Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA bằng công nghệ gen

Nghiên cứu Gen scFv mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt phù hợp, sau đó được đư

Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến

EPCA bằng công nghệ gen

Nguyễn Kim Hoàn

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: PGS.TS Lê Quang Huấn

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Nghiên cứu Gen scFv mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư

tiền liệt tuyến EPCA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt phù hợp, sau đó được đưa vào vector phagemid pHEN2 để tạo vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp pHEN2-scFv sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.Coli chủng TG1 có bổ sung kháng sinh ampicillin, các khuẩn lạc mọc trên đĩa được kiểm tra và chọn lọc các dòng mang vector Kháng thể phage-scFv tạo ra kết hợp với kháng nguyên EPCA trong huyết thanh bệnh nhân bị bệnh và không bị bệnh

để kiểm tra ái lực thông qua phản ứng ELISA Bước đầu có thể sử dụng để chẩn

đoán các bệnh nhân là dương tính hay âm tính với ung thư tiền liệt tuyến

Keywords Sinh học thực nghiệm; Công nghệ gen; Gen mã hóa; Ung thư tiền liệt

tuyến

Content

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay, ung thư được coi là căn bệnh đe dọa nguy hiểm và trầm trọng nhất đối với con người Trong số đó, ung thư tuyến tiền liệt là loại ung thư thường gặp và có tỉ lệ tử vong cao ở nam giới Ung thư tuyến tiền liệt gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe và sinh hoạt của nam giới, nhưng nếu được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ hạn chế được rất nhiều tác hại của bệnh Ngày nay cùng với sự phát triển của y học và sinh học phân tử, đã có thêm nhiều phương pháp chẩn đoán cũng như điều trị mới Một trong các phương pháp hữu hiệu đó là phương pháp sử dụng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt trong chẩn đoán và điều trị một cách nhanh chóng và hiệu quả

Kháng thể scFv là chuỗi hợp nhất giữa một vùng biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và một vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) của kháng thể nhờ chuỗi peptide ngắn (10-25 axit amin) Với cấu trúc này, scFv vẫn giữ được các đặc trưng của kháng thể như ban đầu, mặc dù

đã loại bỏ các vùng hằng định và có thêm sự xuất hiện chuỗi peptide làm cầu nối giữa vùng

VH và VC

Do đó, với mong muốn góp phần nghiên cứu nhằm đưa kháng thể vào ứng dụng trong

chẩn đoán và điều trị ung thư tiền liệt tuyến chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu

nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA bằng công nghệ gen.”

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT

1.1.1 Giới thiệu chung về tuyến tiền liệt

Tuyến tiền liệt là một cơ quan nằm ở bụng dưới hay cổ bàng quang (hình 1) Là tuyến bao quanh đoạn đầu niệu đạo Tuyến tiền liệt là một khối hình nón mà đáy ở trên, đỉnh ở dưới Tuyến rộng 4cm, cao 3cm và dày 2,5cm, nặng trung bình 15-20g và thường to lên theo tuổi (hình 2) [1]

Tuyến tiền liệt tiết ra chất dịch có màu trắng sữa, mang tính kiềm và chứa acid citric, calcium, acid phosphat, enzyme làm đông vón và profibrinolysin Trong thời gian phóng tinh, các túi của tuyến tiền liệt co bóp cùng với co bóp của ống dẫn tinh để đẩy dịch tiết của nó gộp với dịch từ ống dẫn tinh làm tăng thể tích tinh dịch Dịch tiết của nó có tính kiềm sẽ trung hòa bớt độ acid trong tinh dịch (độ acid do sự hiện diện của các sản phẩm trao đổi chất của tinh trùng), vì vậy mà giúp tinh trùng đạt được khả năng vận động và thụ tinh ở mức tối ưu

Một chức năng khác của tuyến tiền liệt là giúp kiểm soát nước tiểu bằng cách tạo áp lực trực tiếp đối với phần niệu đạo mà tuyến tiền liệt bao quanh’

Ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) là loại ung thư phổ biến ở nước ta cũng như các nước trên thế giới Bệnh chiếm 10% trong số các ung thư ở nam giới, ở các nước tiên tiến tỷ lệ này

là 15% và là nguyên nhân tử vong thứ hai của bệnh ung thư, sau ung thư phổi Theo thống kê, hàng năm ở Mỹ có đến 132.000 người Mỹ bị UTTLT, và khoảng 34.000 người tử vong vì căn bệnh này

Ung thư tuyến tiền liệt là khối u ác tính phát triển từ tế bào của tuyến tiền liệt Khối u thường phát triển chậm và kéo dài trong nhiều năm Trong suốt thời gian này, khối u thường

có rất ít hoặc không có biểu hiện triệu chứng bất thường khi khám bệnh Tuy nhiên, khi ung thư tiến triển, khối u lớn lên và xâm lấn sang mô xung quanh (lan rộng tại chỗ) Hơn nữa, ung thư cũng có thể di căn (lan xa hơn) đến các vùng khác của cơ thể như xương, phổi, gan Triệu chứng ở những nơi di căn kết hợp với triệu chứng của UTTLT [8]

Nguyên nhân gây ra UTTLT vẫn chưa được nghiên cứu rõ, UTTLT không liên quan đến phì đại tuyến tiền liệt lành tính Các yếu tố nguy cơ bị UTTLT bao gồm: lớn tuổi, di truyền, ảnh hưởng của nội tiết tố cũng như chất độc trong môi trường, hóa chất và các sản phẩm công nghiệp

Tầm soát UTTLT là việc cần được làm thường xuyên và cách đều nhằm phát hiện UTTLT giai đoạn sớm Nếu kết quả tầm soát bình thường thì coi như hiện tại không mắc bệnh, nếu kết quả bất thường thì nghi ngờ có bệnh và cần làm thêm một số xét nghiệm khác

để chẩn đoán Khi có một hoặc hai xét nghiệm tầm soát có bất thường thì UTTLT được nghi ngờ đầu tiên Các thăm khám tầm soát này bao gồm:

 Thăm khám tuyến tiền liệt bằng ngón tay qua ngả trực tràng: Qua ngả trực tràng, người

thăm khám có thể sờ thấy bề mặt sau chiếm đến 75% diện tích chung của tuyến, nằm phần cuối của ruột già Qua đó có thể sờ thấy khối u to ra, mật độ không đều, chỗ cứng chỗ mềm rất dễ phát hiện [7]

 Siêu âm nội trực tràng: để tìm chính xác độ lớn, vị trí khối u giúp bác sỹ chích sinh thiết

và tế bào tuyến để khám nghiệm cơ thể bệnh lý học [7]

 Xét nghiệm PSA (kháng nguyên đặc hiệu của tiền liệt tuyến): Đây là xét nghiệm đơn giản,

dễ thực hiện và tương đối chính xác

PSA là một enzyme glucỏpotein, được tiết ra duy nhất của biểu mô tuyến tiền liệt, có

trọng lượng phân tử khoảng 30.000, chứa 240 axit amin với 7% carbonhydrat, có vai trò làm

loãng tinh dịch Đây là kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt, trong bệnh nhân bị UTTLT thì nồng độ PSA thường tăng cao và tỷ lệ với thể tích khối ung thư Tuy nhiên không chỉ đặc hiệu riêng với UTTLT, nồng độ PSA còn tăng khi bị viêm tuyến tiền liệt

Xét nghiệm dùng để phát hiện lượng PSA, tuy nhiên PSA có giá trị như một xét nghiệm tầm soát UTTLT Vì vậy các bác sỹ thường khuyên những người đàn ông trên 50 tuối nên đi làm xét nghiệm PSA mỗi năm một lần để phát hiện sớm bệnh UTTLT Ở những người có nguy cơ UTTLT bác sỹ khuyên nên bắt đầu làm xét nghiệm PSA sớm hơn ngay ở tuổi 40

