Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim

Trình bày các kết quả nghiên cứu đạt được: Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập được 6 chủng có hoạt tính keratinaza; Các chủng này đều có khả năng sử dụng lông gà như là nguồn cacbon v

Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và

một số đặc tính của enzim

Lê Thị Thu Huyền

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: GS.TS Nguyễn Đình Quyến

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Tổng quan về cấu trúc và tính chất của keratin, tình hình khai thác và sử

dụng keratin hiện nay Tiến hành nghiên cứu phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim Trình bày các kết quả nghiên cứu đạt được:

Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập được 6 chủng có hoạt tính keratinaza; Các chủng này đều có khả năng sử dụng lông gà như là nguồn cacbon và nitơ duy nhất;

Cả 6 chủng này đều có một số đặc điểm giống chi Bacillus; Keratinaza từ 6 chủng phân lập được đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11 và trong khoảng nhiệt độ 30 - 600C; Chủng Kr2 có hoạt tính keratinaza cao nhất; pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của keratinaza của chủng này là pH = 9 và nhiệt độ 500C; Hoạt tính của keratinaza tăng khi trong môi trường phản ứng có mặt của một số ion : Na+, Ca2+, K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+ , ở nồng độ 1 mM và 5 mM; và giảm hoạt tính khi trong môi trường phản ứng có mặt một số ion như: Fe3+, Cu2+ ; Điều kiện nuôi tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza của chủng Kr2 là môi trường ban đầu có hàm

lượng lông là 20 g/l, pH = 7-8, nhiệt độ khoảng 350C

Keywords Vi sinh vật học; Vi khuẩn; Enzim; Hoạt tính Keratinaza

Content

MỞ ĐẦU

Keratin là nhóm các protein tự nhiên, là thành phần chính cấu tạo nên các loại lông, tóc, móng, sừng,… Lông gà trưởng thành chiếm 5 - 7% trọng lượng sống Trên thế giới, mỗi năm

có tới 24 tỉ con gà và khoảng 8,4 triệu tấn lông vũ được thải ra từ ngành công nghiệp gia cầm (31), mức tăng hàng năm cũng lên tới khoảng 4.5% (18) Hàm lượng protein trong lông vũ rất cao, chiếm tới trên 90%, nên có thể coi đây là một nguồn protein tiềm năng lớn có thể khai thác làm thức ăn cho chăn nuôi và nhiều ứng dụng khác

Tuy nhiên, keratin lại là loại protein rất bền nhờ có các liên kết disulfua trong phân tử Vì vậy, chúng có tính ổn định cơ học cao, có khả năng chống chịu tốt với tác động vật lý, hoá học và sinh học, không bị phân huỷ bởi nước và các proteaza thông thường như: trypsin, papain và pepsin

Các nhà máy thuộc da, lông thú và các lò giết mổ gia súc, gia cầm vứt bỏ một lượng đáng

kể các vật liệu chứa keratin: lông, len, sừng, móng,… Ở Việt Nam, chỉ một phần rất nhỏ trong số chúng được sử dụng chủ yếu trong sản xuất một số sản phẩm thủ công, may mặc;

phần lớn còn lại chỉ được loại bỏ và xử lý đơn giản như đốt, chôn hoặc chỉ là chất thành các đống rác lớn chưa có phương pháp xử lý gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng

Trên thế giới, trước đây người ta áp dụng phương pháp xử lý lông vũ bằng cách thuỷ phân trong môi trường kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao Tuy nhiên, phương pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin ( như: metionin, lysin, histidin) mà còn tiêu thụ một lượng lớn năng lượng Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phương pháp thay thế được lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục được những hạn chế của các phương pháp cũ Ngoài ra, bên cạnh việc tạo ra nguồn protein bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi,

xử lý được nguồn rác khó phân giải góp phần chống ô nhiễm môi trường thì keratinaza được phân lập từ vi sinh vật cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng công nghệ sinh học khác như: loại bỏ lông trong ngành công nghiệp thuộc da , làm sạch các vật cản lông

vũ trong các hệ thống nước thải, phòng chống bệnh bò điên (21),…

Tuy nhiên, một trong những hạn chế lớn ảnh hưởng đến sự ổn định độ pH kiềm tính của các enzym này là có sự ổn định trong một phạm vi pH rộng nhưng thường không ổn nhiệt Vì vậy, người ta mong muốn tìm kiếm các protease mới với những đặc tính mới lạ từ nhiều nguồn khác nhau (34)

