Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài thực vật thuộc chi Agrimonia họ hoa hồng (Rosaceae) Hồ Đắc Hùng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Hóa hữu cơ; Mã số: 60 44 27 Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Gia Điền Năm bảo vệ: 2013 Abstract Tìm hiểu thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia); số kết nghiên cứu hóa thực vật chi Agrimonia; số kết nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Agrimonia; cơng dụng số lồi thực vật chi Agrimonia sử dụng y học dân tộc Việt Nam; nghiên cứu nước hoạt tính sinh học thực vật chi Agrimonia Nghiên cứu chiết tách mẫu với loại dung môi khác nhau; khảo sát hoạt tính sinh học cặn dịch chiết; phân lập tinh chế hợp chất; xác định cấu trúc hóa học chất phân lập Keywords Hóa hữu cơ; Thực vật có hoa; Thành phần hóa học; Hoạt tính sinh học Content MỞ ĐẦU Thực vật kho tàng vô phong phú hợp chất thiên nhiên, hàng trăm nghìn hợp chất thiên nhiên tìm nghiên cứu để phục vụ cho nhiều lĩnh vực sống, đặc biệt y học Thiên nhiên không nguồn nguyên liệu cung cấp hoạt chất q để tạo biệt dược mà cịn cung cấp chất dẫn đường để tổng hợp loại thuốc Từ tiền chất phân lập từ thiên nhiên, nhà khoa học chuyển hóa chúng thành hợp chất có khả trị bệnh cao Các kết thống kê gần cho thấy hợp chất đăng ký làm thuốc tồn giới 61% hợp chất thiên nhiên chất có liên quan tới chúng Trong có 6% hợp chất thiên nhiên, 27% dẫn xuất hợp chất thiên nhiên, 5% hợp chất tổng hợp có mang nguyên liệu đầu bắt nguồn từ hợp chất thiên nhiên 23% chất tổng hợp thiết kế sở cấu trúc phân tử thu từ hợp chất thiên nhiên (các chất mô hợp chất thiên nhiên) Trong số lĩnh vực trị liệu có đến 78% hoạt chất dùng làm thuốc kháng sinh 74% hoạt chất dùng làm thuốc chữa ung thư hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [*] Việt nam nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa vùng có tính đa dạng sinh học cao Riêng thực vật, Việt Nam có khoảng 12000 lồi, có 2300 lồi thực vật sử dụng làm lương thực, thuốc chữa bệnh… Khoảng 25% loại thuốc sử dụng thông thường xuất phát từ loài thực vật dùng y học dân gian Cây Long nha thảo có tên khoa học: Agrimonia pilosa Ledeb thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) loại thảo sống lâu năm có nguồn gốc vùng Hymalaya, bao gồm Trung quốc Ấn độ Việt Nam Trong y học dân gian Long nha thảo sử dụng làm thuốc cầm máu, chữa thổ huyết, khái huyết (ho máu), nục huyết (đổ máu cam), lỵ phân lẫn máu, sốt rét mụn nhọt lở loét da [1] Các nghiên cứu gần cho thấy, Long nha thảo vị thuốc có phổ tác dụng tương đối rộng, từ chống viêm nhiễm, tăng cường khả miễn dịch thể, có tác dụng ức chế khối u đến khả kháng HIV… quan tâm nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới, Việt Nam sử dụng theo kinh nghiệm dân gian chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Ngoài ra, Long nha thảo mười thành phần vị thuốc nhóm lương y thuộc phòng nghiên cứu thuốc, thuốc dân tộc thuộc Trung Tâm Cơng nghệ Hóa dược hóa sinh hữu - Viện KH & CNVN sử dụng từ năm 2004 điều trị thành công số bệnh nhân nhiễm HIV chuyển sang AIDS Trên sở thuốc nam chúng tơi chọn Long nha thảo làm đối tượng nghiên cứu luận văn với mục đích tìm hiểu thành phần hóa học tác dụng dược lý với nội dung là: Nghiên cứu phân lập hợp chất có Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.) họ hoa hồng (Rosaceae), thu hái Sapa-Lào Cai Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn dịch chiết chất phân lập [*] David J Newman, Gordon M Cragg, and Kenneth M Snader (2003), “Natural products as sources of new drugs over the periode 1981-2002” J Nat prod 66, pp1022-1037 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia) Chi Long nha thảo (danh pháp khoa học: Agrimonia) chi chứa khoảng 12-15 loài Chi Long nha thảo thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) có nguồn gốc vùng Hymalaya, bao gồm Trung Quốc, Ấn Độ ngồi cịn có khu vực ôn đới Bắc bán cầu, châu Âu châu Phi Theo thống kê loài thuộc chi Agrimonia phân bố giới: - Agrimonia eupatoria (1 loài phân bố Châu Âu, Châu Á, Châu Phi) - A coreana, A nipponica (1 lồi phân bố Đơng Á) - Agrimonia pilosa (1 lồi phân bố Đơng Âu, Châu Á) - Agrimonia procera (1 loài phân bố Châu Âu) - Agrimonia repens (1 loài phân bố Nam Á) - A rostellata, A striata, A gryposepala, A incisa, A microcarpa, A parviflora, A pubescens (7 loài phân bố Bắc Mỹ) Ở Việt Nam có nhiều Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hịa Bình, Tam Đảo chủ yếu lồi A pilosa [1] 1.2 Một số kết nghiên cứu hóa thực vật chi Agrimonia Thành phần hóa học chi Agrimonia nghiên cứu giới nhiên Việt Nam chưa có nghiên cứu chi Loài A pilosa Ledeb sử dụng thuốc dân gian, chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các nghiên cứu thành phần hóa học từ lồi Agrimonia pilosa có mặt hợp chất flavonoid, tritecpen, saponin tanin [2,3,4] có số nghiên cứu cơng bố hoạt tính sinh học từ phần dịch chiết từ thân loài này; đáng ý hoạt tính sinh học kháng khuẩn, chống oxy hóa, hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư hoạt tính kháng HIV [5,6 ,7] Thành phần hóa học lồi thuộc chi Agrimonia tecpenoit, flavonoit số hợp chất khác 1.2.1 Các hợp chất flavonoit Một số nghiên cứu thành phần hóa học số lồi thực vật thuộc chi