Phân lập vi khuẩn khử sulphate (SRB) để ứng dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động khai thác khoáng sản

Phân lập vi khuẩn khử sulphate SRB để ứng dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động Abstract: Nghiên cứu Acid Mine Drainage AMD và các vấn đề môi trường liên quan.. Keywords: Sinh vật

Phân lập vi khuẩn khử sulphate (SRB) để ứng dụng trong xử lý nước thải axit từ hoạt động

Abstract: Nghiên cứu Acid Mine Drainage (AMD) và các vấn đề môi trường liên quan

Xử lý AMD bằng phương pháp hóa học, sinh học Đặc tính sinh học của Sulfate reducing bacteria (SRB) Phân bố của SRB trong tự nhiên Đa dạng về di truyền của SRB Đặc điểm sinh lý của SRB Nhu cầu dinh dưỡng của SRB Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của SRB Cạnh tranh của SRB với các nhóm vi khuẩn khác trong môi trường Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng SRB mới phân lập Thử nghiệm xử lý

AMD trên mô hình phòng thí nghiệm

Keywords: Sinh vật học; Nước thải axit; Vi khuẩn; Xử lý nước thải; Phân lập vi khuẩn

Content

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 AMD (Acid Mine Drainage) và các vấn đề môi trường liên quan

1.1.1 Sự hình thành AMD

AMD (Acid Mine Drainage) được hình thành khi các khoáng sulfide (như pyrite, FeS2)

trong quặng tiếp xúc với oxy và nước (Brown và cs, 2002)

Hình 1.1 AMD từ khu khai thác quặng kim loại ở Việt Nam

Quá trình oxy hóa khoáng sulfide:

FeS2 + 7/2O2 +H2O → Fe2+

+ 2SO42- + 2H+ Như vậy AMD có hai điểm đặc trưng nhất là pH thấp và hàm lượng ion kim loại nặng cao

1.1.2 Ảnh hưởng của AMD tới môi trường

1.1.2.1 Ô nhiễm nguồn nước do AMD

AMD có ảnh hưởng lâu dài đối với các nguồn nước sông, suối, cũng như cuộc sống của các sinh vật (động, thực vật và con người) liên quan đến những nguồn nước này

Nước bị ô nhiễm AMD có thể có pH thấp từ 2 đến 4,5, gây độc với hầu hết các dạng sinh vật sống dưới nước (Hill, 1974) Ngoài cá, các sinh vật khác như côn trùng, tảo cũng giảm rõ rệt

về số lượng loài và số lượng cá thể khi pH trong môi trường giảm do AMD (Warner, 1971)

1.1.2.2 Ô nhiễm đất do AMD

Hoạt động khai thác mỏ và khai thác đá gây phá hủy nhiều vùng đất qua hàng trăm năm, trong

đó nhiều vùng không có khả năng phục hồi (Duffield và cs, 2000)

1.1.2.3 Tình trạng ô nhiễm do AMD ở Việt Nam

Theo báo cáo Đánh giá môi trường chiến lược Quy hoạch phát triển ngành than đến năm

2020, có xét đến năm 2030, các mối nguy hại do ô nhiễm nước thải từ các mỏ than thuộc Tập đoàn Công nghiệp than và Khoáng sản đã được đặt ra ở mức báo động

Dựa trên số liệu kê khai nộp phí bảo vệ môi trường đối với nước thải công nghiệp của các đơn vị thuộc ngành than, tổng lượng nước thải từ mỏ năm 2009 là 38.914.075 m3

Tuy nhiên con

số này chưa thể phản ánh đầy đủ thực trạng vì chưa thể tính được lượng nước rửa trôi từ các bãi thải mỏ

2011)

1.2 Xử lý AMD

1.2.1 Xử lý AMD bằng phương pháp hóa học

Các chất hóa học thường được sử dụng để xử lý AMD gồm CaCO3, Ca(OH)2, Na2CO3, NaOH và

NH3

Tuy phương pháp hóa học được sử dụng từ lâu và có hiệu quả nhanh chóng nhưng tốn kém và

không an toàn, thường gây ra những vấn đề ô nhiễm thứ cấp (Skousen và cs, 1996)

1.2.2 Xử lý AMD bằng phương pháp sinh học

1.2.2.1 Cơ sở khoa học của công nghệ

Vi khuẩn khử sulfate (SRB) là các vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận

