm khối u

Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu được sạch, đều sắc nét và rất ít bị đứt gẫy Do

đó, ADN tách chiết theo phương pháp này đủ điều kiện để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

3.2.2 Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã

của gen CXCL12

Chúng tôi tiến hành phân tích trên một đoạn trình tự dài 3000 nu (từ nucleotide 3001 đến 6001) Sử dụng phần mềm MethPrimer (Li Lab, UCSF) và phần mềm cpgplot (EMBOSS) để dự đoán các đảo CpG thuộc đoạn trình tự trên với các tiêu chuẩn (kích thước mỗi đảo ≥ 100

bp, tỷ lệ GC ≥ 50% và tỷ số CpG giữa giá trị quan sát trên giá trị mong đợi ≥ 0,6), chúng tôi thu được kết quả như sau

Hình 5 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer [6]

Sequence Name:

Sequence Length: 3001

CpG island prediction results

(Criteria used: Island size > 100, GC Percent > 50.0, Obs/Exp > 0.6)

5 CpG island(s) were found in your sequence

Size (Start - End)

Island 1 297 bp (137 - 433)

Island 2 161 bp (623 - 783)

Island 3 225 bp (891 - 1115)

Island 4 1346 bp (1174 - 2519)

Island 5 341 bp (2526 - 2866)

Hình 6 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot (EMBOSS)[4]

CPGPLOT islands of unusual CG composition

3001-6001 from 1 to 3001

Observed/Expected ratio > 0.60

Percent C + Percent G > 50.00

Length > 100

Length 297 (137 433)

Length 161 (623 7833)

Length 225 (891 1115)

Length 1346 (1174 2519)

Length 341 (2526 2866)

Kết quả khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter của

gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP

Hình7 ảnh điê ̣n di sản phẩm PCR của gen CXCL12

(điê ̣n di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

M: Thang chuẩn ADN 100 bp; giếng 1-4: Bệnh nhân số 1 (methyl hóa không hoàn toàn trên

mô lân cận u); giếng 5-8: Bệnh nhân số 2 (methyl hóa không hoàn toàn trên mô u); giếng 1,3,5,7: Unmethyl; giếng 2,4,6,8: Methyl.Trong đó Giếng 1, 2 là khảo sát trên mô u của bệnh nhân 1 Giếng 3, 4 là trên mô lân cận u của bệnh nhân số 1

Như vậy, bằng kỹ thuật MSP, chúng tôi đã nhân thành công trình tự nằm trong vùng

promoter của gen CXCL12

3.2.4 Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 ở

bênh ung thư đại trực tràng

Chúng tôi đã tiến hành phân tích MSP thành công trên 25 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, trong

đó có 20 mẫu khảo sát trên mô bệnh lấy tại vị trí ung thư của người bệnh và 16 mẫu trên mô lân cận cách 5cm so với vị trí ung thư, có 11/25 bệnh nhân được khảo sát thành công trên cả mô u và

mô lân cận u

Như vậy, qua thống kê ta thấy đối với riêng 11 bệnh nhân khảo sát thành công trên cả mô u và

lân cận u thì tỷ lệ methyl hóa xảy ra tại vùng promoter của gen CXCL12 trên mô u là cao hơn

hẳn (chiếm 63,63%) so với tỷ lệ đó trên mô lân cận u (chiếm 27,3) Trong khi đó, tỷ lệ unmethyl trên mô lân cận u lại cao (chiếm 72,7%), hơn so với tỷ lệ đó trên mô u (chiếm 63,63%) Tính chung trên cả mô u và lân cận u ở 11 bệnh nhân trên thì có 9 bệnh nhân (chiếm 81,81%) là bị methyl hóa trên một trong hai mô và chỉ có 2 bệnh nhân (chiếm 19,19%) là không bị methyl hóa trên mô nào

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

loại mô

M

Hình 8.Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u

U: unmethyl; M: methyl

Nhìn vào biểu đồ (hình 13) ta thấy rõ hơn sự khác biệt về tỷ lệ methyl và unmethyl giữa 2 loại

mô u và lân cận u Đối với mô u, tỷ lệ methyl cao gấp gần 2 lần (80%) so với tỷ lệ unmethyl (43,75%) Đối vối mô lân cận u thì tỷ lệ methyl lại thấp hơn (37,5%) so với tỷ lệ unmethyl (62,5%)

Tổng kết chung trên 25 bệnh nhân đã khảo sát thành công thì có tới 21 bệnh nhân (chiếm

84%) bị methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12, trong khi chỉ có 4 bệnh nhân (chiếm

16%) không có sự methyl hóa trên cả hai mô Qua 11 mẫu bệnh nhân khảo sát thành công trên

cả mô u và lân mô cận u ta thấy có những bệnh nhân xuất hiện cả băng methyl và unmethyl cùng lúc trên mô u hoặc mô lân cận u, những bệnh nhân như vậy gọi là bệnh nhân bị methyl hóa không hoàn toàn Còn những bệnh nhân có xuất hiện băng methyl trên cả mô u và mô lân cận u hoặc xuất hiện băng methyl trên mô u và unmethyl trên mô lân cận u là trường hợp bị methyl hóa hoàn toàn

Qua so sánh tỷ lệ methyl hóa giữa mẫu u và mẫu lân cận u ta thấy sự sai khác về tỷ lệ methyl giữa 2 nhóm mẫu này có ý nghĩa thống kê với p<0,05

Kết Luận

Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra được những kết luận sau:

1 Sử dụng kĩ thuật PCR-RFLP, đã xác định được tính đa hình của gen CXCL12:

Sự phân bố kiểu gen và tần xuất alen giữa nhóm đối chứng và nhóm bệnh khác nhau có ý

nghĩa thống kê (p<0,05) Sự phân bố kiểu gen và tần xuất alen CXCL12 không phụ thuộc vào

tuổi, vào vị trí ung thư, vào giới tính giữa nam và nữ, giữa ung thư trực tràng và đại tràng (p>0,05)

2 Đã xác đi ̣nh được 5 đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 và

vùng promoter dự đoán có vị trí tương ứng nằm trong đảo CpG số 4, đã nhân lên được đoạn ADN tương ứng với vùng promoter đã dự đoán

3 Bằng phương pháp MSP đã xác đi ̣nh được tỷ lê ̣ methyl hóa vùng promoter của gen

CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng là 80% ở mô u, và 37,5% ở mô lân cận u Sự sai

khác về tỷ lệ methyl hóa ở 2 nhóm mẫu này có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Tình trạng methyl

hóa của gen CXCL12 không phụ thuộc vào các đặc điểm lâm sàng của bệnh như tuổi, giới

tính, vị trí ung thư và các giai đoạn bệnh theo TNM (p> 0,05)

References

Tài liệu tiếng Việt

1 Nguyễn Như Hiền (2005), Di truyền ung thư, NXB ĐH Quốc gia Hà Nội, Hà Nội,

tr.12

2 Phạm Thu Huyền, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích tình trạng Methyl hóa

Promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”, Tạp chí y học Việt Nam tập 384(2), tr 72-77

3 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà

xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội

4 Nguyễn Thị Hồng Vân, Trần Thị Thùy Anh, Lương Tuấn Nghĩa, Lê Văn Quảng, Hà Hoài Nam (2011) “ Ứng dụng kỹ thuật PCR- SSCP để phát hiện các đột biến ở gen

sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền”, Tạp chí khoa học ĐH Quốc gia Hà Nội số 27(2), tr 315

Tài liệu Tiếng Anh

5 Anollés G.C., Gresshoff P.M (1994), “Staining Nucleic Acids with Silver: An

Alternative to Radioisotopic and Fluorescent Labeling”, Promega Notes Magazine

40, pp 13

6 Cindy A.E., Kathleen D., Kazuyuki K., Leonard B.S., Corey B., Darryl S., Peter V.D., Peter W.L (2000), “MethyLight: a high-throughput assay to measure ADN

methylation”, Nucleic Acids Research, 28(8), pp.32

7 Davuluri R.V., Grosse I., Zhang M.Q (2001), “Computational identification of

promoters and first exons in the human genome”, Nature Genetics, 29, pp 412-417

8 Dimberg J., Dienus O., Hugander A., Wågsäter D (2007), “Polymorphism and circulating levels of the chemokine CXCL12 in colorectal cancer patients”,

International Journal of Molecular Medicine, 19(1), pp 11-15

9 Herman J.G., Graff J.R., Myöhänen B.D., Baylin S.B.(1996), “Methylation-specific

PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands ”, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 93, pp 9821–

9826

10 Hidalgo-Pascual M, Galan J.J.,Chaves-Conde.M., Ramirez-Armengol J.A., Moreno C., Calvo E,Pelaez P., Crespo C., Ruiz A., Royo, and J.L (2007), “ Analysis of

CXCL12 3'UTR G&gt;A polymorphism in colorectal cancer”, Oncology Reports,

18(6), pp 1583-1588

11 Indrieux D., Escobar P., L azennec G (2009), “Emerging roles of chemokines in

prostate cancer”, Endocrine-Related Cancer, 16(3), pp 663-673

12 Kim M.S., Lee J., Sidransky D (2010), “ADN methylation markers in colorectal

cancer”, Cancer Metastasis Review, 29, pp 181-206

13 Li L.C., Dahiya R (2002), “MethPrimer: designing primers for methylation PCRs”,

Bioinformatics, 18(11), pp 1427-1431

14 Neiva K., Sun Y.X., Taichman R.S (2005), “The role of osteoblasts in regulating

hematopoietic stem cell activity and tumor metastasis”, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 38(10), pp 1449–1454

15 Rot A., Andrian U.H (2004), “Chemokines in innate and adaptive host defense:

Basic chemokinese grammar for immune cells”, Annual Review of Immunology, 22,

pp 891–928

16 Sanford D., Markowitz M.D., Bertagnolli M.M (2009), “Molecular Basis of

Colorectal Cancer”, The New England Journal of Medicine, 361(25), pp

2449-2460

17 Sun X., Cheng G., Hao M., Zheng J., Zhou X., Zhang J., Taichman R.S., Pienta K.J., Wang J (2010), “CXCL12/ CXCR4 / CXCR7 chemokine axis and cancer

progression”, Cancer Metastasis Review, pp.269-270

18 Tainsky M.A (2009), “Tumor Biomarker Discovery: Methods and Protocols”, Humana Press, New York, pp 520

19 Tones P.A., Baylin S.B (2002) The fundamental role of epigenetic events in

cancer”, Nature Reviews Genetics, 3(6), pp 415–428

20 Van Dijk D., Oostindiër M., Kloosterman W., Krijnen P., Vasen H.W (2007),

“Family history is neglected in the work-up of patients with colorectal cancer: a

quality assessment using cancer registry data”, Familial Cancer, 6(1), pp 131-134

21 Weber G.F (2007), “Molecular Mechanisms of Cancer”, Springer, Ohio, pp

453-462

22 Wendt M.K., Johanesen P.A , Kang N., Binion D., Shah V., Dwinell M.B (2006),

“Silencing of epithelial CXCL12 expression by ADN hypermethylation promotes

colonic carcinoma metastasis”, Oncogene, 25, pp 4986–4997