Agrimonia giới: Khi nghiên cứu thành phần hóa học lồi A pilosa Ledeb, nhà nghiên cứu Trung Quốc Nhật Bản phân lập xác định cấu trúc hợp chất như: Aromadendrin (1), aromadendrin 3-O-β-d-glucopyranosit (2), astragalin (3), afzelin (4), tilirosit (5), luteolin (6), quercetin (7) , isoquercetrin (8), quercitrin (9), takanechromone C (10), 5,7-dihydroxy-2-propylchromone 7-O-β-d-glucopyranosit (11), 5,7-dihydroxy-2propylchromone (12), demethylagrimonolit 6-O-β-d-glucopyranosit (13), agrimonolit 6-Oglucosit (14), demethylagrimonolit (15), methylagrimonolit (16), agrimonolit (17) [8, 9] 5' 6' O R2 3' 5' 6' 1' O OR1 OH R1 R1 R1 R1 R1 R1 R1=H R1=Glc R2=OGlc 3' R2 6 OH 2' O HO 4' OH 1' 4' OH 2' R1 O =O-Rha R2=H =O-6- cumaroyl-Glc R2=H =H R2=OH =R2 =OH =O-Glc R2=OH =O-Rha R2=OH 4' OR2 O R 2O R1 1'' R1O 3 OH 1' 2'' O OH O 10 R1 =propyl R2=Glc 11 R1 =isopropyl R2=Glc 12 R1 =propyl R2=H O 13 R1 14 R1 15 R1 16 R1 17 R1 =Glc R2=H =Glc R2=CH3 = R2=H = R2=CH3 =H R2=CH3 Glc:-D-glucopyranosyl Rha: -L-rhamnopyranosyl 1.2.2 Các hợp chất tecpenoit Các nhà Khoa học Hàn Quốc Trung Quốc phân lập xác định cấu trúc tritecpenoit usrolic axít (25), polmolic axít (26), tormentic axít (27), corosolic axít (28) từ lồi Agrimonia pilosa Ledeb Các hợp chất có hoạt tính sinh học hoạt tính kháng viêm, trừ giun sán chống chảy máu [2, 3] 30 29 R2 20 19 12 18 25 26 COOH R1 28 27 HO 24 23 25 R1 = R2= H 26 R1 = H R2=OH 27 R1 = R2= OH 28 R1 = H R2=OH 1.2.3 Các hợp chất khác Các loài thực vật thuộc chi Agrimonia có chứa chất hypericin, agrimophol, agrimol A-G, caffeic axit, gallic axit, dầu bay hơi, tannin, axit hữu cơ, vitamin C, K [1] O OH O H3C HO CH3 HO OH CH3 HO CH3 MeO CH2 H3C O OH O O H3C OH CH3 30 Agrimophol 29 Hypericin OH OH OH R1OC COR3 OH HO HO OH MeO CH3 COR OMe CH3 Agrimol A: R1=R3=CH(CH3)2, R2=CH(CH3)CH2CH3 B: R1=R3=CH2CH2CH3, R2=CH(CH3)CH2CH3 C: R1=R2 =R3=CH2CH2CH3 D: R1=CH(CH3)2, R2=CH(CH3)CH2CH3, R3=CH3 E: R1=R3=CH3, R2=CH(CH3)CH2CH3 F: R1=CH3, R2 =R3=CH2CH2CH3 G: R1=R2 =R3=CH(CH3)2 Một số kết nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Agrimonia 2.1 Công dụng số loài thực vật chi Agrimonia đƣợc sử dụng y học dân tộc Việt Nam: Long nha thảo A pilosa Ledeb, có tác dụng thu liễm huyết, cầm lỵ, sát trùng Điều trị chứng xuất huyết khái huyết, thổ huyết, nục huyết, niệu huyết, tiện huyết, băng lậu, phúc tả, kiết lỵ, sốt rét, viêm âm đạo trùng roi [1] Long nha thảo thường sử dụng chữa bệnh ban xuất huyết giảm tiểu cầu, ban xuất huyết dị ứng, bệnh ưa chảy máu (hemophilia), xuất huyết đường tiêu hóa, xuất huyết đường tiết niệu, xuất huyết tử cung Đặt biệt, kết nghiên cứu dược lý gần phát Long nha thảo có tác dụng tăng cường khả miễn dịch thể, chất quercetin, ursolic acid, Long nha thảo có tác dụng ức chế khả tái sinh virut HIV [19] Hiện Long nha thảo bắt đầu sử dụng lâm sàng cho bệnh nhân HIV/AIDS Đã có số nghiên cứu nước từ nguồn tổng hợp nguồn gốc tự nhiên để làm thuốc điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS Theo đó, Long nha thảo sử dụng 10 vị thuốc mà nhóm lương y thuộc phịng nghiên cứu thuốc, thuốc dân tộc thuộc Trung tâm Cơng nghệ Hóa dược hóa sinh hữu - Viện KH & CNVN từ năm 2004 điều trị thành công bệnh nhân nhiễm HIV chuyển sang AIDS (theo xét nghiệm bệnh viện Quân y 103 với biểu người bị lở loét, nhiễm trùng phổi nặng, suy kiệt thể chất Sau tháng điều trị thuốc nam, bệnh nhân khỏi bệnh, tăng cân, thân thể lành lặn người bình thường Trên sở thuốc nam đó, đến năm 2011 lương y Trung Tâm hoàn thiện thuốc tiến hành chữa khỏi cho nhiều bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS Những bệnh nhân khỏi bệnh, làm việc bình thường khơng phải dùng thuốc 2.2 Những nghiên cứu nƣớc ngồi hoạt tính sinh học thực vật chi Agrimonia : Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các nghiên cứu hoạt tính sinh học từ phần dịch chiết từ thân loài hoạt tính sinh học kháng khuẩn, chống oxy hóa, hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư hoạt tính kháng HIV [2,5,7,19] Các nghiên cứu đại cho thấy, Long nha thảo vị thuốc có phổ tác dụng tương đối rộng Chất agrimol Long nha thảo có tác dụng trừ sán; tannins Long nha thảo có tác dụng chống virut gây bệnh mụn rộp Cao thuốc chế từ Long nha thảo có tác dụng làm co mạch ngoại biên, tăng tốc độ đông máu, có tác dụng ức chế mạnh tụ cầu khuẩn vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn coli, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn thương hàn trực khuẩn lao Kết nghiên cứu Trung Quốc cho thấy Long nha thảo có tác dụng ức chế mạnh tế bào ung thư mô liên kết S180, ung thư ruột, ung thư gan số loại ung thư khác Đặt biệt, kết nghiên cứu dược lý thập niên gần phát thêm Long nha thảo có tác dụng tăng cường khả miễn dịch thể; chất quercetin, ursolic axít, Long nha thảo có tác dụng ức chế khả tái sinh virut HIV Hiện Long nha thảo bắt đầu sử dụng lâm sàng cho bệnh nhân HIV/AIDS CHƢƠNG ĐỒI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, nhiệm vụ nghiên cứu: Đối tượng thuốc dân gian Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.), thu hái để nghiên cứu Ở Việt Nam có nhiều Lào cai, Lai châu, Hà giang, Cao bằng, Lạng sơn, Hịa bình, Tam đảo[1] Các nhiệm vụ luận văn là: - Chiết tách mẫu với loại dung môi khác - Khảo sát hoạt tính sinh học cặn dịch chiết - Phân lập tinh chế hợp chất - Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập hợp chất: Các phương pháp phân lập tinh chế hợp chất bao gồm phương pháp sắc ký như: - Sắc kí lớp mỏng thực mỏng silica gel tráng sẵn 60 F254 (Merck) Phát chất đèn tử ngoại hai bước sóng λ 254 nm 365 nm; dùng thuốc dung dịch H2SO4 10% dung dịch xeri sunfat - Sắc kí cột thường (CC), chất hấp phụ silica gel Merck cỡ hạt 40-63µm - Sắc kí cột nhanh (FC), chất hấp phụ silicagel Merck cỡ hạt 15-40µm - Sắc ký cột gel (sephadex LH-20 ) nhựa trao đổi ion Diaion HP-20; Sắc ký ngược pha RP-18 sắc ký mỏng điều chế kết tinh 2.2.