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các

vi sinh vật có hoạt tính keratinaza, đặc điểm và ứng dụng của chúng, bước đầu phục vụ cho phân huỷ lông vũ dùng làm thức ăn cho gia súc đã đem lại hiệu quả tốt (4, 10, 11, 14, 16, 23,

26, 27, 42) Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực này chưa có nhiều và việc ứng dụng chúng còn rất hạn chế, hầu hết lông vũ từ các lò giết mổ chỉ được coi là rác thải;

cùng với đó, việc xử lý rác thải chưa được quan tâm nhiều Đề tài "Phân lập vi khuẩn có

hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim" được thực hiện nhằm:

- Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ các mẫu đất khác nhau và xác định được chủng có hoạt tính tốt nhất

- Một số điều kiện tối ưu về hàm lượng lông, nhiệt độ và pH môi trường nuôi cấy ban đầu cho nuôi chủng sinh keratinaza

- Một số đặc tính của enzim, như hoạt động tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ, pH và sự có mặt của những ion nào

Từ đó có thể ứng dụng vào thực tiễn góp phần xử lý rác thải lông vũ một cách hiệu quả, tận dụng một nguồn protein đang bị bỏ phí làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và có thể mở rộng sang nhiều ứng dụng khác nếu được tiếp tục nghiên cứu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA KERATIN

1.1.1 Cấu trúc của keratin

Keratin là nhóm các protein có cấu trúc dạng sợi với các đặc tính hoá lý cụ thể, là thành phần chính cấu tạo nên lông, tóc, móng, sừng, trong biểu mô của tế bào động vật có xương sống…

Trong số các loại axit amin tạo nên các phân tử keratin thì cystein là phổ biến nhất (có thể chiếm tới 24%), ngoài ra, keratin từ lông gia cầm còn chứa hàm lượng cao các axit amin như: glycin, alanin, serin và valin

Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin có hàm lượng lớn lưu huỳnh

có chứa trong cystein, tạo ra các cầu disunfua cho keratin

Keratin được tạo ra bởi các tế bào sừng - các tế bào sống tạo nên phần lớn của lông, tóc, móng, da,…Sau đó, các tế bào này chết và bao phủ bên ngoài có tác dụng bảo vệ

Keratin được phân loại cụ thể theo cấu trúc phân tử của chúng, đặc điểm hóa lý , các tế bào biểu mô sản xuất và loại biểu mô có chứa các tế bào sản xuất keratin

Theo cấu tạo, keratin có 2 loại chính:

-keratin

-keratin

1.1.2 Tính chất của keratin

Keratin là protein rất bền Do có axit amin cystein chứa lưu huỳnh có khả năng tạo liên kết với nhau bằng các cầu disunfua, tạo ra một dạng xoắn cực kì chặt chẽ, khiến keratin khá cứng chắc, bền nhiệt và rất khó hoà tan Keratin cũng khó bị phân giải bởi các proteaza thông thường như: trypsin, papain và pepsin Keratin không bị hòa tan trong dung dịch muối nhưng những protein này có thể hoà tan trong các dung dịch có chứa các chất biến tính, chẳng hạn như urê Keratin trong dung dịch có thể lắp ráp lại sợi trung gian

Tuỳ thuộc vào hàm lượng cystein và các cầu disunfua mà tạo ra các tế bào chứa keratin rất cứng như trong móng, guốc hoặc có thể linh hoạt hơn như trong da Hầu hết các tế bào chứa nhiều keratin mà ta gặp là các tế bào đã chết và có thể được rụng ra hoặc bị các tế bào mới đẩy lên Nếu các tế bào đã chết này được lưu giữ trong tình trạng tốt, chúng sẽ có tác dụng như 1 lớp cách điện, cách nhiệt, không thấm nước,… bảo vệ các tế bào phía dưới