1.1.2 Các phương pháp điều trị bệnh UTTLT

Để quyết định điều trị cho bệnh nhân, bác sỹ sẽ xếp loại UTTLT như còn tại chỗ, u lớn nhưng chưa lan ra hay di căn Chọn lựa điều trị tùy theo mức độ lan ra của ung thư, nếu ung thư khu trú tại chỗ điều trị bao gồm: phẫu thuật, xạ trị, hormone liệu pháp, đông lạnh và các biện pháp này có thể kết hợp với nhau Còn đối với các trường hợp UTTLT đã di căn thường không điều trị được Điều trị UTTLT di căn bao gồm: hormone liệu pháp, hóa trị, tuy nhiên vẫn chỉ là tạm thời Mục tiêu của điều trị tạm thời là làm cho khối u chậm phát triển, giảm triệu chứng cho người bệnh

1.2 KHÁNG NGUYÊN

1.2.1 Khái niệm

Kháng nguyên (antigen) được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng thể và thụ thể trên các tế bào lympho Một chất gây miễn dịch là một kháng nguyên được cơ thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng

1.2.2 Kháng nguyên EPCA ( Early Prostate Canner Antigen)

EPCA là một protein có trong chất nền của nhân tế bào Điều đặc biệt là EPCA được biểu hiện mạnh trong các mô ung thư và các mô bình thường sát kề mô ung thư ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt, nhưng lại không biểu hiện ở mô tuyến tiền liệt của người không bị ung thư, do vậy xác định chỉ thị EPCA sẽ làm giảm nguy cơ các trường hợp âm tính giả khi sinh thiết EPCA có khối lượng phân tử khoảng 40kDa và điểm đẳng điện khoảng 6,73 Sử dụng kháng nguyên EPCA có thể phát hiện mầm bệnh ở bệnh nhân sớm hơn 1-2 năm trước khi có biểu hiện về hình thái ung thư tuyến tiền liệt Các kháng thể kháng EPCA có hiệu quả như một yếu tố góp phần nghiên cứu bệnh lý của các mẫu sinh thiết tiền liệt tuyến để phát hiện ung thư tuyến tiền liệt sớm hơn so với làm sinh thiết nhiều lần, cũng như có tiềm năng

giới hạn số lần làm sinh thiết ở một bệnh nhân [26]

1.3 KHÁNG THỂ

1.3.1 Cấu trúc

Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ thể tấn công các tác nhân gây bệnh Các kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hoá từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus [4]

Chuỗi nhẹ

Có trọng lượng phân tử 25kDa, chứa khoảng 211 – 221 axit amin Có hai loại chuỗi nhẹ là kappa (Қ) và lambda (λ) Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ Қ hoặc hai chuỗi nhẹ λ

mà không bao giờ chứa cả hai loại Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai vùng axit amin: vùng biến đổi (VL) nằm ở đầu phía đầu amin (-NH2) của phân tử và vùng cố định (CL) nằm ở phía đầu cacboxyl (-COOH) [4,6

Chuỗi nặng

Trọng lượng phân tử của chuỗi nặng khoảng 50 kDa, chứa khoảng 450 axit amin Có 5 loại chuỗi nặng là γ, μ, α, δ và ε ứng với 5 lớp kháng thể IgG, IgM, IgA, IgD và IgE [6] Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng axit amin: một vùng biến đổi (VH) nằm ở phía đầu amin và ba vùng cố định nằm ở phía đầu cacboxyl ký hiệu là CH1, CH2, CH3 Hai vùng biến đổi của chuỗi nặng

và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop do vậy đảm bảo

tính đa dạng của phân tử kháng thể [6]

1.3.2 Mảnh kháng thể

Hai mảnh kháng thể được thiết kế gắn với kháng nguyên – Fab và Fv được tách dòng

và bộc lộ trên phage Mảnh kháng thể lớn hơn – Fab gồm các phần VH – CH và VL – CL liên kết với nhau bằng cầu disulfide, còn mảnh kháng thể nhỏ hơn – Fv chỉ bao gồm vùng VH và

VL Dạng tái tổ hợp của Fv là mảnh biến đổi đơn chuỗi được nối với nhau bằng một đoạn peptide, thường gồm 15 axit amin có trình tự (Gly4

