Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và mỡ máu của dịch chiết cây sắn thuyền (syzygium polyanthum (wight) wamp)

Đánh giá tác dụng của một số đoạn dịch chiết từ lá, vỏ cành cây Sắn thuyền đến trọng lượng, một số chỉ số hóa sinh của chuột béo phì, chuột đái tháo đường thực nghiệm mô phỏng type 2.. N

Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và mỡ

máu của dịch chiết cây Sắn thuyền (Syzygium polyanthum (Wight) Wamp)

Ngô Thi ̣ Quỳnh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: GS TS Đỗ Ngọc Liên

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Giới thiệu quy trình chiết, tách các phân đoạn dịch chiết từ lá, vỏ

cành của cây Sắn thuyền qua các dung môi hữu cơ Phân lập một số hợp chất bằng sắc ký bản mỏng, định tính và định lượng một số hợp chất tự nhiên từ lá, vỏ cành của cây Sắn thuyền Thiết kế các mô hình chuột béo phì thực nghiệm, chuột đái tháo đường type 2 Đánh giá tác dụng của một

số đoạn dịch chiết từ lá, vỏ cành cây Sắn thuyền đến trọng lượng, một số chỉ số hóa sinh của chuột béo phì, chuột đái tháo đường thực nghiệm mô phỏng type 2

Keywords: Sinh học; Cây sắn thuyền; Dịch chiết; Hạ đường huyết; Mỡ

máu

Content

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Lý do chọn đề tài

Theo tổ chức Y tế thế giới(WHO) béo phì là tình trạng tích luỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức rối loạn trao đổi chất, tim mạch… ảnh hưởng tới sức khoẻ Tổ chức Quốc tế theo dõi bệnh béo phì (International Obesity Tast Force- IOTF) cho biết bệnh béo phì và các bệnh liên quan đang tăng lên với tốc độ báo động

Bên cạnh các thuốc có nguồn gốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc thảo dược cũng đang được quan tâm và phát triển

Sắn thuyền (Syzygium resinosum Gagnep) là một cây thuốc trong các bài thuốc dân gian với nhiều công dụng.Cho đến nay chưa có tài liệu nào nghiên cứu về khả năng chống béo phì và ĐTĐ của các dịch chiết cây sắn thuyền Chính vì những lý do đó, chúng

tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu "Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và mỡ

máu của dịch chiết cây Sắn thuyền (Sizygium polyanthum (Wight) Wamp) »

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

- Lá và vỏ cành sắn thuyền (Sizygium polyanthum (Wight) Wamp) đã được định tên khoa học bởi TS Võ Văn Chi, Trường Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.[7]

2.1.2 Mẫu động vật

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss (16 ±1,2g) và thức ăn tiêu chuẩn được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương

- Thức ăn giàu lipid được trộn từ nhiều thành phần khác nhau như: ngô, đậu tương, sữa bột nguyên kem, lạc, lòng đỏ trứng…

2.2 Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm

2.3.1 Xử lý mẫu

Lá và vỏ cây Sắn thuyền được thu hái, rửa sạch sau đó thái mỏng và sấy khô ở

1100 C trong 15 phút diệt men Sau sấy ở nhiệt độ 600- 650 C đến khi giòn và nghiền nhỏ rồi tiến hành ngâm với kiệt với ethanol 700 ở nhiệt độ phòng đến khi nhạt màu Hỗn hợp này được lọc qua giấy lọc Whatman No1(Whatman International Ltd., England) Dịch chiết ethanol được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao ethanol, sau đó được chiết lần lượt qua các dung môi có độ phân cực tăng dần(n hexan, chloroform, ethylacetat.) Các dịch chiết làm khan bằng Na2SO4, rồi cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm

2.3.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của lá, vỏ cành sắn thuyền 2.3.2.1 Định tính một số hợp chất tự nhiên trong lá, vỏ cành sắn thuyền

2.3.2.1.1 Định tính flavonoids

Mẫu thử được pha trong Ethanol với một lượng thích hợp, thêm vài giọt HCl đặc

- Phản ứng Shinoda

- Phản ứng với acid sunfuric

- Phản ứng định tính catechin

2.3.2.1.2 Định tính tannins

Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:

- Phản ứng với vanilin

- Phản ứng với gelatin/NaCl

- Phản ứng với acetate chì

2.3.2.1.3 Định tính các polyphenols khác

- Phản ứng với dung dịch kiềm

- Phản ứng với FeCl 3

2.3.2.1.4 Định tính glycoside

Phản ứng Keller-Killian:

2.3.2.1.5 Định tính alkaloid

Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng

- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer

- Phản ứng với thuốc thử Dragendroffỏ

2.3.2.1.6 Định tính cumarin

2.3.2.1.7 Định tính saponin

2.3.2.2.Định lượng hợp chất phenolics tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau[40]