1.1.3 Các nguồn keratin

Keratin tự nhiên được tạo ra từ các tế bào sừng của cơ thể Trong tự nhiên, keratin là thành phần chính cấu tạo nên các cấu trúc như lông, tóc, móng guốc, sừng, da,… của động vật Ở gà trưởng thành, lông chiếm 5 - 7 % khối lượng cơ thể; trong đó, keratin lại là thành phần chủ yếu Trên thế giới có tới vài triệu tấn lông vũ được tạo ra hàng năm từ ngành chế biến gia cầm và tỉ lệ tăng hàng năm là khoảng 4,5% (18) Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển của các ngành chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm đã tạo ra một lượng lớn keratin thô cần được xử lý

1.2 TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ SỬ DỤNG KERATIN HIỆN NAY

1.2.1 Tình hình khai thác và sử dụng keratin trên thế giới

Mặc dù nguồn keratin tự nhiên khá dồi dào, hàm lượng protein trong lông, tóc, móng,… rất cao; tuy nhiên, do tính bền vững mà keratin hầu như chưa được khai thác và sử dụng nhiều Chỉ một phần rất nhỏ lông, tóc, móng,… được sử dụng để làm các sản phẩm thủ công

mĩ nghệ, làm chăn ga gối, áo,

Ngành công nghệ sinh vi sinh trên thế giới đã và đang tìm kiếm các môi trường nuôi cấy

vi sinh vật với chất lượng cao và giá rẻ Việc sử dụng lông từ công nghiệp gia cầm làm cơ chất lên men là lựa chọn không tốn kém để sản xuất enzyme, protein…bằng công nghệ vi sinh nếu áp dụng hiệu quả

Trong công nghiệp, người ta nấu phần lớn lông thải ra dưới nhiệt độ và áp suất cao, sau

đó sử dụng làm nguồn protein bổ sung trong thức ăn gia cầm Rất nhiều đánh giá hiệu quả của sản phẩm này đã cho thấy chúng không dễ tiêu hoá và do quá trình xử lý nhiệt độ và áp suất phá huỷ một số axit amin, làm tăng sự mất cân bằng các axit amin thiết yếu

Do đó, cần có các phương pháp xử lý lông khác, tăng cường chất lượng dinh dưỡng của lông và phát triển các phụ phẩm hữu dụng Một trong các phương pháp hiệu quả cao sử dụng

vi sinh vật Vi sinh vật làm biến đổi cấu trúc keratin, thay đổi tính kháng các enzyme trong bộ máy tiêu hoá

Một số nơi trên thế giới đã nghiên cứu và sử dụng sản phẩm phân huỷ lông gà làm thức

ăn bổ sung protein cho chăn nuôi gia súc Sử dụng cách thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sản phẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn gia cầm

Keratinaza và các sản phẩm liên quan có nhiều ứng dụng (18) Ví dụ, lông thủy phân bởi

Bacillus licheniformis PWD-1 và Vibrio sp Bacillus licheniformis chủng kr2 (16, 42) có thể

được sử dụng như phụ gia thức ăn, trong khi keratinaza từ Bacillus subtilis 168M tái tổ hợp

có khả năng cạo lông đáng kể (1) Hơn nữa, keratinaza từ B licheniformis PWD-1 có thể làm

giảm hình thức lây nhiễm của prion, PrPSC, trong sự có mặt của chất tẩy rửa và xử lý nhiệt (21) Tuy nhiên trong thực tế, những ứng dụng này còn ít Phần lớn lông gia cầm từ các lò giết mổ bị coi là rác thải và chưa được xử lý triệt để, gây ô nhiễm môi trường và lãng phí một nguồn protein tốt

1.2.2 Tình hình khai thác và sử dụng keratin ở Việt Nam

Ở nước ta, cũng như trên thế giới, nguồn keratin thô vẫn chưa được khai thác và sử dụng đáng kể; đặc biệt là lông gia cầm; phần lớn thải ra từ các lò giết mổ đều chưa được khai thác

và xử lý hiệu quả Chúng thường bị tập trung lại thành các đống lớn; một số được chôn lấp, một số bị đốt, còn lại chưa được xử lý, gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trường xung quanh các lò giết mổ Hiện nay, ở nước ta cũng chưa có nhiều nghiên cứu nhằm sử dụng sản phẩm phân huỷ sinh học lông gia cầm làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi; vì vậy hầu như chưa có ứng dụng nào trong thực tiễn nhằm xử lý theo hướng này