Ser)3 và được biểu hiện như một chuỗi polypeptide đơn Đoạn nối cho phép vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) kết hợp với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ (VL) tạo thành phân tử đơn chuỗi Phân tử tái tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn hoạt tính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích [45] Đặc điểm của các mảnh

kháng thể khác nhau được tóm tắt trong bảng 2

1.3.3 Kháng thể tái tổ hợp

Kháng thể tái tổ hợp là thuốc thử cần thiết cho nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị [25] Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh ngày càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc từ người, nhưng nguồn kháng thể người thường khó kiếm được Vì vậy, phương pháp chung để thu nhận được các kháng thể là

từ động vật gây miễn dịch và sau đó nhân tính hoá để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi

sử dụng

1.3.4 Kháng thể đặc hiệu các loại kháng nguyên

Phản ứng kháng nguyên - kháng thể rất đặc hiệu, vì vậy để thu nhận được các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên đích ta cần hiểu rõ mối tương tác kháng nguyên - kháng thể, xác định nét đặc trưng của kháng thể đối với các kháng nguyên có nguồn gốc, bản chất khác nhau

1.3.5 Các phương pháp tạo kháng thể

Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh ngày càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc của người Vì vậy, phương pháp chung để nhận được các kháng thể là từ động vật gây miễn dịch và sau đó nhân tính hóa

để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi sử dụng

Đáp ứng miễn dịch dịch thể của cơ thể được hình thành khi có kháng nguyên xâm nhập

và cảm ứng tạo ra các loại kháng thể Các kháng thể trong huyết thanh của động vật gây miễn dịch với kháng nguyên đích sau khi tinh sạch được sử dụng như một công cụ nghiên cứu rất hiệu quả và đôi khi được sử dụng trực tiếp trong điều trị Tuy nhiên các kháng thể đa dòng có tính đặc hiệu không cao, vì đó là tập hợp các kháng thể nhận biết các epitope khác nhau của kháng nguyên đích Vì vậy, việc tìm ra phương pháp tạo kháng thể đơn dòng của Kohler và Milstein đã đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu thu nhận các kháng thể đơn dòng với tính đặc hiệu cao

Phương pháp thu nhận kháng thể đơn dòng của Kohler và Milstein (1975) bao gồm các bước:

- Gây miễn dịch cho chuột bằng kháng nguyên đích

- Tạo tế bào lai bằng cách dung hợp tế bào lympho B (đã hoạt hóa bằng kháng nguyên đích

là kháng nguyên đã sử dụng để gây miễn dịch) được tách từ lách chuột với tế bào myeloma của chuột

- Chọn lọc các tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên đích

Sử dụng dòng tế bào lai chọn được để sản xuất kháng thể đơn dòng bằng cách tạo báng ở chuột hoặc nuôi cấy tế bào trong môi trường đặc biệt

1.4 THƯ VIỆN KHÁNG THỂ BỘC LỘ TRÊN THỰC KHUẨN THỂ

Trước đây, cách gây miễn dịch ở động vật theo kỹ thuật tế bào lai đã từng được sử dụng

để tạo ra kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên (có tính đa dạng cao) Những tiến bộ

trong sinh học phân tử đã cho phép sử dụng vi khuẩn Escherichia coli trong việc sản xuất

kháng thể tái tổ hợp Với kích thước giới hạn các mảnh kháng thể như Fab, Fv, scFv không

chỉ được biểu hiện trên bề mặt tê bào vi khuẩn mà còn được bộc lộ trên bề mặt thực khuẩn thể (phage) bằng cách dung hợp với protein vỏ phage

Phage hình sợi là một nhóm virus gây nhiễm vi khuẩn lớn, chúng gây nhiễm nhiều vi khuẩn Gram âm khác nhau Đặc điểm chung của chúng là hệ gen mạch vòng đơn được bao bọc bởi lớp vỏ dài dạng ống, tương đối linh động và được cấu tạo bởi hàng nghìn bản sao của một loại protein chủ yếu và một vài loại protein thứ yếu phân bố ở hai đầu ống