điện tử cuối cùng để oxy hóa hydro hay các hợp chất hữu cơ và tận thu năng lượng cho mục đích

sinh trưởng (phản ứng 1.10)

2CH2O + SO42 + H+ H2S + 2HCO3 (1.10)

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình xử lý AMD bằng SRB

Là quy trình công nghệ dựa trên hoạt động của vi sinh vật, quá trình xử lý AMD bị chi phối bởi

các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất sinh lý, sinh hóa của SRB, cụ thể là:

SRB là vi khuẩn hô hấp kỵ khí, sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng để oxy hóa các

hợp chất hữu cơ đơn giản và hydro SRB phổ biến trong môi trường kỵ khí, nơi chúng có vai trò

quan trọng trong cả chu trình lưu huỳnh và chu trình cacbon (hình 1.2)

Hình 1.2 Vị trí của SRB trong chu trình cacbon và lưu huỳnh (Muyzer, Stams, 2008)

1.3.3 Đặc điểm sinh lý của SRB

1.3.3.1 Nhu cầu dinh dƣỡng của SRB

Hầu hết SRB có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản và sinh trưởng tốt trong môi trường có nguồn cacbon/năng lượng ổn định (Postgate, 1984) Nguồn cacbon và điện tử thích hợp đối với SRB bao gồm các axit hữu cơ mạch ngắn như acetate, lactate, pyruvate và rượu (Hao và cs, 1996

Phụ thuộc vào cách oxy hóa chất hữu cơ mà SRB có thể được phân chia thành hai nhóm trao đổi chất như sau (Widdel, 1988):

 Nhóm oxy hóa không hoàn toàn: oxy hóa các hợp chất hữu cơ đến acetate Thuộc nhóm

này chủ yếu là các loài thuộc chi Desulfovibrio spp

 Nhóm oxy hóa hoàn toàn: Oxy hóa các hợp chất hữu cơ (bao gồm cả acetate) hoàn toàn

thành CO2. Trong nhóm này có đa dạng các loài SRB khác nhau, như Desulfobacter spp., Desulfobacterium spp., Desulfosarcina spp

SRB thực hiện trao đổi chất oxy hóa các cơ chất hữu cơ sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng (Postgate, 1984) Sự khử sulfate thành sulfide tiêu thụ 8 điện tử và các quá trình sinh hóa thông qua nhiều bước trung gian với sự tham gia của nhiều enzyme (hình 1.4) (Fauque và cs, 199; Kremer, Hansen, 1988)

Hình 1.4 Các bước khử sulfate ở SRB và các enzyme tham gia

Phản ứng có thể được tóm tắt như sau (Peck và Lissolo, 1988):

 Mẫu nước thải AMD để thử nghiệm xử lý trong mô hình phòng thí nghiệm được thu thập

từ mỏ than Tràng Khê, Quảng Ninh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Làm giàu và phân lập SRB

Làm giàu SRB SRB trong mẫu nước thải thu thập về được làm giàu bằng cách cấy vào bình

serum chứa môi trường dịch thể kỵ khí nước ngọt cho vi khuẩn khử sulfate (bảng 2.1) với tỷ lệ 10%, nuôi trong tủ ấm 30oC Các lần cấy truyền tiếp theo được tiến hành sau mỗi 5 – 7 ngày nuôi cấy theo tỷ lệ 10% thể tích Qua mỗi lần cấy truyền, số lượng SRB trong mẫu được tăng lên

Phân lập SRB Mẫu làm giàu lần 4 được dùng để phân lập SRB Việc phân lập được tiến hành

theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) với môi trường có thành phần tương tự môi trường dùng trong làm giàu (Widdel, Bak, 1992) Ống thạch bán lỏng sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ mẫu làm giàu được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo ngược tại 30oC trong bóng tối Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng được tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể

2.2.2 Xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu

Nhiệt độ

pH

Độ muối

Chất cho điện tử

Chất nhận điện tử

2.2.3 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường và chủng thuần khiết

DNA tổng số của mẫu làm giàu và các mẫu thí nghiệm xử lý AMD trên mô hình được tách chiết theo phương pháp do Zhou và cộng sự (1996)