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất: Cấu trúc hóa học chất xác định kết hợp phương pháp vật lý phương pháp phổ đại như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EIMS, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY…) 2.2.3 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định thử chủng vi khuẩn nấm theo phương pháp pha loãng nồng độ Hadacek F Greger H Hoạt tính gây độc tế bào thử theo phương pháp Scudiero D A cộng dịng tế bào ung thư biểu mơ (KB), ung thư vú (MCF7) đối chiếu với chất chuẩn Hoạt tính kháng oxi hóa thử theo phương pháp DPPH Shela G cộng CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm thực vật Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.) Cây Long nha thảo loại thảo sống lâu năm cao khoảng 60-120cm, tồn thân rậm lơng nhung dài màu trắng Lá 5-9 chét to phụ nhỏ, hình bầu dục hay trái xoan ngược, mép có có lơng nhung len hai mặt, có tuyến, bắc xoan to, có Chùm hoa thưa cao 10-30cm, cuống hoa ngắn, đài có thuỳ nhọn; cánh hoa màu vàng, nhị 515, nhụy hai noãn rời Ðài có gai móc đứng, rãnh 10, bế 2, hoa tháng 4-7, tháng 8-10 Hình Cây Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.) 3.2 Chiết xuất phân lập hợp chất 3.2.1 Thu hái xử lý mẫu thực vật: Chúng chọn thời điểm phát triển chúng có hoa để thu hái Mẫu thực vật thu hái vào tháng Sapa - Lào cai - Việt nam Tên nhà thực vật học Nguyễn Kim Đào (Viện sinh thái tài nguyên sinh vật) thẩm định, tiêu lưu giữ phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viên Khoa học Công nghệ Việt Nam 3.2.2 Sơ đồ phân lập chiết tách mẫu thực vật Sơ đồ1: Chiết tách mẫu thực vật Mẫu thực vật Sấy khô Xay nhỏ Bột mẫu thực vật (1,1kg) Chiết siêu âm với EtOH (%) Cất loại dung môi áp suất giảm Cặn dịch chiết (A7) Chiết phân đoạn với dung môi Dm CH2Cl2 Dc CH2Cl2 Dm EtOAc Dc EtOAc Dm Butanol Dc Butanol Các dịch chiết cất loại dung môi áp suất giảm Cặn dc CH2Cl2 Cặn dc EtOAc Cặn dc Butanol A8 (21 g) A9 (16 g) A10 (50 mg) Sơ đồ 2: Phân lập hợp chất cặn dịch chiết CH2Cl2 Cặn dc CH2Cl2 (21 g) - SKC chân không VLC - Hệ dung môi: aceton/n-hexane (0%-100%) MeOH/CH2Cl2 (0%-10%) F1 F2 F3 F4 F5 Kết tinh lại với hệ dung môi F6 F7 SKC nhanh (FC), hệ dung môi: CH2Cl2MeOH (1:99-9:1) n-hexane/acetone Hợp chất Hợp chất (12 mg) (15 mg) Sơ đồ 3: Phân lập hợp chất cặn dịch chiết EtOAc Dc EtOAc (16 g) - SKC chân không VLC - Hệ dung môi aceton/n-hexane (0%-100%) MeOH/CH2Cl2 (0%-40%) Pđ Pđ Pđ Pđ Pđ SKC gel (sephadex LH20), hệ dung môi: MeOH/CH2Cl2 Hợp chất AP5 (15 mg) Pđ Pđ Pđ SK mỏng điều chế pha đảo RP-18, hệ dung môi MeOH/ H2O (6/4) Hợp chất AP7 (7 mg) Sơ đồ (tiếp theo): Phân lập hợp chất từ phân đoạn cặn dịch chiết EtOAc Pđ SKC gel sephadex LH-20, dung môi MeOH Pđ 3.1 Pđ 3.2 Pđ 3.3 Pđ 3.4 Tinh chế lại dung môi MeOH Kết tinh lại, hệ dung môi nHexan/Axeton Hợp chất AP Hợp chất AP2 (20 mg) (7 mg) Sơ đồ (tiếp theo): Phân lập hợp chất từ phân đoạn cặn dịch chiết EtOAc Pđ SKC silica gel, hệ dung môi CH2Cl2-MeOH(1:99-8:2) Pđ 4.1 Pđ 4.2 Tinh chế với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH Pđ 4.3 Pđ 4.4 Pđ 4.5 SK cột gel (sephadex LH-20), dung môi rửa MeOH Hợp chất AP3 Hợp chất AP4 (8 mg) (16 mg) 3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất: *) Chất (ß-sitosterol): phân lập từ phân đoạn F3 cặn dịch chiết CH2Cl2, điểm nóng chảy: 140-142°C, Rf = 0,81 hệ dung mơi CH2Cl2/MeOH (98:2) Phân tích liệu phổ hồng ngoại IR, MS phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR có so sánh với tài liệu cho phép kết luận chất ß- sitosterol [9] [27] 29 28 21 22 25 24 18 20 26 23 12 17 27 11 13 19 16 14 10 15 RO ß- sitosterol R=H ß- sitosterol-3-O-ß-D- glucopyranosit R=Glucose H-NMR (CDCl3, 500MHz); δ (ppm): 5,35 (1H, t, H-6); 3,53 (1H, sept, H-3); 2,27 and 1,98 (CH2); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,92 (3H, d, J = 6,4Hz, CH3-21); 0,85 (3H, t, J = 7,6Hz, CH3-29); 0,84 (3H, d, J = 7,0Hz, CH3-26 or 27); 0,82 (3H, d, J = 7,0Hz, CH3-26 or 27); 0,68 (3H, s, CH3-18) *) Chất (β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit) phân lập từ phân đoạn F5 cặn dịch chiết CH2Cl2 sắc ký cột nhanh (FC) chất hấp phụ silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (1:99-9:1) Chất thu dạng vơ định hình mầu trắng, điểm nóng chảy: 285-286°C, ESI-MS m/z 575 [M-H]- phù hợp với tài liệu công bố [9, 28] cho phép nhận dạng chất β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit hay daucosterol H-NMR (500MHz, DMSO-d6, TMS), δ (ppm): 0,77 (3H, s, CH3-18), 0,81 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27); 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, t, J = 7,0 Hz, CH3-29); 0,90 (3H, d, J = 6,0 Hz, CH3-21); 0,96 (3H, s, CH3-19); 3,46 (1H, m, H-3); 5,33 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6); 2,90 (1H, m, H-2′); 3,02 (1H, m, H-4′); 3,07 (1H, m, H-5′); 3,12 (1H, m, H-3′); 3,41 (1H, m, H-6′a); 3,65 (1H, m, H-6′b); 4,22 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1′) 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6, TMS); δ, ppm: 11,7 (CH3-18), 19,0 (CH3-27); 19,7 (CH3-26), 11,73 (CH3-29); 18,6 (CH3-21); 18,90 (CH3-19); 20,6 (C-11); 22,6 (C-28); 23,2 (C-15); 25,4 (C-23); 27,7 (C-16); 28,7 (C-25); 29,2 (C-2); 31,3 (C-7); 31,4 (C-8); 33,3 (C22); 35,4 (C-20); 36,2 (C-10); 36,8 (C-1); 38,3 (C-4); 39,2 (C-12); 41,8 (C-13); 45,1 (C-24); 49,6 (C-9); 55,4 (C-17); 56,1 (C-14); 76,9 (C-3); 121,1 (C-6); 140,4 (C-5); 60,1 (C-6′); 70,1 (C-4′); 73,3 (C-2′); 76,4 (C-3′); 76,7 (C-5′); 100,7 (C-1′) *) Hợp chất AP (3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone): 5' H3CO 4' 6' OCH3 O OCH3 3' 1' 2' OCH3 H3CO OCH3 O OCH3 AP 3,5,6,7,8,3',4',-heptamethoxy flavon Hợp chất AP thu dạng tinh thể hình kim, màu vàng, điểm nóng chảy 129-130oC, ESI-MS m/z 432 [M]+ (cơng thức phân tử: C22H24O9,) Từ liệu thu được, so sánh với tài liệu [29, 31, 32] xác định hợp chất AP 3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone H-NMR (CDCl3); δ (ppm): 7,84 (dd, J=8, 2Hz, H-6′); 7,82 (d, J=2Hz, H-2′); 7,02 (d, J= 8Hz, H-5′); 3,99 (3H, s, 3’-OCH3); 3,98 (3H, s, 4’-OC3); 4,01 (3H, s, 8-OCH3); 4,10 (3H, s, 7-OCH3); 3,96 (3H, s, 6-OCH3); 4,0 (3H, s, 5-OCH3) ; 3,90 (3H, s, 3-OCH3) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3); δ (ppm): 153,0 (C-2); 140,7 (C-3); 175,38 (C-4); 148,2 (C-5); 143,8 (C-6); 151,3 (C-7); 137,85 (C-8); 146,72 (C-9); 115,1 (C-10); 123,50 (C1′); 111,1 (C-2′); 149,95 (C-3′); 153,05 (C-4′); 111,0 (C-5′); 121,9 (C-6′); 62,0 (OCH3-8): 61,7 (OCH3-7); 61,8 (OCH3-6); 62,3 (OCH3-5); 59,9 (OCH3-3); 55,7 (OCH3-4’); 55,7 (OCH3-3’) *) Hợp chất AP2 (5, 7, 3’- trihydroxy- 6, 4’,5’- trimetoxy flavon) HO O H3CO 2' OH 3' OH O 1' 4' 6' OCH3 5' OCH3 AP2 5,7, 3'-trihydroxy-6,,4',5' trimetoxyflavon Hợp chất AP2 thu chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 289-291oC, EI-MS m/z 359 [M-H]- (cơng thức phân tử C18H16O8) Trên sở liệu thu được, so sánh với tài liệu [34, 35, 36] xác định hợp chất AP2 5,7,3’- trihydroxy - 6, 4’,5’- trimetoxy flavon H-NMR (MeOD3); δ (ppm): 8,1 (s, H-2); 6,4 (s, H-8); 6,72 (d, J=2Hz, H-2’); 6,70 (d, J=2Hz, H-6); 3,89 (s, 5’-OCH3); 3,88 (s, 6-OCH3); 3,83 (s, 4’-OCH3) 13 C-NMR (MeOD3); δ 155,5 (C-2), 128,0 (C-3); 182,3 (C-4); 154,9 (C-5); 132,9 (C-6); 158,8 (C-7); 95,0 (C-8); 154,4 (C-9); 106,6 (C-10); 124,1 (C-1’); 106,1 (C-2’), 151,5 (C-3’); 137,9 (C-4’); 154,6 (C-5’); 111,1 (C-6’); 61,0 (OCH3-4’); 59,6 (OCH3-5’); 60,9 (OCH3-6) *) Hợp chất AP3 (ursolic axit) 30 29 20 19 12 21 22 18 13 25 11 17 26 COOH 14 16 10 HO 28 15 27 24 23 Ursolic acid Chất AP3 phân lập từ phân đoạn F4.2 phần dịch chiết EtOAc, dạng chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 284-286oC ESI-MS m/z 456 [M]+ (cơng thức phân tử C30H48O3) Kết hợp phân tích liệu phổ so sánh với tài liệu cho phép kết luận hợp chất AP3 ursolic axít [37, 38] H-NMR (CD3OD); δ (ppm): 5,12 (1H, t, 3,5 Hz, H-12); 3,07 (1H, dd, 11,5, 4,5 Hz, H-3); 2,07 (1H, d, 11,5 Hz, H-18); 1,87 (3H, s, H-27); 0,96 (3H, s, H-23); 0,86 (3H, d, 6,5 Hz, H-30); 0,82 (3H, s, H-25); 0,74 (3H, d, 6,25 Hz, H-29); 0,69 (3H, s, H-26); 0,65 (3H, s, H-24) 13 C-NMR (CD3OD) δ (ppm): 38,5 (C-1); 26,6 (C-2); 78,6 (C-3); 38,7 (C-4); 55,1 (C5); 18,1 (C-6); 32,8 (C-7); 39,3 (C-8); 47,6 (C-9); 36,7 (C-10); 23,3 (C-11); 125,3 (C-12); 138,0 (C-13); 41,9 (C-14); 27,8 (C-15); 24,0 (C-16); 47,6 (C-17); 52,6 (C-18); 39,0 (C-19); 39,0 (C-20); 30,5 (C-21); 36,7 (C-22); 27,8 (C-23); 15,1 (C-24); 15,3 (C-25); 16,6 (C-26); 23,1 (C-27); 180,4 (C-28); 16,7 (C-29); 20,8 (C-30) *) Hợp chất AP4 (quercetin): 5' 4' 6' 3' O HO OH 1' OH 2' OH OH O Quercetin Chất AP4 phân lập từ phân đoạn F4.3 phần dịch chiết EtOAc tinh thể hình kim mầu vàng nhạt Điểm nóng chảy 314-316oC ESI-MS m/z 301 [M-H]- (cơng thức phân tử C15H10O7) Kết hợp phân tích kiện phổ so sánh với tài liệu [39, 40] cho phép kết luận chất AP4 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-on hay gọi quercetin Phổ 1H-NMR (CD3OD); δ (ppm): 7,65 (dd, J = 8, 2Hz, H-6′); 7,75 (d, J = 2Hz, H-2′); 6,90 (d, J = 8Hz, H-5′); 6,40 (d, J = 2Hz, H-8); 6,20 (d, J = 2Hz, H-6) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD); δ (ppm): 148,0 (C-2); 137,2 (C-3); 177,3 (C-4); 162,4 (C-5); 99,2 (C-6); 165,5 (C-7); 94,4 (C-8); 158,2 (C-9); 104,5 (C-10); 124,1 (C-1′); 116,0 (C2′); 146,2 (C-3′); 148,7 (C-4′); 116,2 (C-5′); 121,7 (C-6′) *) Hợp chất AP5 (catechin) 5' 4' 6' HO O OH 3' 1' 2' OH OH OH Catechin Chất AP5 phân lập từ phân đoạn F5 phần dịch chiết EtOAc, dạng chất rắn màu nâu nhạt, điểm nóng chảy 178oC Phổ khối lượng EI-MS cho pic ion m/z 289 [M-H]- tương ứng công thức phân tử C15H14O6 Từ phân tích liệu thu được, so sánh với tài liệu [41,42] xác định hợp chất AP5 flavanol có tên gọi 2R, 3S-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro2H-chromene-3,5,7-triol catechin H-NMR (CDCl3); δ (ppm): 6,64 (dd, J = 8,0Hz, 2Hz, H-6′); 6,74 (d, J = 2Hz , H-2′); 6,67 (d, J = 8,0Hz, H-5′); 