Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán virus epstein barr

Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN của EBV trong mẫu máu bằng bộ kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit gồm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt cụ thể là hạt từ nano được bọc

Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus

Epstein Barr Phạm Thị Trà

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, khoa Sinh học Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm; Mã số: 60.42.30

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Vân Anh

Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Xây dựng phương pháp phát hiện định tính và định lượng EBV bằng

PCR và Real-time PCR Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN của EBV trong mẫu máu bằng bộ kít tự chế tạo (Virus Magnet Nano Kit) gồm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt (cụ thể là hạt từ nano được bọc silica hay còn ký hiệu MagSi nano) và bộ đệm kèm theo (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng thử nghiệm trên đối tượng HBV, HCV) So sánh khả năng tách chiết ADN EBV bằng kỹ thuật PCR, Real-time PCR với nguồn ADN khuôn tách bằng ba bộ kít: MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen, Dynabead Myone Silane® Kit của hãng Invitrogen, Virus Magnet Nano Kit trong cùng điều kiện thí nghiệm

Keywords: Hạt từ nano; Sinh học thực nghiệm; Chẩn đoán; Virus

Content

Việc tinh sạch axít nucleic của vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm là một bước rất quan trọng vì các nghiên cứu, xét nghiệm sinh học phân tử đều cần đến nguồn axit nucleic tinh sạch Vì vậy, rất nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch axít nucleic đã được nghiên cứu, phát triển và ứng dụng rộng rãi, trong đó phương pháp do René Boom và cộng

sự phát minh vào năm 1990 Nguyên lý của phương pháp này dựa trên khả năng hình thành liên kết bền vững của hạt silica với axít nucleic thông qua cầu nối cation trong môi trường có nồng độ muối cao [8, 9] Một cải tiến mang tính đột phá của phương pháp Boom

là sử dụng hạt nano từ tính bọc silica để tinh sạch axít nucleic, giúp nâng cao hiệu quả tách chiết và tiết kiệm thời gian thao tác Giá thành của các bộ kít tinh sạch axít nucleic bằng hạt nano từ bọc silica rất cao Do đó, việc nghiên cứu và phát triển bộ kít tách chiết axit dựa trên nguyên lý hạt từ bọc silica có ý nghĩa khoa học và ứng dụng thực tiễn cao giúp cho việc giảm chi phí trong khâu tách chiết, chủ động cung cấp kít tách chiết axit nucleic khi cần

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xử lý hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt bằng silica (Silica-coated magnetic nano-particles) hay còn gọi là hạt Magsi nano do nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên chế tạo và bộ đệm thích hợp (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu phòng Sinh học nano và Ứng dụng) để thử nghiệm khả năng tách chiết axit nucleic của virus Epstein Barr trong các bệnh phẩm của bệnh nhân ghi nhiễm EBV EBV là virus truyền nhiễm trên người, lây truyền qua đường ăn uống, tiếp xúc EBV liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như: ung thư vòm họng, Burkitt lymphoma, ung thư lymphoma và các trạng thái

biến đổi tế bào lympho ADN tách chiết bởi bộ kít Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt

Magsi nano và bộ đệm thích hợp sẽ được sử dụng trong phản ứng PCR và Real-time PCR để phát hiện và định lượng nồng độ EBV trong máu hay các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm, hỗ trợ trong công tác chẩn đoán, điều trị, tiên lượng các bệnh liên quan đến EBV

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano

được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr’’ với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp phát hiện định tính và định lượng EBV bằng PCR và Real-time PCR

2 Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN của EBV trong mẫu máu bằng

bộ kít tự chế tạo (Virus Magnet Nano Kit) gồm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt

(cụ thể là hạt từ nano được bọc silica hay còn ký hiệu MagSi nano) và bộ đệm kèm theo (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng thử nghiệm trên đối tượng HBV, HCV)