2.2.4 Phương pháp điện di biến tính DGGE

Hình 2.1 Vị trí đoạn gen 16S rDNA được sử dụng trong phân tích DGGE ở Lactobacillus

plantarum (Lopez và cs, 2003)

2.2.5 Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại

Gen 16S rDNA (1500 bp) của các chủng SRB thuần khiết được khuếch đại trong phản ứng

(GGTTACCTTGTTACGACT T) ( Weisburg và cs, 1991)

2.2.6 Phân tích hóa học

2.2.6.1 Định lượng Fe(II) bằng thuốc thử phenanthrolin (DIN 38406 E1-1, 1983)

Nguyên lý: O-phenanthrolin phản ứng với Fe(II) tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3  9,

đo được ở bước sóng 510 nm Nồng độ Fe(II) cho phép đo là 0,01  5 mg/l Kết quả của phép đo

có thể bị ảnh hưởng bởi ion Mn và Cu

2.2.7 Thiết kế mô hình xử lý AMD

Nguồn AMD: Nguồn AMD được thu thập từ mỏ than Tràng Khê ở Quảng Ninh có các đặc điểm lý hóa

như sau: pH = 4

Nồng độ sắt = 200 mg/l (tương đương 3,57 mM) Nồng độ sulfate = 1320 mg/l (tương đương 13,75 mM)

Giá thể: Phoi bào được lót dưới lớp đáy của bể xử lý

Nguồn vi sinh vật: Dịch làm giàu SRB sau lần cấy truyền thứ 4 (E1-4)

Chu trình xử lý:

Hình 2.2 Mô hình xử lý AMD trong phòng thí nghiệm 1) Bể điều hòa chứa AMD đầu vào; 2) Bể xử lý

AMD bằng SRB; 3) Bể lắng chứa nước thải đầu ra

Mô hình xử lý AMD được hoạt động với nguồn cơ chất cho SRB sinh trưởng được bổ sung từ bên ngoài là methanol hoặc nước thải có hàm lượng hữu cơ cao

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử sulfate (SRB) từ các mẫu nước thải

Hình 3.1 Hàm lượng sulfide của các mẫu làm giàu ở lần cấy truyền thứ 4

Trên cơ sở đó, E1-4 được sử dụng để tiến hành phân lập các chủng SRB thuần khiết

0 2 4 6 8 10

(a) (b)

Hình 3.2 Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử sulfate từ mẫu nước thải (a) – Mẫu làm giàu vi

khuẩn SRB E1-4; (b) – Khuẩn lạc SRB hình thành trong ống thạch bán lỏng

Ba chủng SRB được phân lập từ ống pha loãng 108 dựa trên hình thái khác nhau của khuẩn lạc (bảng 3.1)

Bảng 3.1 SRB phân lập được từ dịch làm giàu với mẫu nước thải E1-4

Hình 3.3 Hình thái tế bào của ba chủng SRB thuần khiết phân lập được từ mẫu dịch làm giàu

với nước thải

3.2 Vị trí phân loại của ba chủng SRB dựa trên trình tự gen 16S rDNA

Hình 3.6 Cây phân loại neibourgh joining dựa trên trình tự gen 16S rDNA gần đủ của các chủng

SRB mới phân lập so sánh với các loài SRB có quan hệ gần gũi Escherichia coli (

-Proteobacteria) được chọn làm outgroup

3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng SRB mới phân lập

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường tới mức tăng sinh và hoạt tính khử

sulfate của các chủng SRB mới phân lập

3.3.2 Ảnh hưởng của pH trong môi trường

Nồng độ sulfide OD600

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đối với hỗn hợp chủng SRB và mẫu làm giàu gốc (E1-4)

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Hỗn hợp 3 chủng SR2, SR3, SR4

Nồng độ sulfide OD600

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới mức tăng sinh và hoạt tính khử sulfate thành sulfide của

các chủng SRB mới phân lập

3.3.4 Chất cho điện tử và chất nhận điện tử

Bảng 3.2 Sinh trưởng của SRB với các chất cho và nhận điện tử khác nhau

3.4 Thử nghiệm xử lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm

Bảng 3.3 Tóm tắt thí nghiệm xử lý AMD trên mô hình phòng thí nghiệm

là nồng độ thực trong bể

Hình 3.11 Mô hình xử lý AMD trong phòng thí nghiệm

3.4.1 Xử lý AMD trong điều kiện bổ sung methanol (10mM) làm cơ chất

Hình 3.12 Mô hình xử lý AMD với cơ chất bổ sung là methanol (10 mM)