1.3 SỰ PHÂN HUỶ KERATIN TRONG TỰ NHIÊN

Thời gian cần thiết để lông gà thực sự bị phân huỷ tự nhiên là 5 - 7 năm Trong tự nhiên, những vi sinh vật có enzim keratinaza có khả năng phân huỷ keratin gồm nhiều nhóm: nấm (

Aspergillus, Onygena, Absidia, Rhyzomucor, Alternaria radicina, Trichurus spiralis,

Stachybotrys atra,…), xạ khuẩn, vi khuẩn (7, 10, 13, 20, 22, 24, 25, 29, 30, 31, 35, 39, 43,

44, 45)

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN HUỶ KERATIN

1.4.1 Phương pháp lý hoá

Keratin có thể bị phân huỷ bởi các phương pháp lý hoá như thuỷ phân trong môi trường axit, môi trường kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao

Nghiên cứu đầu tiên của việc sử dụng nhiệt để cải thiện giá trị dinh dưỡng từ thức ăn phân huỷ lông vũ là của Draper (1944) Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm bổ sung thông tin nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng từ thức ăn lông vũ thuỷ phân (23)

Điều kiện chế biến có ảnh hưởng rõ rệt đến giá trị dinh dưỡng của thức ăn từ lông thuỷ phân Ở áp suất thấp và thời gian thuỷ phân dài có thể nâng giá trị dinh dưỡng và cải thiện khả năng tiêu hoá của động vật sử dụng thức ăn đó; tuy nhiên hiệu quả phân giải thấp

Thông thường, lông được thuỷ phân bằng cách đun trong một nồi áp lực từ 30 đến 45 pounds/square/inch trong 30 đến 60 phút Hiệu quả thuỷ phân có thể đạt 80 đến 85% Tuy nhiên, phương pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin (methionin, lysin, histidin), sản sinh một số chất độc, nên khó sử dụng sản phẩm phân huỷ theo cách này để làm thức ăn cho chăn nuôi hay tận dụng nguồn protein cho các mục đích khác Bên cạnh đó, phân huỷ lông vũ theo phương pháp này còn tiêu thụ một lượng lớn năng lượng

Nhiều nơi, keratin thô bị xử lý bằng cách đốt Phương pháp này tạo ra một số khí gây ô nhiễm môi trường đồng thời lãng phí nguồn protein từ keratin

1.4.2 Phương pháp sinh học

Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phương pháp thay thế được lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục được những hạn chế của các phương pháp

lý hoá Người ta đã tiến hành phân lập được các vi sinh vật bao gồm cả nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn với nhiều chủng có hoạt tính keratinaza cao được sử dụng trong việc phân huỷ lông vũ

và sử dụng sản phẩm phân huỷ đó làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi Chúng là loài

như: Doratomyces microsporus, Aspergillus sp, Alternaria radicina, Trichurus spiralis,

Stachybotrys atra, Onygena sp, Absidia sp, Rhizomucor sp , Streptomyces pactum, S albs, S thermoviolaceus, S fradiae , S.thermonitrificans , Flavobacterium pennavorans, Bacillus sp , Stenotrophomonas sp , Bacillus licheniformis và B pumilus và Vibrio sp

Những vi sinh vật này tiết keratinaza ngoại bào khi môi trường có keratin - phân huỷ keratin thành các axit amin hoặc các peptit ngắn, những chất này được vi sinh vật sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ

1.5 ĐẶC ĐIỂM CỦA KERATINAZA

Keratinaza là enzim thuỷ phân protein ngoại bào trong tự nhiên Keratinaza có tên IUB là

EC 3.4.99, có trọng lượng phân tử từ hàng chục đến vài trăm kDa Keratinaza chủ yếu được xếp vào nhóm proteaza serin do có đến 97% cấu trúc giống với cấu trúc của proteaza serin và cũng bị ức chế bởi các chất ức chế proteaza serin (7, 40)

Hầu hết các keratinaza đã phát hiện được cho đến nay là serin proteaza (5, 7, 12, 22), và một vài Metallo proteaza (6)