3 So sánh khả năng tách chiết ADN EBV bằng kỹ thuật PCR, Real-time PCR với

nguồn ADN khuôn tách bằng ba bộ kít: MinElute ® Virus Spin Kit của hãng Qiagen, Dynabead Myone Silane ® Kit của hãng Invitrogen, Virus Magnet Nano Kit trong cùng

điều kiện thí nghiệm

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1 Mẫu máu

30 mẫu máu có xét nghiệm VCA-IgG dương tính được cung cấp bởi Khoa Vi Sinh bệnh Viện Bạch Mai 10 mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán ung thư vòm họng được cung cấp bởi Khoa Vi sinh, bệnh viện Quân Y 103

2.1.2 Mồi

Mồi được thiết kế để phát hiện EBV trong huyết thanh bằng PCR và Real-time PCR dựa trên các trình tự đặc hiệu cho EBV

2.1.3 Các hóa chất, nguyên liệu khác

- Hạt từ nano bọc silica được cung cấp bởi Trung tâm Khoa học Vật liệu của Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên; MinElute ® Virus Spin kit của hãng Qiagen; Dynabeads Myone

SILANE® của hãng Invitrogen

2.2 PHƯƠNG PHÁP

- Tách chiết axit nucleic: Axit nucleic của EBV được tách chiết theo ba bộ kít MinElute ®

Virus Spin Kit, Dynabead Myone SILANE ® , Virus Magnet Nano Kittừ 200 µl huyết

thanh của cùng bệnh nhân nghi nhiễm EBV; Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ

thuật PCR; Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T easy; Giải trình trình tự gen đã

được nhân dòng; Định lượng gen đích bằng kỹ thuật PCR tại thời điểm (Real-time PCR)

III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 NHÂN DÒNG ĐẶC HIỆU ĐOẠN GEN EBNA-2/250

3.1.1 Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập

Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR với hai lần phản ứng PCR

độc lập đặc hiệu cho gen EBNA-2/250

bp

300

200

100

M 1 2

250

M: thang chuẩn ADN 100 bp;

Đường chạy 1: đối chứng âm (không có ADN khuôn)

Đường chạy 2: khuôn là ADN tinh sạch từ mẫu máu nhiễm EBV

Theo công bố của Van B D và cs năm 2010, phản ứng nested PCR nhân bản đoạn gen EBNA-2/250 đặc hiệu của EBV được thực hiện với hai lần phản ứng PCR độc lập Sản phẩm nested PCR này được điện di trên gel Agarose 1,5%

Kết quả điện di sản phẩm nested PCR được thể hiện trên hình 3.1 cho thấy, ở đường chạy 1 ứng với sản phẩm PCR của đối chứng âm không xuất hiện băng sản phẩm PCR, còn đường chạy 2 tương ứng với khuôn là ADN tách từ mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm EBV xuất hiện duy nhất một băng có kích thước khoảng 250 bp phù hợp với tính toán theo

lý thuyết của đoạn gen EBNA-2 Kết quả trên bước đầu cho phép chúng tôi tạm kết luận là

đã nhân bản thành công đoạn gen EBNA-2 kích thước 250 bp

3.1.2 Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với một lần PCR và một chu trình nhiệt duy nhất

Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR với các điều kiện tối ưu đặc hiệu cho

gen EBNA-2/250

Đường chạy M: Thang ADN chuẩn 100 bp Đường chạy (-): 5 µl H2O

Đường chạy 1, 2: 5 µl ADN EBV tinh sạch Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa, trình tự mồi, lượng khuôn, lượng mồi, chu trình nhiệt để gộp các phản ứng trong PCR ở mục 3.1.1 thành một phản ứng với một

M (-) 1 2

300

200 100

250

bp

chu trình nhiệt duy nhất Với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng đã tối ưu chúng tôi thu được kết quả nested PCR mới (hình 3.2)

Từ kết quả điện di trên hình 3.2 ta thấy trên đường chạy số 1 và 2 chỉ xuất hiện duy nhất một băng ADN duy nhất có kích thước khoảng 250 bp trùng với kích thước dự đoán lý thuyết của đoạn gen EBNA-2/250, còn đường chạy đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào

Do vậy chúng tôi có thể kết luận đã tối ưu hóa được điều kiện phản ứng nested PCR một lần phản ứng và một chu trình nhiệt duy nhất Sản phẩm nested PCR một vòng nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 được nhân dòng vào vector pGEM-T và chọn lọc dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp Plasmis tái tổ hợp sau đó được giải trình tự đoạn gen EBNA-2/250 đã được nhân dòng Kết quả giả trình tự và so sánh cho thấy đoạn gen EBNA-EBNA-2/250 trên vector pGEM-T tái tổ hợp có độ tương đồng 100% với đoạn gen trên EBNA-2 chủng AG876 của Quảng Đông Trung Quốc Từ các kết quả trên chúng tôi có thể kết luận đã nhân dòng thành công đoạn gen EBNA-2/250 vào vector pGEM-T

3.2 KẾT QUẢ NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN EBV- 74

Phản ứng PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBV-74 Kết quả PCR được thể hiện trên hình 3.9 cho thấy ở đường chạy số 1 là sản phẩm PCR bằng cặp mồi EBV Fw3Rv3 với khuôn là ADN EBV xuất hiện băng ADN kích thước khoảng 74 bp, phù hợp với dự đoán

lý thuyết đoạn ADN được nhân bản với cặp mồi EBV Fw3/Rv3 có kích thước 74 bp Còn đường chạy chứng âm với mẫu chứng âm là H2O không xuất hiện băng ADN

Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EBV Fw3Rv3

trên gel polyacrylamid 12%

M (-) 1

bp

100

75

50

74

Đường chạy M: Low range Marker Đường chạy (-): chứng âm (5 µl H2O) Đường chạy 1: ADN EBV tinh sạch

Từ kết quả trên cho chúng tôi kết luận đã nhân bản thành công đoạn gen EBV-74 Đoạn gen này sau đó cũng được nhân dòng vào vector pGEM-T để làm đối chứng dương

và chất chuẩn trong các thí nghiệm định lượng bằng Real-time PCR tiếp theo

3.3 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT TỰ CHẾ TẠO VIRUS MAGNET NANO KIT

Quy trình tách chiết ADN EBV bao gồm các bước từ xử lý hạt MagSi nano cho tới bước ly giải virus, gắn kết ADN/ARN với hạt MagSi nano, rửa sạch để loại bỏ các tạp chất

ra khỏi phức hệ ADN-MagSi nano và cuối cùng là tách thu được ADN tinh sạch Sử dụng

5 µl ADN của EBV thu đươc để PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho EBV

Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250

với nguồn ADN của EBV tách bằng Virus Magnet Nano Kit

Đường chạy (-): chứng âm

Đường chạy (+): chứng dương với khuôn là ADN plasmid EBNA-2/250

Đường chạy 1: khuôn ADN tách từ mẫu bệnh phẩm nhiễm EBV bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit

Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen EBNA-2/250 thể hiện

trên hình 3.4 cho thấy trên đường chạy số 1 với khuôn là ADN EBV tách bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit cho kết quả duy nhất một băng ADN có kích thước khoảng 250 bp,

bp

300

200

100

250

(-) M (+) 1

trùng với băng ADN trên đường chạy của đối chứng dương là khuôn ADN plasmid EBNA-2/250 Từ kết quả trên cho phép chúng tôi kết luận đã tách chiết được ADN EBV bằng bộ

kít Virus Magnet Nano Kit

3.4 ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƯƠNG MẠI BẰNG PCR

Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR đặc hiệu cho EBNA-2/250 dùng khuôn ADN EBV từ mẫu bệnh phẩm tách bằng Virus Magnet Nano kit (A), MinElute ® Spin Virus

Kit (B), Dynabead myone Silane ® Kit (C)