Hệ gen của phage hình sợi nhỏ, có khoảng hơn 10 gen phân bố sát nhau và một vùng không mã hóa (vùng IG) chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bản và đóng gói của phage Không giống với các virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi được tổng hợp và giải phóng ra khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ Hầu hết các thông tin về phage hình sợi đều nhận được từ các nghiên cứu về phage f1, M13, fd và một phần nhỏ từ phage Ike Các phage f1, M13, fd đã được sử dụng để biểu lộ các chuỗi polypeptide Hệ gen của các phage hình sợi có sự tương đồng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chúng

có thể thay thế cho nhau và vì vậy các phage này được gọi chung là phage Ff

Tính đặc hiệu của bất kỳ kháng thể nào phụ thuộc vào các vùng quyết định tính bổ trợ (CDR): 3 vùng CDR trên chuỗi nặng và 3 vùng CDR

chuỗi sử dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư, (ii) phân tách kháng thể từ người bệnh do virus để hiểu tốt hơn về đáp ứng miễn dịch trong quá trình xâm nhiễm của virus, (iii) làm sáng tỏ tính đặc hiệu của kháng thể tự miễn và nghiên cứu sự tương tác giữa các phân tử Các đoạn kháng thể dạng Fab và scFv đều có thể được bộc lộ trên bề mặt của thực khuẩn thể M13 mà không mất đi ái lực và tính đặc hiệu kháng nguyên

Về cơ bản, để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược

và PCR Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid để

có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của phage [27] Thông thường các trình tự gen tái

tổ hợp mã hóa các đoạn kháng thể được nối với đầu N của gen mã hóa protein vỏ pIII và pVIII hoặc cũng có thể gắn với đầu N của protein vỏ pVII, pIX

Chất lượng thư viện có thể được kiểm tra theo các thông số sau:

 Số lượng các dòng chứa phagemid mang đoạn scFv

 Số lượng dòng biểu hiện phage mang scFv

 Số lượng dòng biểu hiện kháng thể scFv hòa tan

Một số thư viện đã được tạo ra và sử dụng phổ biến là Nissim Library, được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Dr.G.Winter tại Cambridge (1994), và thư viện của De Kruif và cộng

sự (1995) Nổi bật nhất là thư viện tổng hợp Fab và scFv do Griffiths và cộng sự tạo ra

Cách đơn giản và thường được sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và cho dung dịch chứa phage đi qua Một số biến thể của phương pháp này đã được sử dụng thành công bao gồm cố định tên các ống hoặc phiến kính có bề mặt biến đổi hóa học, trong các cột hoặc trên bề mặt các hạt từ Có thể cố định một số phân tử sinh học bằng phương pháp hấp phụ thụ động trên ống polystyrene có bề mặt được biến đổi thích hợp như MaxiSorp

TM hoặc sử dụng đích được biotin hóa Các phương pháp sàng lọc tân tiến hơn cũng đã được

áp dụng bao gồm sàng lọc với toàn bộ tế bào sống, với phân đoạn mô cố định hoặc thậm chí

trong động vật sống

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Sinh phẩm

- Gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên UTTLT được cung cấp từ nguồn gen thiết kế thuộc phòng Công nghệ tế bào động vật, viện Công nghệ sinh học

- Phagemid pHEN2

- E.coli chủng TG1 do trung tâm Công nghệ Protein MRC Vương Quốc Anh cung cấp

- Kháng thể cộng hợp kháng M13 (anti-M13 horseradish peroxidase-conjugate) của hãng Amersham Biosciences, USA

- 31 mẫu máu của bệnh nhân ung thư tiền liệt tuyến do khoa hóa sinh, bệnh viện Bạch Mai cung cấp

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng là các hóa chất tiêu chuẩn chuyên dùng cho sinh học phân tử do các hãng hóa chất có uy tín như Invitrogen, Fermentas… cung cấp và các hóa chất khác của phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Gen – Viện Công nghệ sinh học: Cao nấm men (Yeast extract), Tryptone, Agar, Ampicillin, Tris-HCl, EDTA, NaOH, SDS, EtBr, Phenol, Chloroform, isoamyl alcohol, acid acetic, nước khử ion vô trùng, BSA, Taq buffer, CaCl2…

2.1.3 Trang thiết bị

 Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, CHLB Đức)

 Máy lắc ổn nhiệt

 Bể ổn nhiệt

 Lò vi sóng (Samsung)

