Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm a h5n1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reaction

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reaction Trần Thị Tình Trường Đ

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reaction

Trần Thị Tình Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: GS.TS Lương Xuân Hiến

Năm báo vệ: 2011

Abstract Tổng quan về virus cúm A/H5N1; chẩn đoán, điều trị và dự phòng

bệnh cúm gia cầm A/H5N1 Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1 Nghiên cứu tối

ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi, Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm

Keywords Virus cúm; Cúm gia cầm; Xét nghiệm

Content

I Đặt vấn đề

Virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc nhóm virus độc lực mạnh (HPAI), thuộc họ

Orthomyxoviridae Chúng không chỉ gây bê ̣nh trên gia cầm và chim hoang dã mà còn có khả năng lây nhiễm và gây bê ̣nh cho người với tỉ lê ̣ tử vong cao Khi dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát, việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn khẩn cấp dịch cúm lan rộng là vô cùng quan trọng Do đó, viê ̣c xây dựng mô ̣t kỹ thuâ ̣t chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác virus cú m A/H5N1 là hết sức cần thiết để sàng lọc số lượng lớn loại virus này Chính vì vậy chúng tôi đã thực hiện để tài với mục tiêu:

1 Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1

2 Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt

độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,

3 Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm

II Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm: 14 mẫu dương tính với cúm A /H5N1: bao gồm 8 mẫu thu thâ ̣p từ

gia cầm (cung cấp bởi Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương ); 6 mẫu thu thập từ người (cung cấp bởi Trung tâm Cúm Quốc gia - Viê ̣n Vệ sinh Dịch tễ Trung ươn g); 30 mẫu thu thập từ gia cầm bị bệnh trong các vụ dịch cúm năm 2009

Tách chiết RNA: Mẫu bệnh phẩm được xử lý và tách chiết thu RNA bằng bộ sinh

phẩm QIAmp Viral RNA mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thiết kế mồi : Sử dụng các trình tự nucleotide các gen H5, N1 và M của virus cúm đã

được công bố trên GenBank, so sánh các trình tự bằng phần mềm Clustal X 2.0.11 Sau khi phân tích bằng phần mềm FastPCR 5.4 các cặp mồi đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1 được lựa cho ̣n sao cho các mồi có thể khuếch đa ̣i các trình tự đă ̣c hiê ̣u trên gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 khi thực hiê ̣n trong cùng một phản ứng RT-PCR

Phản ứng m utiplex RT-PCR: Được thực hiện với bộ sinh phẩm Qiagen OneStep

RT-PCR theo hướ ng dẫn của nhà sả n xuất trên máy luân nhiê ̣t C 1000 (Biorad) Phản ứng được thực hiện ở các điều kiện khác nhau về nồng độ mồi, chu trình nhiệt để tìm điều kiện tối ưu của phản ứng Sản phẩm phản ứng (10 µl) đươ ̣c điê ̣n di trên gel Agarose 2%, nhuộm trong dung di ̣ch ethidium bromide 0,5 µg/ml 15 phút, quan sát và chu ̣p ảnh trên hê ̣ thống chu ̣p ảnh gel Kích thước các vạch DNA được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp

Đánh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u của phản ứng : Sử du ̣ng các mẫu RNA của virus cúm A/H1N1, cúm A /H3, cúm B (Viện Vê ̣ sinh Di ̣ch tễ Trung ương cung cấp ), cúm A /H5 (Trung tâm Chẩn đoán Thú Y Trung ương cung cấp ) và các mẫu DNA và RNA có sẵn trong phòng thí nghiê ̣m để kiểm tra xem có hiê ̣n tượng phản ứng chéo xảy ra hay không

Đa ́ nh giá đô ̣ nha ̣y của phản ứng : Sử dụng các gen HA , NA và M của chủng virus

cúm A/H5N1 để gắn vào plasmid pJET1.2/blunt (Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp, sau đó tiến hành tổng hợp RNA với bô ̣ sinh phẩm TranscriptA id™ T7 High Yield Transcription Kit (Fermentas) Nồng độ RNA đươ ̣c xác đi ̣nh bằng cách đo khả năng hấp phu ̣ ở bước sóng