Hầu như tất cả các keratinaza là enzim cảm ứng và các vật liệu có chứa keratin khác nhau như lông, tóc và lông cừu có thể được sử dụng làm chất nền cho keratinaza sản xuất (17) Trong đó, lông là chất nền chủ yếu được sử dụng Keratinaza ở vi sinh vật chỉ được tạo thành khi môi trường có mặt keratin Các keratinaza của vi sinh vật có vai trò sinh học rất quan trọng đối với mục tiêu thuỷ phân các liên kết ngang disulfua bền vững của các hợp chất keratin Nó chủ yếu tấn công vào các liên kết -S-S- của phân tử keratin Cơ chế phân giải phức tạp của chúng liên quan đến sự hoạt động đồng thời của hệ thống phân giải sunfua và phân giải protein Keratinaza hoạt động ở khoảng nhiệt độ và pH tương đối rộng nhưng tốt hơn điều kiện môi trường hơi kiềm và là loại enzim ưa nhiệt

Thức ăn thuỷ phân

Sản xuất thuốc Phân bón

Chất tẩy rửa KERATINAZA Công nghiệp da

Sản xuất khí Công nghiệp dệt

sinh học may

Thuỷ phân prion

* Ứng dụng làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi

Thí nghiệm trên gà, người ta nhận thấy rằng lông thuỷ phân được cân bằng về một số axit amin, có thể thay thế đậu nành như là một nguồn protein chiếm tới 70% trong khẩu phần Gần đây hơn, sản phẩm Keratinaza được thử nghiệm như là một enzim cho ăn trực tiếp trong thức ăn của gà Khi gà thiếu nhiều protein trong khẩu phần (80% nhu cầu) thì Keratinaza trong khẩu phần có thể cải thiện sinh trưởng của gà Trong 3 tuần đầu tiên, tỷ lệ biến đổi thức

ăn là 2,03 đối với khẩu phần được bổ sung Keratinase Tỉ lệ biến đổi thức ăn đối với khầu phần đối chứng đủ protein là 1,83 Nhiều thí nghiệm đang được nghiên cứu để thiết lập giá trị dinh dưỡng của Keratinaza (23)

* Ứng dụng trong điều trị bệnh bò điên

Keratinaza phân huỷ lông và PrPSC có cấu trúc tương tự nhau, cả hai đều có cấu trúc protein B và có sức đề kháng với hầu hết proteaza Một thí nghiệm gần đây đã được tiến hành

ở ID-Lelystad, Hà Lan Tế bào não BSE được xử lý và chẩn đoán bằng phương pháp chuẩn, ngoại trừ là các mô đồng nhất được nấu trước và được tiêu hoá bởi PWD-1 Keratinase Rất là thú vị, PrPSC

được coi là hoàn toàn tự phân huỷ hay tự thuỷ phân bởi enzyme Khám phá đầu

tiên này cho thấy có thể phát triển một quá trình enzim, sử dụng keratinaza từ chủng Bacillus

subtilis PWD-1, để khử các dụng cụ y tế truyền nhiễm và các sản phẩm gia súc

* Ứng dụng trong công nghệ thuộc da

Công nghệ tẩy lông thông thường sử dụng vôi và natri sulphua, đây là nguồn ô nhiễm lớn

Sử dụng keratinaza để tẩy lông trong thuộc da rút ngắn thời gian xử lý, giảm chi phí sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm Proteaza kiềm có trong chế phẩm đã thuỷ phân các protein không phải là colagen như albumin, glubulin và keratin mềm, không tác động lên colagen ở lớp cật Với chế phẩm enzim có hoạt độ proteaza 3000 U/g (hoạt độ keratinaza 700 U/g), lượng enzim bổ sung với nồng độ 2% (khối lượng da), thời gian ngâm là 6 - 7 giờ, hiệu quả tẩy lông đạt 90 - 93% (1)

* Ứng dụng trong công nghiệp dệt

Keratinza được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm Keratinaza có tác dụng thủy phân lớp protein serin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

* Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa

Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên

BIO-40 được thu nhận từ Bacillus subtilis Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ Bacillus licheniformis Và đến

gần đây, tất cả các proteaza bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là proteaza serine

được sản xuất từ các chủng Bacillus , và chủ yếu là từ Bacillus subtilis (1) Trên thế giới, mỗi

năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa Trong đó hai công

ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzim proteaza (17)