Đường chạy (+): khuôn là ADN plasmid EBNA-2/250

M: Thang chuẩn ADN 1 kb

Đường chạy (-): chứng âm

Đường chạy 1-10: khuôn là 5 µl ADN tách từ các mẫu bệnh phẩm 1-10

Chúng tôi đã tiến hành tách chiết đồng thời ADN của 40 mẫu huyết thanh của bệnh

nhân nghi nhiễm EBV bằng bộ kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit và hai bộ kít thương mại chuyên dùng cho tách ADN/ARN của virus là MinElute ® Virus Spin Kit của hãng

(+) M (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A

bp

500

250

B

C

500

250

500

250

250

250

250

Qiagen, Dynabeads Myone SILANE ® của Invitrogen trong cùng các điều kiện thí nghiệm

Kết quả thực tế chỉ có 2 mẫu ADN tách chiết từ các mẫu máu nghi nhiễm EBV cho băng

điện di sản phẩm PCR với kích thước 250 Trên hình 3.5 thể hiện kết quả điện di sản

phẩm PCR cho thấy, ở đường chạy của đối chứng âm không có khuôn nên không cho

băng sản phẩm PCR, còn đường chạy chứng dương với khuôn là ADN plasmid chứa

đoạn gen EBNA-2/250 có băng ADN kích thước 250 bp, các đường chạy 7, 10 tương

ứng với khuôn là ADN tách chiết từ mẫu số 7 của bệnh nhân Nguyễn Ngọc D và Nguyễn

Văn Đ xuất hiện băng ADN có kích thước 250 bp trùng với kích thước băng ADN ở đối

chứng dương ở cả ba bản điện di ứng với ba bộ kít, chỉ khác nhau về độ đậm nhạt của

băng điện di Điều này cho thấy với nguồn ADN của 40 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân

xét nghiệm EBV với cả ba kit cần so sánh đều phát hiện được tỷ lệ 2 mẫu dương tính trên

tổng 40 mẫu bằng phương pháp

3.5 SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET NANO

KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƯƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR

Phương pháp real - time PCR với các ưu điểm nhanh, độ nhạy và độ chính xác cao,

được sử dụng để định lượng và so sánh khả năng tách chiết ADN EBV của Virus Magnet

Nano Kit với hai bộ kít thương mại thể hiện bằng số bản sao ADN EBV mà các bộ kít tách

được

Hình 3.6: Kết quả Real-time PCR với nguồn ADN EBV của hai mẫu bệnh phẩm số 7,

10 tách bằng ba bộ kít Virus Magnet Nano Kit, MinElute Virus Spin Kit, Dynabead

PC

10 8

10 6

107

105

104

103

myone Silane ® Kit và chất chuẩn

A: Đồ thị biểu diễn quá trình nhân bản đoạn gen EBV-74 đặc hiệu cho EBV

B: Đường chuẩn được xây dựng dựa trên sự pha loãng nồng độ plasmid EBV-74 ban đầu, nồng độ các mẫu ADN cần so sánh, trục x biểu thị giá trị logarit số lượng bản copies ban đầu và các mẫu ADN, trục y biểu diễn giá trị chu kỳ ngưỡng (CT)

Kết quả Real-time PCR định lượng thể hiện trên hình 3.14 có hệ số tương quan R2= 0.996 cho thấy đường chuẩn xây dựng được từ chất chuẩn ADN plasmid mang đoạn gen

EBV-74 với dải nồng 103 đến 108

copies/ml trong thí nghiệm có độ tin cậy cao đủ tiêu chuẩn cho việc định lượng số copies ADN EBV tách bằng ba bộ kít cần so sánh Kết quả định lượng nồng

độ ADN EBV tách được bằng ba bộ kít được cụ thể trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả real–time PCR định lượng ADN EBV tách bằng ba bộ kít