3.4.2 Xử lý AMD trong điều kiện bổ sung nước thải giàu hữu cơ làm cơ chất

Nồng độ sulfate pH

Hình 3.13 Mô hình xử lý AMD với cơ chất là nước thải có hàm lưỡng chất hữu cơ cao

Như vậy nước thải có hàm lượng hữu cơ cao có khả năng sử dụng làm cơ chất tốt cho vi khuẩn khử sulfate trong bể phản ứng xử lý AMD Việc kết hợp nước thải hữu cơ để xử lý AMD

có ý nghĩa quan trọng trong việc giảm giá thành công nghệ, đồng thời góp phần bảo vệ môi trường bởi các loại nước thải hữu cơ như nước thải từ chăn nuôi, chế biến thực phẩm, nước thải sinh hoạt

3.4.3 Phân tích thành phần quần xã vi sinh vật trong các mô hình xử lý AMD trong phòng thí nghiệm

Hình 3.14 Điện di biến tính (DGGE) gen 16S rDNA phân tích thành phần của quần xã vi khuẩn

trong mô hình xử lý AMD

KẾT LUẬN

1 Đã thiết lập được hỗn hợp SRB (mẫu E1-4) có hoạt tính tốt trong điều kiện pH thấp qua

phương pháp làm giàu

2 Phân lập được 3 chủng vi khuẩn khử sulfate SR2, SR3 và SR4 từ mẫu làm giàu nói trên Dựa

trên trình tự gần đủ của gen 16S rDNA các chủng này được định danh tương ứng là

Desulfomicrobium sp SR2, Desulfobulbus sp SR3, và Desulfovibrio sp SR4

3 Phân tích DGGE gen 16S rDNA cho thấy các chủng phân lập đại diện cho các nhóm SRB

chính trong mẫu làm giàu E1-4

4 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý của 3 chủng thấy rằng:

 Cả 3 chủng đều có khả năng sinh trưởng tốt ở môi trường có hàm lượng muối 10 – 15 g/l, tương ứng với môi trường nước lợ Đặc biệt là chủng SR4 có thể sinh trưởng tốt tại nồng độ muối 25 g/L, tương đương môi trường nước biển







SR3 SR2

*

SR2: Desulfomicrobium sp SR3: Desulfobulbus sp SR4: Desulfovibrio sp

**



 Cả ba chủng đều bị ức chế tại pH môi trường  6, tuy nhiên mẫu làm giàu gốc E1-4 thể hiện khả năng chịu pH thấp tốt hơn các chủng thuần khiết và sinh trưởng tốt ở pH

4 và 5

5 Mô hình thử nghiệm xử lý AMD với cơ chất bổ sung là nước thải có hàm lượng hữu cơ cao

đạt hiệu quả cao hơn khi sử dụng cơ chất đơn là methanol Kết quả thu được sau 7 ngày xử lý gồm: pH tăng từ 4 lên 8,15, nồng độ sulfate giảm từ 13,75 mM còn 4,5 mM, hàm lượng sắt giảm từ 200 mg/l còn 36 mg/l thể hiện khả năng ứng dụng thực tế của công nghệ

References

Tiếng việt

1 Công ty cổ phần tin học, công nghệ, môi trường, TCT Than & Khoáng sản Việt Nam

(2012), Kết quả phân tích nước thải mỏ than

2 Hồ Sỹ Giao, Mai Thế Toản (2010), “Những điểm nóng môi trường trong hoạt động khai thác

mỏ ở Việt Nam”, Hội nghị khoa học kĩ thuật mỏ quốc tế 2010

3 Bùi Công Quang (2011), “Tác động của các hoạt động khai thác mỏ đến nguồn nước và hệ

sinh thái”, Chuyên đề bảo vệ môi trường trong khai thác khoáng sản, ĐH Thủy Lợi

4 Nguyễn Danh Sơn (2011), “Môi trường và phát triển bền vững trong quản lý khai thác tài

nguyên khoáng sản ở Việt Nam”, Chuyên đề bảo vệ môi trường trong khai thác khoáng

sản, Viện Khoa học xã hội Việt Nam

Tiếng Anh

5 Bahr M, Crump BC, Ceraj VK, Teske A, Sogin ML, Hobbie JE (2005), “Molecular

chacterization of sulfate-reducing bacteria in a New England salt marsh”, Environ