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ

2.1.1 Vật liệu

- Các mẫu đất chôn lông gà từ 1 đến 6 tháng thu thập từ các vị trí khác nhau tại các huyện Thanh Hà, Ninh Giang tỉnh Hải Dương; quận Hà Đông thành phố Hà Nội Các mẫu đất này được sử dụng để phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza

Các mẫu đất được sử dụng trong nghiên cứu:

Mẫu A: Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Thanh Hồng, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương

Mẫu B : Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Hợp Đức, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương

Mẫu C: Đất ở nơi thải lông của cơ sở giết mổ gia cầm tư nhân, thị trấn Thanh Hà, huyện Thanh Hà, Hải Dương

Mẫu D: Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại huyện Ninh Giang, tỉnh Hải Dương

Mẫu E: Đất đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại quận Hà Đông, Hà Nội

- Lông gà, tóc,

2.1.2 Hoá chất

Các hoá chất được sử dụng nghiên cứu hầu hết là các hoá chất được nhập ngoại của các hãng Sigma, Merc, Aldrich,…

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ đất

2.2.2 Quan sát hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khả năng sinh bào tử của các chủng sinh keratinaza để phân loại chúng

2.2.3 So sánh khả năng sinh keratinaza của các chủng vi khuẩn

2.2.4 Xác định một số điều kiện tối ưu hoá môi trường nuôi cấy

2.2.4.1 Xác định ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy

2.2.4.2 Xác định ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu

2.2.4.3 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu

2.2.5 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt tính keratinaza

2.2.5.1 Xác định hoạt tính keratinaza

2.2.5.2 Xác định ảnh hưởng của pH

2.2.5.3 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ

2.2.5.4 Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 SỰ PHÂN RÃ CỦA LÔNG GÀ KHI ĐƯỢC SỬ DỤNG LÀM NGUỒN CACBON VÀ NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA

Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập được 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc (phụ lục 1) Các chủng sau khi được kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng cách nuôi lắc trong môi trường phân lập, tuyển chọn giống vi khuẩn có hoạt tính keratinaza nói trên ở 370C, 150 vòng / phút trong 6 ngày, chủng có hoạt tính keratinaza đã làm phân rã lông gà có thể quan sát được bằng mắt thường

Trong nghiên cứu này đã phân lập được 6 chủng có hoạt tính keratinaza Những chủng này có thể sinh trưởng, phát triển trên môi trường chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất

3.2 PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA

Sau khi nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng được mô

tả như bảng 3.1:

Bảng 3.1: Hình thái tế bào các chủng sinh keratinaza

Kr 1 Gram dương, tế bào hình que, tạo thành chuỗi

Kr2 Gram dương, tế bào hình que tương đối đồng đều, ở 2 đầu

vuông, tạo thành chuỗi 2 - 4 tế bào

Kr3 Gram dương, tế bào xếp thành từng đôi hay từng chuỗi , số ít

phân tán hoặc tập trung thành đám

Kr4

Gram dương, tế bào hình que ngắn, các tế bào dạng đơn hoặc xếp đôi, 2 đầu hơi tròn Tế bào già tròn và hơi nhẵn hơn, đôi

khi có hình thoi tù 2 đầu

Kr5 Gram dương, tế bào hình que ngắn, tạo thành chuỗi

Kr6 Gram dương, tế bào hình que ngắn, đơn lẻ hoặc xếp đôi, ít khi

dạng chuỗi

Tiến hành đun dịch nuôi pha loãng của chúng ở 800C trong thời gian 15 phút, để nguội rồi cấy trải trên môi trường NA, ủ ở 370C trong 24h thấy đều mọc thành các khuẩn lạc; chứng

tỏ đây là các chủng sinh nội bào tử

Hình thái khuẩn lạc quan sát được như sau:

Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc các chủng có hoạt tính keratinaza

Kr1 Tạo khóm lớn màu trắng sữa, bề mặt nhăn nheo, xù xì

Kr2 Tròn, to, ở giữa có núm lồi lên có màu trắng ngả vàng nhạt, hơi bóng, nhớt Kr3 Tròn, bờ riềm không đều, có màu vàng nhạt chuyển dần sang xám, xù xì,

khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn và có núm lồi ở giữa

Kr4 Khuẩn lạc hình tròn đều, hơi lượn sóng, nhẵn, thường có các vòng tròn đồng

tâm trên bề mặt, màu trắng sữa chuyển sang màu kem, có khi nâu nhạt có ánh

mờ đục

Kr5 Khô, hình tròn, màu trắng, có vòng tròn màu trắng trên bề mặt, không nhăn

Từ các thí nghiệm trên có thể khẳng định các chủng sinh keratinaza trên đều thuộc chi