260 nm trên máy Biophotometer (Eppendorf) Dựa vào nồng đô ̣ RNA và kích thước của đoa ̣n RNA được phiên mã có thể tính được số bản sao RNA trong một đơn vị thể tích Sau đó, mẫu RNA được pha loãng dần thành các dung di ̣ch có nồng đô ̣ giảm dần 10 lần đến 101 bản sao RNA/µl và sử du ̣ng làm mẫu chuẩn để đánh giá đô ̣ nha ̣y của phản ứng

III Kết quả

Thiết kế mồi: Sau khi phân tích các trình tự gen H 5, N1 và M của virus cúm A đã

công bố trên GenBank bằng các phần mềm chuyên du ̣ng , 3 că ̣p mồi đã được thiết kế để thực hiê ̣n phản ứng mutiplex RT-PCR phát hiê ̣n virus cúm A/H5N1 như trong bảng:

Mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Tm Kích thước

DiagMF GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC 5-26 55.1

154 bp DiagMR GTGACAGGATTGGTCTTGTCTT 158-139 55.8

DiagH5F AGTGATCAGATTTGCATTGGTTAC 46-69 54.6

371 bp DiagH5R GACCAAGAACTTTTGGGGATG 416-396 55.4

DiagN1F CCAGTTGGTTGACAATTGGAAT 503-524 54.5

292 bp DiagN1R GCATCAGGATAACAGGAGCA 794-775 55.4

Tối ưu phản ứng mutiplex RT-PCR: Phản ứng RT-PCR vớ i từng că ̣p mồi riêng rẽ đươ ̣c thực hiê ̣n để xác đi ̣nh các điều kiê ̣n (nồng đô ̣ mồi, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi, số chu kỳ lă ̣p la ̣i) thích hợp nhất đối với từng cặp mồi Sau đó, phản ứng mutiplex RT-PCR được thử nghiê ̣m với cả 3 că ̣p mồi để xác đi ̣nh các điều kiê ̣n tối ưu cho phản ứng Kết quả các thử nghiê ̣m cho thấy phản ứng m utiplex RT-PCR cho kết quả tốt nhất khi nồng đô ̣ mồi cho gen M, HA và NA lần lượt là 0.3 µM, 0.5 µM và 0.4 µM; phản ứng được thực hiện với chương trình nhiệt: Phiên mã ngược ở 50o

C trong 30 phút; biến tính ban đầu ở 95oC trong 15 phút; tiếp theo là 45 chu kỳ (94oC: 30 giây; 57oC: 30 giây; 72oC:

30 giây); giai đoạn kéo dài chuỗi sau cùng thực hiê ̣n ở 72oC trong 5 phút

Đánh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u của phản ứng m utiplex RT-PCR: Phản ứng được tiến

hành với RNA của một số virus cúm khác (cúm B ; cúm A /H1N1; cúm A /H5 và cúm A/H3 không phải subtype N1) để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng Kết quả cho thấy phản ứng chỉ đặc hiệu với virus cú m A/H5N1 Ngoài ra, khi thực hiê ̣n phản ứng với vâ ̣t

liê ̣u di truyền của mô ̣t số loài khác (người, Escherichia coli, Mycobacteria tuberculosis,

Chlamydia trachomatis, Neisseria gorrnorhea, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Human immunodeficiency virus, Human Papillomavirus), phản ứng m utiplex RT-PCR

đều cho kết quả âm tính

Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiê ̣u của phản ứng multiplexRT-PCR

M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chư ́ ng âm; 1: cúm A/H5; 2: cúm A/H3; 3: cúm B; 4:

cúm A/H5N1; 5: cúm A/H1N1

Đánh giá đô ̣ nha ̣y của phản ứng mutiplex RT-PCR:

Phản ứng được thực hiện với các mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau , từ 101 đến 1010 bản sao RNA /µl và sử du ̣ng 10 µl để điê ̣n di trên gel Agarose 2% Kết quả điê ̣n di cho thấy phản ứng dương tính (quan sát được các va ̣ch DNA sau khi nhuô ̣m Ethidium bromide) khi trong mẫu có từ 10 bản sao RNA trở lên

Thử nghiê ̣m đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR

M: thang DNA 100 bp; NC: Chư ́ ng âm; Số lượng bản sao RNA trong mẫu thử được ghi

chú ở phía trên

Ứng dụng kỹ thuật mutiplex RT-PCR phát hiê ̣n cúm A /H5N1 trên mẫu bê ̣nh phẩm:

Kỹ thuật mutiplex RT-PCR được thử nghiê ̣m trên 14 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2 mẫu từ ngan, 3 mẫu từ vi ̣t, 3 mẫu từ gà, và 6 mẫu từ người) Kết quả là phản ứng mutiplex RT-PCR đã phát hiê ̣n được virus cúm A/H5N1 trên cả 14 mẫu bê ̣nh phẩm

Kết qua ̉ thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR trên mẫu bê ̣nh phẩm dương tính M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; md: muscovy duck; ck: chicken; d: duck 1, 2, 3;

h: human 1, 2, 3, 4, 5, 6

Kỹ thuật mutiplex RT-PCR xác định cúm H5N1 trên 30 mẫu bệnh phẩm (thu thập từ gia cầm bị bệnh trong các vụ dịch cúm) Kết quả phát hiện được 9 mẫu dương tính với cúm H5N1 (30%) và 21 mẫu âm tính (70%)

Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1

trên một số mẫu bê ̣nh phẩm M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương;

1-10: Mẫu bệnh phẩm

Kết luận

- Đã thiết kế được 3 cặp mồi đặc hiệu với 3 gen M, HA và NA dùng để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng mutiplex RT-PCR

- Đã xây dựng thành công kỹ thuâ ̣t mutiplex RT -PCR cho phép phát hiê ̣n nhanh virus cúm A /H5N1 với đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u cao và có thể áp du ̣ng để phát hiê ̣n nhiễm cúm A/H5N1 ở gia cầm và người

- Đã thử nghiệm được multiplex RT-PCR trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm bị bệnh

References :

Tiếng Việt

1 Bùi Quang Anh (2006), Báo cáo tình hình cúm gia cầm tại Việt Nam, Hội nghị

phòng chống dịch cúm gia cầm do Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn

2 Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải,

Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm động

vật sang người”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 2(1): 1-18

3 Lê Văn Năm (2004), “Bệnh cúm gà”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(1): 81-86

4 Tô Long Thành (2004), “Bệnh cúm loài chim”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y,

11(2): 53-58

Tiếng Anh

5 Abdel-Ghafar AN, Chotpitayasunondh T, Gao Z, Hayden FG, Nguyen DH, et al,

2008, “Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in humans”, N Engl

J Med, 358, pp 261-73

6 Apisarnthanarak A, Kitphati R, Thongphubeth K, Patoomanunt P, et al, 2004,

“Atypical avian influenza (H5N1)”, Emerg Infect Dis, 10, pp 1321- 4

7 Baigent SJ, McCauley JW (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length

of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in

tissue culture” Virus Res, 79(1-2): 177-185

8 Beare AS and Webster RG (1991), “Replication of avian influenza viruses in

humans”, Arch Virol., 119, pp 37-42

9 Beigel JH, Farrar J, Han AM, Hayden FG, Hyer R, de Jong MD, Lochindarat S,

Nguyen TK, Nguyen TH, Tran TH, Nicoll A, Touch S, Yuen KY (2005), “Avian

influenza A (H5N1) infection in humans”, N Engl J Med, 353, pp 1374- 85

10 Bloomberg News articles (2006), Two Bird Flu Gene Mutations Might Lead to

Faster Human Spread, Published

11 Butler D (2006), “Alarms ring over bird flu mutations”, Nature, 439, pp 248-9

12 CDC (2009), Interim guidance on the planning for the use of surgical masks and

respirators in health care settings during an influenza pandemic

13 Chan PK (2002), “Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong

Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34(suppl 2):S58- S64

14 Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, et al (2006), “Establishment of multiple

sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control”,

Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp 2845- 50

15 Chen, H., G Deng, Z Li, G Tian, Y Li, and P Jiao (2004), “The evolution of

H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA,

101: p 10452-10457

16 Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, et al (2005), “Human

disease from influenza A (H5N1)” Emerg Infect Dis, 11, pp 201- 9

17 Conenello G, Zamarin D, Perrone L, Tumpey T and Palese P (2007), “A Single

Mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 Influenza A Viruses

Contributes to Increased Virulence”, PLoS Pathog, 3(10), pp 1414-21

18 De Jong MD, Bach VC, Phan TQ, Vo MH, Tran TT, Nguyen BH, Beld M, Le TP,

Truong HK, Nguyen VV, Tran TH, Do QH, Farrar J (2005), “Fatal avian

influenza A (H5N1) in a child presenting with diarrhea followed by coma”, N

Engl J Med, 352, pp 686-91

19 De Jong MD, Simmons CP, Thanh TT, Hien VM, Smith GJ, Chau TN, Hoang DM,

Chau NV, Khanh TH, Dong VC, Qui PT, Cam BV, Ha DQ, Guan Y, Peiris JS, Chinh NT, Hien TT, Farrar J (2006), “Fatal outcome of human influenza A

(H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia”, Nat Med, 12,

pp 1203- 07

20 De Jong MD, Tran TT, Truong HK, Vo MH, Smith GJ, Nguyen VC, Bach VC, Phan

TQ, Do QH, Guan Y, Peiris JS, Tran TH, Farrar J (2005), “Oseltamivir resistance

during treatment of influenza A (H5N1) infection”, N Engl J Med, 353, pp

2667-72

21 Drake J W (1993), “Rate of spontaneous mutation among RNA viruses”, Proc Natl

Acad Sci U S A, 90(9): 4171-4175

22 Duan L, Bahl J, Smith G, et al (2008), “The development and genetic diversity of

H5N1 influenza virus in China, 1996-2006”, Virology, 380, pp 243-54

23 Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, et al (2006), “Evolution of the receptor

binding phenotype of influenza A (H5) viruses”, Virology; 344:432-438

24 Greninger A (2004), The Definition and Measurement of Dangerous Research

25 Guan Y, et al (2004), “H5N1 influenza: A protean pandemic threat”, PNAS, 101(21),

pp 8156-61

26 Guan Y, et al (2002), “Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza

viruses in Hong Kong SAR”, Proc Natl Acad Sci USA, 99, pp 8950–5

27 Hamada S., Suzuki Y., Suzuki T., et al (2006), “Haemagglutinin mutations

responsible for the binding of H5N1 influenza A virus to human-type receptors”,

Nature, 444(7117), pp.378-82

28 Harder T C and Werner O (2006), “Avian Influenza”, Influenza, Report 2006

29 Hatta M., et al (2007), Growth of H5N1 Influenza A Viruses in the Upper

Respiratory Tracts of Mice, PLoS Pathog.