5,84 (d, J = 1,5Hz, H-8); 5,81 (d, J =1,5Hz, H-6); 2,8 (dd, J = 16Hz, 6Hz, H-4); 2,4 (dd, J = 16Hz, 6Hz, H-4); 3,9 (ddd, J = 8, 8, 5,5Hz, H-3); 4,4 (d, J = 8Hz, H-2) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD); δ, ppm: 81,2 (C-2); 67,4 (C-3); 27,1 (C-4); 155,6 (C-5); 95,3 (C-6); 155,2 (C-7); 94,5 (C-8); 155,8 (C-9); 99,7 (C-10); 130,2 (C-1′); 114,0 (C-2′); 144,4 (C-3′); 144,6 (C-4′); 115,0 (C-5′); 119,0 (C-6′) *) Hợp chất AP7 (quercitrin) 5' 4' 6' HO O OH 3' 1' 2' OH OH OR O AP7 Quercitrin, R=Rham (Quercetin 3-O--L-rhamnopyranosit) Hợp chất AP7 chất rắn màu vàng, phân lập từ phân đoạn cặn dịch chiết EtOAc điểm nóng chảy 314-316oC Kết phân tích số liệu phổ 1H-và 13C-NMR có so sánh với tài liệu [46, 47, 48] xác định cấu trúc hợp chất AP7 quercitrin (quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosit) H-NMR (CD3OD); δ (ppm): 7,31 (1H, dd, 8Hz, 2Hz, H-6′); 7,34 (1H, d, 2Hz, H-2′); 6,90 (1H, d, 8Hz, H-5′); 6,37 (1H, d, 2Hz, H-8); 6,20 (1H, d, 2Hz, H-6); 5,3 (1H, d, 1Hz, H1-rha), 0,9 (1H, d, 1Hz, H-6-rha) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD); δ (ppm): 158,5 (C-2); 136,20 (C-3); 179,6 (C-4); 163,1 (C-5); 99,8 (C-6); 165,8 (C-7); 91,7 (C-8); 159,3 (C-9); 105,9 (C-10); 122,8 (C-1′); 116,3 (C-2′); 146,3 (C-3′); 149,7 (C-4′); 116,9 (C-5′); 123,0 (C-6′); 103,5 (C-1-rha); 72,0 (C2-rha); 72,1 (C-3-rha); 73,2 (C-4-rha); 71,9 (C-5-rha); 17,6 (C-6-rha) 3.4 Kết khảo sát hoạt tính sinh học cặn dịch chiết từ Long nha thảo: Thử hoạt tính sinh học tiến phịng Thử hoạt tính sinh học -Viện Hóa học Viện khoa học Cơng nghệ Việt Nam Các cặn dịch chiết diclometan (A8), EtOAc (A9), BuOH (A10) cặn tổng (cặn EtOH-A7) tiến hành thử hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính độc tế bào, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định theo phương pháp nêu mục 2.2.4 3.4.1 Hoạt tính chống oxi hóa (antioxidant activity) Sự sản sinh mức gốc tự thể nguyên nhân tổn hại tế bào, sai lệch nhiễm sắc thể, đột biến AND… dẫn đến bệnh tim mạch, suy nhược thần kinh, lão hóa, ung thư hàng loạt bệnh khác Tác dụng chống oxy hóa sản phẩm sinh học có ý nghĩa bao trùm lên việc chữa trị nhiều loại bệnh khác Phép thử xác định hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm kiếm chất có khả bắt trung hòa gốc tự do, làm giảm sản sinh gốc tự gia tăng tốc độ phản ứng phân hủy peroxit… có tác dụng phòng chống ngăn ngừa bệnh tật cho thể Bảng 3: Kết thử hoạt tính chống oxi hóa cặn dịch chiết Stt Tên mẫu A7 (Cặn EtOH) A8 (Cặn CH2Cl2) A9 (cặn EtOAc) A10 (cặn BuOH) Resveratrol EC50 (μg/ml) 82,34 >128 36,17 37,34 8,5 Kết thử nghiệm cho thấy: Chất đối chứng resveratrol thể hoạt tính chống oxy hóa liều EC50 (μg/ml) = 8,5 Các cặn EtOH (A7), EtOAc (A9) cặn BuOH (A10) có hoạt tính chống oxy hóa liều EC50 (μg/ml) : 82,34; 36,17 37,34 Cặn dịch chiết diclometan (A8) hoạt tính chống oxi hóa 3.4.2 Hoạt tính độc tế bào (Cytotoxic activity) Các tế bào ung thư tế bào biệt hóa phân chia nhanh chóng diễn liên tục Chúng có khả vượt qua kiểm soát hệ miễn dịch thể tăng cường xâm lấn vào tổ chức sống lân cận Những chất có khả phòng chống điều trị ung thư chất có khả ngăn ngừa hoạt động bắt giữ tác nhân gây ung thư, ức chế q trình tiến triển bệnh thơng qua ức chế hoạt động số enzyme hay tác động gây biệt hóa tế bào Phép thử sinh học để sàng lọc tìm kiếm hoạt chất chữa trị bệnh ung thư sử dụng tế bào ung thư làm đối tượng nghiên cứu Trong nghiên cứu này, dịch chiết tổng dịch chiết phân đoạn Long nha thảo khảo sát hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư thông qua phép thử gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mô) MCF2 (ung thư vú) Kết cho thấy: - Chất dối chứng dương Elipticin thể hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 0,29 0,51 μg/ml - Cặn dịch chiết tổng (A7) cặn dịch chiết thành phần (A8, A9) có khả gây độc tế bào ung thư biểu mô (KB) với giá trị IC50 41,05; 10,5 38,69 μg/ml tương ứng; khả gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC50 116,21; 31,07 90,53 μg/ml tương ứng Cặn dịch chiết BuOH (A10) có khả gây độc tế bào ung thư biểu mô (KB) với giá trị IC50 20,98 μg/ml khơng có hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) (Xem kết thử hoạt tính bảng 4) Stt Tên mẫu A7 (Cặn EtOH) A8 (Cặn CH2Cl2) A9 (cặn EtOAc) A10 (cặn BuOH) Elipticin Bảng 4: Kết thử hoạt tính độc tế bào IC50 (μg/ml) KB MCF-7 41,05 10,5 38,69 20,98 0,29 116,21 31,07 90,53 >128 0,51 3.4.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity) Nhiễm trùng (infection) biểu thị xâm nhập nhân lên vi sinh vật mô thể, gây rối loạn chế điều hịa, cân nội mơi Nhiễm trùng cấp tính tồn thời gian ngắn, số trường hợp bệnh cấp tính chuyển thành bệnh mãn tính với triệu chứng kéo dài nguyên nhân dẫn đến ung thư Hàng ngày, hàng sinh vật thay đổi cấu trúc tế bào tiếp xúc với chất kháng sinh dẫn đến tượng nhờn thuốc Do việc phát hoạt chất có khả đặc hiệu loại vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mẫu thử thông qua giá trị IC50 (nồng dộ ức chế 50% phát triển vi sinh vật) Kết cho thấy cặn chiết tổng (A7) có hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định gram (+) chủng S aureus B subtilis với giá trị IC50 87,49 90,11 μg/ml, không kháng chủng vi khuẩn gram (-) nấm Cặn dịch chiết