2.3.2.3 Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng

2.3.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và chống béo phì của các phân đoạn dịch chiết từ lá, vỏ cành sắn thuyền

2.3.3.1.Thử độc tính theo đường uống, xác định LD 50 [32]

Xác định LD50 của dịch chiết lá, vỏ cành sắn thuyền theo đường uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm

2.3.3.2 Nghiên cứu tác dụng chống béo phì của các phân đoạn dịch chiết

2.3.3.2.1 Mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 18– 20g) được chia làm nhiều lô, mỗi lô gồm khoảng từ 7 – 9 con

Sau 4 tuần nuôi, tiến hành cân đo trọng lượng và xét nghiệm một số chỉ số hoá sinh như: glucose máu, lipid máu gồm Cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL để xác định mức độ khác nhau của các lô theo hai chế độ ăn.[41]

2.3.3.2.2 Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số hoá sinh trên

mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột sau khi nuôi bằng mô hình gây béo phì thực nghiệm, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm tiếp Chuột béo phì được chia làm 6 lô, mỗi lô gồm khoảng 7 – 9 con, cao của các phân đoạn dịch chiết từ thịt lá, vỏ cành sắn thuyền được hòa vào nước cất rồi cho chuột uống hàng ngày vào buổi sáng:

 Lô1: Chuột bình thường, chỉ cho uống nước muối sinh lý NaCl0,9% (lô đối chứng âm)

 Lô 2: chuột béo phì không điều trị, chỉ cho uống nước muối sinh lý 0,9% NaCl,(lô đối chứng dương)

 Lô 3: chuột béo phì cho uống Metformin (Merk) - một loại thuốc chữa béo phì, tiểu đường type 2 hiện đang bán trên thị trường với liều 500mg/kg thể trọng [3]

 Lô 4: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn ethanol lá(2000mg/kg)

 Lô 5: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn chloroform lá (2000mg/kg)

 Lô 6: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn ethyaxetat lá (2000mg/kg)

 Lô 7: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn ethanol vỏ (2000mg/kg)

 Lô 8: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn chloroform vỏ (2000mg/kg)

 Lô 9: chuột béo phì cho uống cao phân đoạn ethyaxetat vỏ (2000mg/kg)

Thời gian điều trị chuột là 21ngày.Sau 21 ngày cho uống các phân đoạn dịch chiết, chúng tôi tiến hành xác định trọng lượng và lấy máu chuột để phân tích một số chỉ số hoá sinh: Cholesterol, Triglycerid, HDL, LDL và glucose

2.3.3.3 Phương pháp gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm bằng STZ liều thấp

Chuột được nuôi bằng mô hình béo phì thực nghiệm Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16h, tiêm màng bụng streptozotocin gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm nhằm tạo mô hình ĐTĐ type 2 phát triển từ béo phì Sau đó chuột được tiếp nhận thức ăn bình thường Sau một thời gian khoảng vài ngày tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ lá, vỏ cành sắn thuyền [52, 55]

1 Chuột ĐTĐ tpye 2 không điều trị cho uống nước cất

2 Chuột ĐTĐ tpye 2 điều trị bằng Metformin (500mg/kg)

3 Chuột ĐTĐ tpye 2 điều trị bằng phân đoạn ethanol (2000mg/kg)

4 Chuột ĐTĐ tpye 2 điều trị bằng Chlorofrom (2000mg/kg)

5 Chuột ĐTĐ tpye 2 điều trị bằng phân đoạn ethylaxetat(2000mg/kg)

Sau khi cho chuột uống các phân đoạn dịch chiết thì tiến hành đo nồng độ glucose máu của chuột tại các thời điểm 2 giờ, 4 giờ, 8 giờ và 10 giờ Sau đó tiếp tục điều trị cho chuột trong 21ngày

2.3.5 Tiến hành thí nghiệm

Trong quá trình thí nghiệm, các lô chuột đều được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí

nghiệm của Trung tâm Kiểm nghiệm Bắc Giang

2.3.6 Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm

Cho chuột nhịn ăn trước 24 giờ khi lấy mẫu Giết chuột bằng cách cắt đầu nhanh

để thu máu Máu được xác định các chỉ số: Glucose Cholesterol, Triglycerid, HDLC, LDLC, GOT và GPT Đây là những chỉ số đáng tin cậy để đánh giá ảnh hưởng của cao

chiết phân đoạn lá và vỏ cành săn thuyền

2.3.7 Phương pháp xác định một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột trước và sau khi điều trị bằng bằng dịch chiết

2.3.7.1 Phương pháp định lượng glucose máu

2.3.7.2 Phương pháp định lượng Triglycerid

2.3.7.3 Phương pháp định lượng Cholesterol toàn phần trong huyết thanh

2.3.8 Xác suất thống kê toán học xử lí số liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Quy trình chiết, tách các phân đoạn từ lá và vỏ cành sắn thuyền