Bacillus

3.3 XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA MẠNH NHẤT

Từ 6 chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza đã phân lập được, tiến hành mức độ hoạt động của enzim bằng 2 cách sau:

- Nuôi lắc trong môi trường chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, 150 vòng / phút ở 370

C trong 10 ngày Sau đó, so sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phương pháp Saville (1958)

Bảng 3.3: Hoạt tính keratinaza của 6 chủng sinh keratinaza

Chủng Phần trăm lông gà bị phân huỷ

- Đánh giá hoạt tính keratinaza của các chủng bằng cách: Đục giếng thạch có đường kính

10 mm trên các đĩa thạch có cơ chất là sữa gầy; nhỏ 0,15 ml dịch enzim thô vào các giếng thạch; giữ ở 40C trong tủ lạnh 12h rồi mang ra ngoài khoảng 15 phút sau đó đưa vào tủ ấm

370C ủ trong 24h Hoạt tính của keratinaza được xác định bằng đường kính vòng phân huỷ trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm Kết quả như sau:

Bảng 3.4: Hoạt tính keratinaza của dịch nuôi 6 chủng sinh keratinaza

Chủng Đường kính vòng phân huỷ (cm)

Kết quả ở bảng 2 cho thấy chủng Kr2 thể hiện hoạt tính keratinaza mạnh nhất Chủng này được tìm thấy ở mẫu đất A

3.4 MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU HOÁ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

3.4.1 Ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy

Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất là Kr2 được nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300 C, pH = 7 trong các môi trường có hàm lượng lông khác nhau, cụ thể là 5, 10,

15, 20, 25 g / l trong môi trường cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải như sau:

Bảng 5: Ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy

Hàm lượng lông (g/l) Tỉ lệ lông bị phân giải (%)

Như vậy, khả năng sinh keratinaza phụ thuộc vào hàm lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy Kết quả cho thấy, ở nồng độ lông vũ là 20 g/l cho hiệu quả phân giải cao nhất Ở hàm lượng thấp hơn, hiệu quả phân giải lông vũ cũng thấp hơn Tuy nhiên, ở hàm lượng cao hơn, hiệu quả phân giải cũng giảm Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cheng et

al (1995) cho rằng hàm lượng lông cao làm tăng độ nhớt của môi trường, có thể dẫn đến hạn chế oxy cho vi khuẩn phát triển

3.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu

Chủng Kr2 được nuôi lắc trong môi trường cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300

C trong các môi trường có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong môi trường cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải như sau:

Bảng 6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến khả năng sinh keratinaza

pH môi trường nuôi cấy ban đầu Tỉ lệ lông bị phân giải (%)

Như vậy, pH tối ưu cho nuôi cấy chủng Kr2 để cho hiệu quả sinh keratinaza phân giải lông vũ là khoảng 7 - 8 Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với một số báo cáo trước đây về keratinaza mà thuộc về proteaza kiềm (Altalo và Gashe, 1993; Cheng et al, 1995), cho rằng

keratinaza sản xuất bởi các loài vi khuẩn Bacillus hoạt động tích cực nhất trong môi trường

trung tính hoặc hơi kiềm

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu

Chủng Kr2 được nuôi lắc trong môi trường cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng / phút, pH = 8 trong các môi trường có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 250

C, 300C, 350C, 400C,

450C trong môi trường cơ bản, dựa vào tỉ lệ lông bị phân giải cho thấy nhiệt độ tốt nhất cho nuôi cấy chủng Kr2 là 350

C

3.5 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KERATINAZA

3.5.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza

Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên ở các pH khác nhau kết quả như sau:

Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính keratinaza

Kết quả ở hình 3.1 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11

Ở vùng pH nhỏ hơn 7, hoạt tính keratinaza bị giảm còn dưới 60%

Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có pH tối ưu cho hoạt động của keratinaza là 9

Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2