diclometan (A8) có hoạt tính tốt, kháng chủng vi khuẩn gram (+) chủng S aureus, B subtilis L fermentum với giá trị IC50 5,05; 2,35 6,55 μg/ml không kháng chủng vi khuẩn gram (-) nấm Cặn dịch chiết A9 A10 khơng có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm (xem bảng 5) St t Tên mẫu Bảng 5: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Nồng độ ức chế 50% phát triển vi sinh vật nấm kiểm định – IC50 ((μg/ml)) Gram (+) Gram (-) Stapyloco ccus aureus Bacillu s subtilis Lactobacill us fermantum Salmonel la enterica Escherich Pseudomon ia as enterica aeruginosa A7 87,49 90,11 > 128 > 128 > 128 > 128 Candi da albica n > 128 A8 A9 A10 5,05 > 128 > 128 2,35 > 128 > 128 6,55 89,04 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 4.1 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu: - Điểm nóng chảy đo máy Mikroskopheiztisch PHMK-50, Germany - Phổ hồng ngoại ghi máy IMPACT-410FT-IR spectrometer (CARL ZEISS JENA) - Phổ khối ion hoá bụi electron (ESI-MS) đ-ợc đo máy LC-MSD-Trap-SL - Ph cng hng t ht nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-135, DEPT90 ghi máy Bruck Avance 500 (Germany) - Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng silica gel 60 F245 (Merk) Sắc ký cột (CC) sử dụng silica gel 60 (Merk, 40-63μm) 4.2 Dung môi hóa chất: - Các dung mơi sử dụng dung môi tinh khiết cất lại: Etanol, n-hexan, diclometan, etylaxetat, metanol butanol - Thuốc dùng sắc ký lớp mỏng dung dịch Ce(SO4)2 dung dịch H2SO4 10% EtOH 4.3 Nguyên liệu thực vật: 4,5 kg mẫu Long nha thảo (A pilosa Ledeb.) thu hái vào tháng Sapa - Lào Cai - Việt Nam Tên nhà thực vật học Nguyễn Kim Đào (Viện sinh thái tài nguyên sinh vật) định tên, tiêu lưu giữ phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viện KH & CNVN 4.4 Chiết xuất phân lập: 4.4.1 Xử lý mẫu phƣơng pháp chiết tách: 4.5 kg mẫu (rễ, thân, lá, cành, hoa quả) Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledbe) làm sạch, phơi khơ thái nhỏ Tiếp mẫu sấy khô nhiệt độ 45oC đem xay nhỏ Nguyên liệu khô dạng bột (1,1 kg) ngâm chiết siêu âm 45 phút với dung môi EtOH 45oC (chiết lần, lần 45 phút) Các dịch chiết gom lại, lọc cất loại dung môi áp suất giảm thu cặn chiết tổng kí hiệu A7 Cặn chiết tổng chiết phân bố với loại dung mơi có độ phân cực tăng dần (diclometan, etylaxetat cuối butanol, loại dung môi chiết lần) Gom phần dịch chiết, cất loại dung môi áp suất giảm nhiệt độ 45oC, thu cặn dịch chiết tương ứng: diclometan (21 g) kí hiệu A8, etylaxetat (16 g) kí hiệu A9 cuối butanol (50 g) kí hiệu A10 (xem sơ đồ mục 3.2) Các cặn phân đoạn dịch chiết tiếp tục sử dụng để phân lập hợp chất Các cặn phân đoạn dịch chiết bước đầu chúng tơi tiến hành thử sơ số hoạt tính sinh học như: hoạt tính độc tế bào, hoạt tính chống oxi hóa hoạt tính kháng sinh 4.4.2 Phân lập hợp chất: Phân lập chất dịch chiết CH2Cl2 Cặn dịch chiết CH2Cl2 (21 g) tách phân đoạn sắc ký cột chân không VLC (vacuum liquid chromatography), chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,04-0,063 mm, dung môi giải hấp aceton/n-hexane (0% -100%) MeOH/CH2Cl2 (0% - 10%) thu phân đoạn (kí hiệu từ F1 - F7) Từ phân đoạn F3 (hệ dung môi n-hexane/aceton) thu chất kết tủa mầu trắng Sau gạn dịch rửa, chất kết tủa kết tinh lại với hệ dung môi n-hexane/acetone thu hợp chất dạng tinh thể hình kim (12 mg) Phân đoạn F5 đưa lên cột sắc ký silica gel cỡ hạt 0,015- 0,043 mm với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH(1:99-9:1) thu chất rắn, tinh chế lại hỗn hợp dung môi CH2Cl2-MeOH hợp chất (15mg) (Xem sơ đồ 2, mục 3.2) Phân lập chất dịch chiết etylaxetat Cặn dịch chiết EtOAc (16g) tách phân đoạn sử dụng sắc ký cột chân không VLC (vacuum liquid chromatography), chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,04-0,063 mm, dung môi giải hấp: aceton/n-hexane (0%-100%) MeOH/CH2Cl2 (0%-40%) thu phân đoạn Từ phân đoạn phân tách tiếp cột sephadex LH-20, dung môi rửa giải MeOH thu phân đoạn từ F3.1-F3.4 Ở phân đoạn F3.2 thu chất rắn màu vàng, kết tinh lại dung môi n-hexan/acetone thu 20mg chất dạng tinh thể (kí hiệu: AP), phân đoạn F3.3 thu chất rắn màu vàng, tinh chế lại dung môi MeOH thu 7mg chất (kí hiệu: AP2) Ở phân đoạn tiếp tục sử dụng sắc ký cột nhanh, chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,0150,043 mm, hệ dung môi rửa giải CH2Cl2-MeOH(1:99-8:2) thu phân đoạn từ F4.1-F 4.5 Ở phân đoạn F4.2 thu chất rắn màu trắng, kết tinh lại dung môi CH2Cl2/MeOH thu mg hợp chất kí hiệu AP3 Phân đoạn F4.3 đưa lên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa MeOH thu chất rắn, tinh chế lại MeOH thu 16 mg chất dạng tinh thể hình kim mầu vàng nhạt (kí hiệu AP4) Từ phân đoạn tiến hành chạy cột sephadex với hệ dung môi rửa MeOH/CH2Cl2 thu 15 mg hợp chất dạng bột mầu nâu nhạt (kí hiệu AP5) Ở phân đoạn 6, thu chất rắn màu vàng, sắc kí mỏng điều chế pha đảo RP-18, dung môi giải hấp MeOH/H2O (6/4) thu 7mg chất (kí hiệu AP7) (Xem sơ đồ 3, mục 3.2) Phân lập cặn dịch chiết butanol Cặn dịch chiết BuOH (50g) đưa qua cột diaion, hệ dung môi rửa H2O/MeOH (100%, 10%, 30%, 50%, 80% 100%) sau acetone 100% Các phân đoạn MeOH 30% (13g), 50% (15g) 80% (5g) cô lại áp suất giảm đến khô kiệt, cặn thu kiểm tra mỏng pha đảo RP-18 thấy nhiều vệt chất rõ ràng, tiếp tục nghiên cứu thành phần chất KẾT LUẬN