30 Hoa, L.T., D.D Khang, P.V Chi, N.V Hai, T.N Hai, N.T.B Nga, and L.T Binh

(2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic

A/H5N1 strains isolated in Vietnam during 2004 – 2006”, Proceedings of

International Workshop on Biotechnology in Agriculture, p 68-71

31 Hui DS (2008), “Review of clinical symptoms and spectrum in humans with

influenza A/H5N1 infection”, Respirology, 13(suppl 1):S10-S13

32 International Committee on Taxonomy of Viruses Index of Viruses (2009),

Orthomyxoviridae, In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version 7

B#chen-Osmond, C (Ed), Columbia University, New York, USA

33 Julkunen I, Pyhala R, Hovi T, 1985, Enzyme immunoassay, complement fixation

and hemagglutination inhibition tests in the diagnosis of influenza A and B virus

infections”, Purified hemagglutinin in subtype-specific diagnosis, J Vir.Methods

10, 75-84

34 Kandun IN, Wibisono H, Sedyaningsih ER, Yusharmen, Hadisoedarsuno W, et al

(2006), “Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005” N Engl J Med, 355, pp 2186-94

35 Katz JM, Lim W, et al (1999), “Antibody response in individuals infected with

avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among

household and social contacts”, J Infect Dis, 180, pp 1763-70

36 Lamb RA and Krug RM (2001), “Orthomyxoviridae: The Viruses and Their

Replication”, Fields Virology, 4th Edition, (D.M Knipe and P.M Howley, eds),

pp 1487-1531

37 Lamb RA (1989), Genes and proteins of the influenza viruses In: Krug R M, editor

The influenza viruses 1st ed New York, N.Y: Plenum Press

38 Le, Q., M Kiso, K Someya, Y Sakai, T Nguyen, K Nguyen, N Pham, H

Nguyen, S Yamada, Y Muramoto, T Horimoto, A Takada, H Goto, T Suzuki, Y Suzuki, and Y Kawaoka (2005), “Avian flu: isolation of

drug-resistant H5N1 virus” Nature, 437(7062): p 1108

39 Lee C W., Suarez D., Tumpey T., et al (2005), “Characterization of Highly

Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea”,

Journal of Virology, 79(6), pp 3692-3702

40 Luong, G and P Palese (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Curr

Opinion Gen Develop, 2: p 77-81

41 Ng EK, Cheng PK, Ng AY, Hoang TL, and Lim WW (2005), “Influenza A H5N1

detection”, Emerg Infect Dis., 11, pp 1303-5

42 Rowe T, Abernathy RA, Hu-Primmer J, et al (1999), Detection of Antibody to

Avian Influenza A (H5N1) Virus in Human Serum by Using a Combination of

Serologic Assays, J Clin Microbiol, 37(4), pp 937- 43

43 Sastre A (2006), Antiviral Response in Pandemic Influenza Viruse, CDC, vol 12

number 1

44 Senne, DA, Panigrahy, B, Kawaoka, Y, Pearson, JE, Suss, J, Lipkind, M, Kida, H

and Webster, RG (1996), “Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the HA

cleavage site as a marker of pathogenicity potential”, Avian Diseases, 40:

425-437

45 Swayne DE and Halverson DA (2007), Diseases of Poultry: Influenza, 12th edn

Ames, IA: Blackwell Publishing Professional

46 Takano R, Nidom CA, Kiso M, Muramoto Y, Yamada S, Sakai-Tagawa Y, Macken

C, Kawaoka Y (2009), “Phylogenetic characterization of H5N1 avian influenza

viruses isolated in Indonesia from 2003-2007”, Virology, 390, pp 13-21

47 Tran TH, Nguyen TL, Nguyen TD, Luong TS, Pham PM, et al (2004), “Avian

influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam”, N Engl J Med, 350, pp 1179-88

48 Uiprasertkul, M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K

Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook, N Vanprapar, and P Auewarakul (2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A

(H5N1) virus in humans”, Emerg Infect Dis, 13(5): p 708-712

49 WHO inter-country-consultation, influenza A/H5N1 in humans in Asia: Manila,

Philippines, 6-7 May 2005

50 World Health Organization (2009), Continuing progress towards a unified

nomenclature system for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses

51 Xu C, Dong L, Xin L, Lan Y, Chen Y, Yang L, Shu Y (2009), “Human avian

influenza A (H5N1) virus infection in China”, Science, 52, pp 407–11

52 Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y,

Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin

Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1

influenza A viruses human-type receptors”, Nature, 444(7117): 378-382