 Tủ lạnh sâu (-200C, -850C);

 Máy Voltex (Rotolab, OSI)

 Máy điện di

 Máy đo pH

 Tủ cấy vô trùng

 Pipetman các loại (Gilson, Pháp)

 Máy soi chụp gel (Pharmacia) và các thiết bị khác chủ yếu thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ Sinh học

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nhân bản gen bằng kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.2.2 Phương pháp cắt và gắn DNA

2.2.3 Phương pháp tạo tế bào khả biến E.coli TG1

2.2.4 Biến nạp Plasmid vào tế bào E.coli

2.2.5 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong bình tam giác với thể tích từ 20 – 50 ml chứa 5-15ml môi trường thích hợp cho từng loại Bình nuôi cấy được đặt trong máy lắc ổn nhiệt ở

370C với tốc độ lắc 220v/ph

2.2.6 Phương pháp giữ chủng

Các khuẩn lạc đơn được trải trên môi trường thạch thích hợp, ủ 370C qua đêm Sau đó, có thể giữ đĩa thạch chứa các chủng này tại 40C trong vòng 2 tuần

2.2.7 Phương pháp điện di trên gel Agarose

DNA tích điện âm có khả năng chuyển động trong điện trường theo chiều từ cực âm đến cực dương Tốc độ chuyển động của chúng trong điện trường có hiệu điện thế không đổi phụ thuộc vào các yếu tố: Dạng tồn tại của DNA, kích thước DNA, nồng độ agarose trong gel

và hiệu điện thế giữa hai cực Các DNA có kích thước càng lớn thì chuyển động càng chậm, các DNA dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn DNA dạng thẳng Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose Thường các đoạn gen có kích thước từ 300 – 10.000 bp có thể được phân tách trên gel agarose 0,8% Đoạn gen càng nhỏ thì nồng độ agarose càng phải

tăng lên

2.2.8 Xác định trình tự nucleotide của DNA bằng máy giải trình tự trên cơ sở phương pháp dideoxy (Sanger)

Nguyên tắc: Sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) có đánh dấu huỳnh quang để làm

ngừng các mạch đơn DNA đang được tổng hợp một cách ngẫu nhiên Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’- OH, khi

gặp ddNTP (không có nhóm 3’- OH) thì phản ứng tổng hợp bị ngừng lại

2.2.9 Chuẩn bị thư viện phage

2.2.10 Bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13

2.2.11 Phương pháp ELISA

ELISA là một kỹ thuật hóa sinh sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự

có mặt của một kháng thể hoặc một kháng nguyên trong mẫu ELISA được sử dụng như một công cụ phân tích trong y học và bệnh học, cũng như là một phép kiểm tra chất lượng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau Trong ELISA, một lượng kháng nguyên chưa biết được

cố định trên một bề mặt, và sau đó kháng thể đặc hiệu được đưa vào để chúng có thể liên kết với kháng nguyên Những kháng thể này được gắn với một enzyme, và trong bước cuối cùng

cơ chất được thêm vào để enzyme có thể chuyển chúng thành tín hiệu phát hiện Vì thế trong trường hợp của ELISA fluorescence, khi ánh sáng với bước sóng thích hợp chiếu vào mẫu, bất kỳ phức hệ kháng nguyên-kháng thể nào cũng phát sáng đủ để lượng kháng nguyên trong mẫu có thể đo được thông qua cường độ phát sáng

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nhân bản gen mã hóa mảnh kháng thể scFv bằng PCR

Để có thể thu được gen mã hóa mảnh kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của bệnh ung thư tiền liệt tuyến đủ cho việc thiết kế vector biểu hiện, chúng tôi thực hiện phản ứng nhân gen bằng kỹ thuật PCR với 2 mồi đặc hiệu: TTLF: 5’- GGCCCCATGGCCATTGCGGGCCTG – 3’

TTLR: 5’- GATGTGCGGCCGCACGTTTGATTTC – 3’

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gen agarose như hình 1:

Hình 1: Điện di sản phẩm PCR

M: Marker DNA 1kb ( Fermentas), G1: Sản phẩm PCR

Hình ảnh điện di trên cho thấy sản phẩm PCR thu được khá đặc hiệu, kết quả phù hợp với tính toán lý thuyết, băng thu được có kích thước như mong muốn là 496 bp Như vậy, có

thể khẳng định chúng tôi đã nhân bản thành công gen scFv mã hóa cho mảnh kháng thể scFv

500

bp

M 1

đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT, gen thu được mang hai vị trí cắt của hai enzyme

giới hạn NcoI và NotI

3.2 Kết quả tạo vector tái tổ hợp pHEN2 - scFv

Từ nguồn sản phẩm PCR thu được ở trên, chúng tôi đã sử dụng các enzyme giới hạn

NotI và NcoI xử lý chúng để tạo hai đầu dính giúp cho việc gắn gen vào phagemid được dễ

dàng hơn Tương tự, phagemid pHEN2 cũng được xử lý với hai enzyme trên tạo hai đầu dính

bổ sung Hỗn hợp phản ứng được ủ trong bể ổn nhiệt 37oC trong thời gian 16 giờ Sau đó, sản

phẩm cắt được điện di trên gel agarose và tiến hành tinh sạch từ gel để thu được gen scFv và

phagemid pHEN2 có hai đầu dính đảm bảo cho phản ứng nối gen

Sau đó nhờ enzyme nối T4 ligase nối hai đầu dính của đoạn gen scFv vào vector mở

vòng pHEN2 Thực hiện biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vector tái tổ hợp pHEN2 vào

vi khuẩn E.coli chủng TG1 theo quy trình 2.2.4 như đã trình bày ở trên Phagemid pHEN2 có

chứa đoạn gen kháng kháng sinh ampicillin nên khi vector này được biến nạp vào vi khuẩn

E.coli thành công thì những tế bào chứa phagemid sẽ sống sót trên môi trường có ampicillin

Còn những tế bào không nhận vector sẽ không mọc được trên đĩa LB có bổ sung ampicillin

Hình 2: Kết quả biến nạp sản phẩm nối ghép giữa phagemid pHEN2 với gen scFv

vào E.coli chủng TG1

Kết quả biến nạp cho thấy trên đĩa LB-agar, các khuẩn lạc trắng mọc riêng rẽ có thể

phân biệt bằng mắt thường Như vậy, quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli TG1

thành công Tuy nhiên, sự xuất hiện của các khuẩn lạc này mới chỉ khẳng định được trong tế bào vi khuẩn TG1 thu được có chứa phagemid pHEN2 còn pHEN2 đã chứa gen scFv hay chưa thì chưa xác định được Do đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra chọn dòng tế bào TG1 chứa

phagemid tái tổ hợp 3.3 Chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT

Để tiến hành chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT chúng tôi

sử dụng phương pháp PCR khuẩn lạc 7 khuẩn lạc được chọn để tiến hành PCR cùng phagemid gốc với cặp mồi của vector pHEN2 có tên là LabF/R và chu trình nhiệt phù hợp Cặp mồi LabF/R được thiết kế nằm về hai phía của vùng cắt gắn đa điểm, nếu vector gốc chưa gắn thêm đoạn gen ngoại lai thì sau khi PCR với mồi Lab sẽ thu được sản phẩm khoảng

200 bp, nếu vector gắn thêm đoạn gen ngoại lai thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước bằng kích thước của gen ngoại lai cộng với 200 bp

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trên hình 18:

1 2 3 4 5 6 7

M

Hình 3: Kết quả PCR từ khuẩn lạc chọn dòng chủng TG1 chứa phagemid tái tổ hợp

pHEN2-scFv G1-7: Các khuẩn lạc từ 1-7

Kết quả điện di trên hình 18 cho thấy các khuẩn lạc 1,2,3,5 cho băng điện di có kích thước mong muốn là khoảng 700bp, trong khi 3 khuẩn lạc 4,6,7 không nhìn thấy băng Điều