Lần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.) họ Hoa hồng (Rosaceae) mọc Việt Nam Từ cặn dịch chiết EtOAc phân lập xác định cấu trúc chất sạch, có hợp chất tritecpen hợp chất flavonoit là: ursolic axít (AP3), 3,5,6,7,8,3',4'heptamethoxyflavone (AP), 5,7,3’- trihydroxy - 6, 4’,5’- trimetoxy flavon (AP2), quercetin (AP4), catechin (AP5), quercitrin (AP7) Trong hai hợp chất AP AP2 lần phân lập từ loài Long nha thảo Đã phân lập xác định cấu trúc hai hợp chất ß-sitosterol, ß-sitosterol-3-O-ßD-glucopyranosit từ cặn dịch chiết CH2Cl2 Long nha thảo Cặn dịch chiết tổng (EtOH-A7) cặn dịch chiết phân đoạn (cặn dịch chiết CH2Cl2-A8, cặn dịch chiết EtOAc-A9, cặn dịch chiết BuOH-A10) từ Long nha thảo thử hoạt tính kháng sinh, chống oxi hóa độc tế bào cho kết tốt Cặn dịch chiết EtOAc-A9 thể hoạt tính chống oxi hóa với giá trị EC50 (g/ml) 36,17g/ml; thể hoạt tính độc tế bào dòng thử với giá trị IC50 (μg/ml) 38,69 (dịng ung thư biểu mơKB) 90,53 μg/ml (dòng ung thư vú-MCF7) Đặc biệt, cặn dịch chiết CH2Cl2 kháng chủng vi sinh vật (S aureus, B subtilis L fermentum) với giá trị IC50 (μg/ml) 5,05; 2,35; 6,55 (μg/ml) hoạt tính độc tế bào tốt dòng thử với giá trị IC50 (μg/ml) 10,5 (dòng ung thư biểu mơ-KB) 31,07 (dịng ung thư vú-MCF7) Cặn dịch chiết BuOH-A10 có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị EC50 (g/ml) 37,34g/ml hoạt tính độc tế bào ung thư biểu mô KB với giá trị IC50 (μg/ml) 20,98 Như vậy, kết hợp với kết nghiên cứu giới hoạt tính chất thành phần từ Long nha thảo cho thấy lồi có giá trị dược liệu, cần tiếp tục nghiên cứu sâu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hợp chất Long nha thảo References Tiếng Việt: Võ Văn Chi, Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học Hà nội, 1999, tr.676 Tiếng Anh: Murayama T et al Agrimoniin, an antitumour tannin of Agrimonia pilosa Ledeb., induces interleukin-1 Anticancer Res, 12, 1471-1474 (1992) Ren-Bo An, Hyun-Chul Kim, Gil-Saeng Jeong, Seung-Hwan Oh, Hyuncheol Oh, and Youn-Chul Kim Constituents of the aerial parts of Agrimonia pilosa Natural Product Sciences, 11(4), 196-198 (2005) Zhe-Xiong Jin, Bao-Qing Wang and Zhi-Jie Chen Microwave-assisted extraction of tannins from Chinese herb Agrimonia pilosa Ledeb Journal of Medicinnal plants research, (21), 2229-2234 (2010) 5 Hea Jung Yang, Yune Suk Jung, Ki Suk Kim, Eun- Kyeong Choi, Dong Jin Lim, Kwang Seok Ahn, Hee-Jae Jung, Sung-Ki Jung & Hyeung-Jin Jang Global transcriptome analysis of the E.coli O157 response to Agrimonia pilosa extract Mol Cell Toxicol, 7, 299-310 (2011) Malkil Jung and Moonsoo Park Acetylcholinesterase inhibition by flavonoids from Agrimonia pilosa Molecules, 12, 2130-2139 (2007) Kyoung Jin Nho, Jin Mi Chun, Ho Kyoung Kim Agrimonia pilosa ethanol extract induces apoptotic cell death in HepG2 cells Journal of Ethnopharmacology, 138 (2), 358-363 (2011) Hiroyoshi Kato, Wei Li , Michihiko Koike, Yinghua Wang, Kazuo Koike Phenolic glycosides from Agrimonia pilosa Phytochemistry, 71 (16), 1925-1929 (2010) Isao Kouno, Naosuke Baba, Yumiko Ohni, Nobusuke Kawano Triterpenoids from Agrimonia pilosa Phytochemistry, 27 (1), 297-299 (1988) 10 A.R Bilia, E Palme, A Marsili, L Pistelli, I Morelli A flavonol glycoside from Agrimonia eupatoria Phytochemistry, 32 (4), 1078-1079 (1993) 11 Craig T.M Tomlinson, Lutfun Nahar, Alison Copland,Yashodharan Kumarasamy, Namik F Mir-Babayev, Moira Middleton, Raymond G Reid, Satyajit D Sarker Flavonol glycosides from the seeds of Agrimonia eupatoria (Rosaceae) Biochemical Systematics and Ecology, 31( 4), pp 439–441(2003) 12 Jae-Jin Kim, Jun Jiang, Do-Wan Shim, Sang-Chul Kwon, Tack-Joong Kim, Sang-Kyu Ye, Myong-Ki Kim, Yong-Kook Shin, Sushruta Koppula, Tae-Bong Kang, Dong-Kug Choi, Kwang-Ho Lee Anti-inflammatory and anti-allergic effects of Agrimonia pilosa Ledeb extract on murine cell lines and OVA-induced airway inflammation Journal of Ethonopharmacology, 140 (2), 213-221 (2012) 13 Junsei Taira, Wakana Ohmine, Takayuki Ogi, Hitoshi Nanbu, Katsuhiro Ueda Suppression of nitric oxide production on LPS/IFN-γ-stimulated RAW264.7 macrophages by a novel catechin, pilosanol N, from Agrimonia pilosa Ledeb Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters., 22 (4), 1766-1769 (2012) 14 Junsei Taira, Hitoshi Nanbu, Katsuhiro Ueda Nitric oxide-scavenging compounds in Agrimonia pilosa Ledeb on LPS-induced RAW 264.7 macrophages Food Chemistry., 115 (4), 1221–1227 (2009) 15 Kasai S,Watanabe S,Kawabata J,et al Antimicrobial catechin derivatives of A pilosa Phytochemistry, 31(3):787-789 (1992) 16 Savi L A., Barardi C R., simoes C M Evaluation of antiherpertic activity and genotoxic effects of catechin derivatives J Agric Food Chem., 54(7), 2552-2527 (2006) 17 Li G., Min B S., Zheng C., Lee J., Oh S R., Ahn K S., Lee H K Neuroprotective and free radical scavenging activities of phenonlic compounds from Hovenia dulcis Arch Pharm Res., 28(7), 804-809 (2005) 18 Ono K., Yamada M Antioxidant compounds have potent anti-fibrillo genic ang fibrildestabilizing effects for alpha-synuclein fibrils in vitro J Neurochem., 97(1), 105-115 (2006) 19 M M Adeyemi, D A Adebote, J O Amupitan, A O Oyewale and A S Agbaji Aust, J Basic and App’Sci., 3342-3346 (2010) 20 Kyoung