Mẫu CT (chu kỳ ngưỡng) Số copies/ml

Từ kết quả real-time PCR trên ta thấy số bản sao ADN EBV tách theo bộ kít Virus Magnet Nano Kit của cả hai mẫu 7 và 10 tương ứng M7 Mgsi =7.17x103, M10 Mgsi = 1.18x106 copies/ml cao hơn lượng ADN EBV của hai mẫu này tách bằng bộ kít Dynabead Myone Silane ® của Invitrogen (M7I = 6,53x102, M10I = 7.04x105) và thấp hơn lượng

ADN EBV tách bằng MinElute ® Virus Spin Kit của Qiagen (M7Q = 9.64x103, M10Q = 1.84x106) Kết quả này hoàn toàn phù hợp với độ đậm của băng điện di sản phẩm PCR đã được phân tích trong mục kết quả 3.4

IV KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra được những kết luận như sau:

1 Xây dựng phương pháp phát hiện định tính và định lượng EBV bằng PCR và Real-time PCR

i) Nhân bản thành công đoạn gen EBNA-2 kích thước 250 bp đặc hiệu dùng cho

chẩn đoán EBV bằng nested PCR Thiết kế thành công cặp mồi EBVex2 Fw/Rv và tối ưu điều kiện phản ứng nested PCR một lần phản ứng với một chu trình nhiệt duy nhất Chế độ nhiệt cho phản ứng PCR này: Vòng một với 5 chu kỳ 940C trong 1 phút, 600C trong 1 phút,

720C trong 2 phút; vòng 2 với 30 chu kỳ 940C - 30 giây, 540C - 1 phút, 720C - 1 phút Nhân dòng được đoạn gen EBNA-2/250 tạo chứng dương cho các phản ứng phát hiện EBV bằng PCR

ii) Đã nhân dòng thành công đoạn gen mã hóa cho protein màng BRNF1 p143 không chứa nhóm glycosyl đặc hiệu cho EBV kích thước 74 bp (EBV-74) dùng cho chẩn đoán EBV bằng Real-time PCR

2 Đã tách chiết được ADN EBV bằng hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt (hay còn gọi là hạt Magsi nano) và có thể sử dụng trong phát hiện EBV bằng phản ứng PCR, Real-time PCR

3 Bộ kít Virus Magnet Nano Kit cho phép tinh sạch ADN EBV (M7Mgsi = 7.17x103 copies/ml) gần tương đương với bộ kít MinElute ® Virus Spin Kit của hãng Qiagen (M7Q

= 9.64x103 copies/ml) và Dynabead myone Silane ® của hãng Invitrogen (M7I = 6.53x102

copies/ml)

References

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1 Đái Duy Ban (2002), Sinh học phân tử của ung thư vòm họng, NXB Khoa học và

kỹ thuật

2 Hồ Quỳnh Thùy Dương (2000), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội

3 Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Hoàng Hải, Trần Mậu Danh, “Chế tạo và ứng dụng hạt

nano từ bọc silica trong Y – Sinh học”, Báo cáo Hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ

VI, Hà Nội ngày 23-25 tháng 11 năm 2005

4 Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng

thường gặp, NXB Y học

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

5 Bajij BG., Murakami M., Robertson ES (2007) “Molecular biology of EBV on the

lationship to AIDS-assosiated oncogenesis”, Cancer Treat Res 133: 141-62

6 Bhushan B (2004), HADNbook of Nanotechnology, Spinger – Verlag, Berlin,

Germany, 279-371

7 Boom R., Sol C J A., Salimans M M M., Jansen C L., Wertheim P M E (1990),

“Rapid ADN simple method for purification of nucleic acids”, J Clinic Microbiol

28: 495-503

8 Boom R., Sol C J A., Salimans M M M., Jansen C L., Wertheim P M E (1990),

“Rapid ADN simple method for purification of nucleic acids”, J Clinic Microbiol

28: 495-503

9 Boom R., Sol C., Beld M., Weel J., Goudsmit J ADN Dillen P W V (1999),

“Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate ADN Isolation Procedure Based on

Selective Binding of Bovine Alpha-Casein to Silica Particles”, J Clinic Microbiol

37: 615-619