Microbiol., 7, pp.1175–1185

6 Ben-Dov E, Brenner A, Kushmaro (2007), “Quantification of sulfate-reducing bacteria in industrial wastewater by real-time polymerase chain reaction (PCR) using dsrA and apsA

genes”, Microbiol Ecol.,54, pp 439–451

7 Brenner FJ (2001), “Use of constructed wetlands for acid mine drainage abatement and stream

restoration”, Water Sci Technol., 44, pp 449-454

8 Benner SG, Blowes DW, Ptacek CJ (1997), “A full-scale porous reactive wall for prevention

of acid mine drainage”, Ground Water Monit Remed., 17, pp 99-107

9 Bharathi PAL, Sathe V, Chandramohan D (1990), “Effect of lead, mercury and cadmium on a

Sulphate-reducing bacterium”, Environ Pollut., 67, pp 361–374

10 Boetius A , Ravenschlag K, Schubert KJ, Rickert D, Widdel F, Gieseke A, Amann R, Jùrgensen BB, Witte U, Pfannkuche O (2000), “A marine microbial consortium apparently

mediating anaerobic oxidation of methane”, Nature, 407, pp 623–626

11 Boschker HTS, Nold SC, Wellsbury P, Bos D, de Graaf W, Pel R, Parkes RJ, Cappenberg (1998), “Direct linking of microbial populations to specific biogeochemical

processes by 13C-labelling of biomarkers”, Nature, 392, pp 801–804

12 Boularbah A, Schwartz C, Bitton G, Morel JL (2006), “Heavy metal contamination from mining sites in South Morocco: 1 Use of a biotest to assess metal toxicity of tailings and

soils”, Chemosphere, 63, pp 802-810

13 Brookens AM, Schmidt WT, Branch WL (2000), The effectiveness of utilizing passive

treatment systems for leachate discharges in Western Maryland, Presented at the American

Society for Surface Mining and Reclamation 17thAnnual Meeting, Tampa, Florida, June 11-15, 2000

14 Brown M, Barley B, Wood H (2002), Minewater treatment: technology, application and

policy, IWA Publishing, London

15 Brysch K, Schneider C, Fuchs G, Widdel F (1987), “Lithoautotrophic growth of

sulphate-reducing bacteria, and description of Desulfobacterium autotrophicum gen nov., sp nov.”,

Arch Microbiol.,148, pp 264–274

16 Cabrera G, Pérez RJM, Gómez, Ábalos A, Cantero D (2006), “Toxic effects of dissolved

heavy metals on Desulfovibrio vulgaris and Desulfovibrio sp strains”, J Hazar Mater.,

135, pp 40-46

17 Chaney RL, Brown SL, Angle JS, Stuczynski TI, Daniels WL, Henry CL, Siebielec G, Li

YM, Malik M, Ryan JA, Compton H (2000), In situ Remediation/ Reclamation/Restoration

of Metals Contaminated Soils using Tailor-Made Biosolids Mixtures, Symposium on

Mining, Forest and Land Restoration: The Successful Use of Residuals/Biosolids/Organic Matter for Reclamation Activities, Denver, CO

18 Cooper EL, Wagner CC (1973), “The effects of acid mine drainage on fish populations”,

Fish and Food Organisms in Acid Waters of Pennsylvania, US Environmental Protection, EPA, pp 32-114

19 Cord-Ruwisch R (1985), “A quick method for the determination of dissolved and

precipitated sulfides in cultures of sulfate-reducing bacteria”, J Microbiol Meth 4, pp

33-36

20 Dar SA., Kuenen JG, Muyzer G (2005), “Nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in complex

microbial communities”, Appl Environ Microbiol., 71, pp 2325–2330

21 Dar SA, Stams AJ, Kuenen JG, Muyzer G (2007), “Co-existence of physiologically similar sulphate-reducing bacteria in a full-scale sulfidogenic bioreactor fed with a single organic

electron donor”, Appl Microbiol Biotechnol., 75, pp 1463–1472