Jin Nho, Jin Mi Chun, Ho Kyoung Kim Agrimonia pilosa ethanol extract induces apoptotic cell death in HepG2 cells Journal of Ethnopharmacology, 138 (2), 358-363 (2011) 21 Seong-Jin Yoon, Eun-Ji Koh, Chang-Soo Kim, Ok-Pyo Zee, Jong-Hwan Kwak, Won-Jin Jeong, Jee-Hyun Kim, Sun-Mee Lee Agrimonia eupatoria protects against chronic ethanol-induced liver injury in rats Food and Chemical Toxicology, 50 (7), 2331-2341 (2012) 22 Frances Watkins, Barbara Pendry, Alberto Sanchez-Medina, Olivia Corcoran Antimicrobial assays of three native British plants used in Anglo-Saxon medicine for wound healing formulations in 10th century England Journal of Ethonopharmacology., 144 (2), 408-415 (2012) 23 Park, C H., Kim S.H., Choi W., Lee, Y J., Kim, J S., Kang, S S., Suh, Y H Novel Antichlolinesterase and antiamnestic activities of dehydrovodiamine, a constituent of Evodia rutaecarpa Planta Med., 62, 405-409 (1996) 24 R Tundis, B Deguin, F Menichini and F Tillequin, Biochem Syst Ecol., 30, 689-691 (2002) 25 Y Kumarasamy, M Fergusson, L Nahar, S.D Sarker Pharm Biol., 40 (4), 307 (2002) 26 T Takao, F Kitatani, N Watanabe, A Yagi, K.A Sakata Biosci Biotech Biochem., 58 (10), 1780 (1994) 27 Park, C H., Kim S.H., Choi W., Lee, Y J., Kim, J S., Kang, S S., Suh, Y H Novel Antichlolinesterase and antiamnestic activities of dehydrovodiamine, a constituent of Evodia rutaecarpa Planta Med., 62, 405-409 (1996) 28 G Ushbayeva, A Kabieva, T Ryakhovskaya, R Mustaphina Study of antitumor activity of phenolic complex of agrimonia asiatica European Journal of Cancer., 35 (4), 295 (1999) 29 H.Y Kuo, M.H Yeh, J Chin Chem Soc., 44, 379-383 (1997) 30 L Voutquenne, C Lavaud, G Massiot, T Sevenet, Hamid A Hadi, Phytochem., 50, 6369 (1999) 31 Dalia Hamdan, Mahmoud Zaki El-Readi , Ahmad Tahrani, Florian Herrmann, Dorothea Kaufmann, Nawal Farrag, Assem El-Shazly, Michael Wink Food Chemistry., 127, 394– 403 (2001) 32 Xiao Wang, Fuwei Li, Hongxia Zhang, Yanling Geng, Jingpeng Yuan, Ting Jiang Journal of Chromatography A., 1090, 188–192 (2005) 33 Yukiko Iwasea, Yuko Takemuraa, Motoharu Ju-ichia,*, Masamichi Yanob, Chihiro Itoc, Hiroshi Furukawac, Teruo Mukainakad, Masashi Kuchided, Harukuni Tokudad, Hoyoku Nishino Cancer Letters., 163 7-9 (2001) 34 Hideyuki Ito, Satomi Onoue, and Takashi Yoshida Isoflavonoids from Belamcanda chinensis Chem Pharm Bull., 49 (9) 1229-1231 (2001) 35 Sabrin R M Ibrahim 1, Gamal A Mohamed and Nawal M Al-Musayeib New Constituents from the Rhizomes of Egyptian Iris germanica L Molecules 17, 2587-2598, (2012) 36 Eckhard Wollenweter, Jan Frederik Stevens, Karin Klimo, Jutta Knauft, Nobert Frank, Clarisa Gehauser Planta Med., 69, 15-20 (2003) 37 R Tundis, B Deguin, F Menichini and F Tillequin, Biochem Syst Ecol., 30, 689-691 (2002) 38 Dae Sik Jang, Jong Min Kim, Ga Young Lee, Joo-Hwan Kim and Jin Sook Kim Ursane-type triterpenoids from the aerial parts of Potentilla discolor Agric Chem Biotechnol 49(2), 48-50 (2006) 39 M M Adeyemi, D A Adebote, J O Amupitan, A O Oyewale and A S Agbaji Aust, J Basic and App’Sci., 3342-3346 (2010) 40 P.K Agrawa Carbon-13 NMR of Flavonoids", Elsevier Science, New York, (1989) 41 M.A Hye, M A Taher, M Y Ali, M U Ali and Shahed Zaman Isolation of (+)catechin from Acacia catechu (Cutch tree) by convernient method J Sci Res I (2), 300305 (2009) 42 Savi L A., Barardi C R., simoes C M Evaluation of antiherpertic activity and genotoxic effects of catechin derivatives J Agric Food Chem., 54(7), 2552-2527 (2006) 43 Li G., Min B S., Zheng C., Lee J., Oh S R., Ahn K S., Lee H K Neuroprotective and free radical scavenging activities of phenonlic compounds from Hovenia dulcis Arch Pharm Res., 28(7), 804-809 (2005) 44 M M Adeyemi, D A Adebote, J O Amupitan, A O Oyewale and A S Agbaji Aust, J Basic and App’Sci., 3342-3346 (2010) 45 Ono K., Yamada M Antioxidant compounds have potent anti-fibrillo genic ang fibrildestabilizing effects for alpha-synuclein fibrils in vitro J Neurochem., 97(1), 105-115 (2006) 46 Kim YK, Kim YS, Choi SU, Ryu SY., Isolation of flavonol rhamnosides from Loranthus tanakae and cytotoxic effect of them on human tumor cell lines Arch Pharm Res 27(1), 44-7 (2004) 47 A P de Almeida, M M F S Miranda , I.C Simoni , M.D Wigg , M.H.C Lagrota, S.S Costa, Flavonol monoglycosides isolated from the antiviral fractions of Persea americana (Lauraceae) leaf infusion Phytotherapy Research, 12 (8), 562 - 567 (1998) 48 Shanmugakumar S.D., Amerjothy S., Balakrishna K and Soo-un Kim, Isolation, characterization and in-vitro evaluation of kaemprol-3-O-a-L-rhamnopyranoside from Pithecellobium dulce benth, against Mycobacterium tuberculosis and its associated secondary infections Phcog Mag., (15), 59-64 (2008)  ... chưa nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các nghiên cứu thành phần hóa học từ... Những nghiên cứu nƣớc ngồi hoạt tính sinh học thực vật chi Agrimonia : Đã có số cơng trình nghiên cứu nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc số loài thực vật thuộc chi Agrimonia Các nghiên cứu hoạt tính. .. Các hợp chất flavonoit Một số nghiên cứu thành phần hóa học số lồi thực vật thuộc chi Agrimonia giới: Khi nghiên cứu thành phần hóa học loài A pilosa Ledeb, nhà nghiên cứu Trung Quốc Nhật Bản