đó chứng tỏ khả năng 4 dòng tế bào 1,2,3,5 đều chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2-scFv Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn chúng tôi tiến hành tách chiết phagemid và xác định trình tự, đồng thời kiểm tra gen mã hóa scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT gắn vào

pHEN2 có đúng chiều và khung đọc hay không

3.4 Xác định trình tự gen scFv trong phagemid tái tổ hợp pHEN2/scFv

Trong 4 dòng TG1 có khả năng mang phagemid tái tổ hợp đã xác định sơ bộ bằng phương pháp PCR từ khuẩn lạc, chúng tôi chọn khuẩn lạc số 2 cho băng sắc nét nhất để nhân nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline (100 μg/ml) và tách chiết phagemid Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp được thể hiện trên hình 4

Hình 4 Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp

Giếng 1,2: Các phagemid tách chiết từ khuẩn lạc số 2

Phagemid thu được được tiến hành xác định trình tự với mồi LabF sử dụng kit “Big Dye Terminator sequencing kit” (ABI, Mỹ) và thực hiện trên máy xác định trình tự ABI

700bp

750bp

1

2

PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer theo phương pháp Sanger và cs Kết quả thu được được thể hiện trên hình 5

1 ATCCTATTGC CTACGGCAGC CGCTGGATTG TTATTACTCG CGGCCCAGCC

51 GGCCATGGCC ATTGCGGGCC TGGCGACCCC GGGCTGGAGC

CATTGGCTGG

101 CGCTGACGCC ATGGCCCAGG TGCAGCTGCA GGTCGACCTC

GAGTGGTGGA

151 GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT AGTGCACTTG

AGATTGTGAT

201 GACCCAGACT CCACTCTCCT CACCTGTCAC CCTTGGACAG

CCGGCCTCCA

251 TCTCCTGCAG GTCTAGTCAA AGCCTCGTAC ACAGTGATGG

AAACACCTAC

301 TTGAGTTGGC TTCAGCAGAG GCCAGGCCAG CCTCCAAGAC

TCCTAATTTA

351 TAAGATTTCT AACCGGTTCT CTGGAGTGCC AGATAGGTTC

AGTGGCAGCG

401 GGTCAGGGAC AGATTTCACA CTGAAAATCA GCAGGGTGGA

AGCTGAGGAT

451 GTCGGGGTTT ATTACTGCAT GCAAGCTGCA CAATTTCGCC

GTTCTACGTT

501 CGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AAATCAAACG TGCGGCCGCA

CTCGAGCACC

551 ACCACCACCA CCACTGA

Hình 5: Trình tự gen scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT

Các chữ màu đỏ: trình tự gen scFv; chữ màu đen: 1 phần trình tự phagemid pHEN2

Từ trình tự gen thu được để tiến hành kiểm tra xem gen scFv gắn vào phagemid pHEN2

đã đúng chiều đúng khung đọc hay chưa, chúng tôi tiến hành suy diễn ra trình tự amino acid

bằng phần mềm chuyên dụng, kết quả thu được như sau:

1 ILLPTAAAGL LLLAAQPAMA IAGLATPGWS HWLALTPWPR CSCRSTSSGG

51 GGSGGGGSGG SALEIVMTQT PLSSPVTLGQ PASISCRSSQ SLVHSDGNTY

101 LSWLQQRPGQ PPRLLIYKIS NRFSGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAED

151 VGVYYCMQAA QFRRSTFGQG TKLEIKRAAA LEHHHHHH*

Hình 6: Trình tự amino acid suy diễn

Kết quả thu được giúp chúng tôi khẳng định chắc chắn rằng gen mã hóa cho scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA đã được gắn vào phagemid pHEN2 theo chiều đúng khung đọc đảm bảo cho quá trình bộc lộ scFv trên bề mặt phage

3.5 Kết quả bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13

E.coli chủng TG1 chứa phagemid-scFv đã chọn được ở trên được nhân nuôi ở 37oC đến khi đạt OD600 = 0,5 và sau đó được hiễm helper phage M13 vào để hỗ trợ việc hình thành phage-scFv một cách hoàn chỉnh theo phương pháp 2.2.10 Một trong những điểm mạnh của

kỹ thuật phage display là mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình, trong đó bộ gen của phage thực chất là phagemid vector (pHEN2 vector)