Qua những quy trình tách chiết trên, chúng tôi thu được các cao phân đoạn với

hiệu suất tách như sau:

Bảng 3.1 Hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ lá và vỏ cành sắn thuyền

Khối lượng (g)

Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)

Khối lượng (g)

Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)

Cao cồn 633.9 21.13 389.54 12.98

Kết quả này cho thấy trong lá và vỏ cành sắn thuyền có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên Phương pháp tách chiết này giúp tách chiết các chất có độ phân cực từ thấp đến cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân lập các hợp chất sau này

3.2 Định tính sơ bộ thành phần phần hóa học của dịch chiết

Bảng 3.2.1.Kết quả thử định tính thành phần các hợp chất tự nhiên

dịch chiết từ lá sắn thuyền

Polyphenol

Flavonoid

Tannin

Alkaloid

Bảng 3.2.2 Kết quả thử định tính thành phần các hợp chất tự nhiên dịch chiết từ vỏ cành sắn thuyền

Ethanol n-hexan Cloroform Etylacetat

Polyphenol

Flavonoid

Tannin

Alkaloid

Từ kết quả của bảng trên, cho thấy các thành phần của lá và vỏ cành sắn thuyền gồm: Flavonoid, cumarin, tannin, alkaloid, glucosid và sapomin.Tuy nhiên, hàm lƣợng alkaloid rất ít (chỉ thấy xuất hiện trong phân đoạn ethanol và n- hexan), flavonid và glucosid lại tập chung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat có độ phân cực trung bình

3.3 Định lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết

Bảng3.3 Hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết

từ lá và vỏ cành sắn thuyền

polyphenol tổng số/1g cao phân đoạn

polyphenol tổng số/1g cao phân đoạn

Tỉ lệ % tính theo cao khô

Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số thể hiện qua bảng 3.3.1,3.3.2 và hình 3.3.1, 3.3.2 cho thấy rằng: Trong cao phân đoạn etylacetat, hàm lượng các chất polyphenol là cao nhất( ở lá là 3,7%, ở vỏ cành là 5,063% lượng cao), trong khi đó hàm lượng polyphenol tổng số của các phân đoạn cao cồn, n-hexan, chlroform tương ứng là 2,272%, 0,082%, 0,1101% (ở lá) và 1,844%, 0,021%, 1,12% (trong vỏ cành)

3.5 Kết quả thử độc tính cấp (LD 50 ) theo đường uống

Qua 72 giờ theo dõi thì với các liều 5000 6000 7000 và 8000 mg/kg thể trọng không có chuột bị chết Liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng (liều tối đa cho phép) cũng không có chuột bị chết Vì vậy, chúng tôi chưa tính được LD50 theo đường uống Điều này cũng cho thấy dịch chiết ethanol,chloroform và etylacetat của lá và vỏ cành sắn thuyền được sử dụng theo đường uống là không gây độc cho chuột

3.6 Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm

3.6.1 Khối lượng chuột trung bình của các lô chuột thí nghiệm

Chuột được lựa chọn là chuột nhắt trắng chủng Swiss do Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp có khối lượng từ 18 – 20 g/con, được phân lô ngẫu nhiên mỗi lô 6 con Lô 1 được nuôi với chế độ ăn bình thường bằng thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh dịch

tễ cung cấp còn các lô còn lại được nuôi bằng chế độ thức ăn giàu chất béo và Cholesterol như đã trình bày trong phương pháp nghiên cứu Sau 38 ngày nuôi chúng tôi tiến hành xác định khối lượng trung bình của các lô chuột thí ngiệm và thu được kết quả như sau:

Bảng 3.6.1 Khối lượng trung bình của các lô chuột ban đầu và sau 38 ngày nuôi theo mô hình gây béo thực nghiệm

đầu (g)

Sau 38 ngày (g)

tăng (%)

% tăng so với đối chứng

Lô nuôi thường

 42,9 %

Lô nuôi béo

Từ bảng 3.6.1 cho thấy chuột nuôi theo chế độ giàu lipid có độ tăng trọng cao hơn nhiều so với chuột nuôi bằng thức ăn chuẩn (của Viện VSDTTW).Cụ thể ở lô nuôi bằng thức ăn chuẩn trọng lượng của chuột tăng từ 18,8 lên 31,5 gam (tăng 67,6%) trong khi đó các lô nuôi bằng thức ăn với hàm lượng lipid cao thì trọng lượng các con chuột đều tăng mạnh hơn so với ngày đầu thí nghiệm là 26,0 g (tăng 136,8 %) Như vậy, chuột nuôi với chế độ ăn béo có khối lượng có thể lớn hơn chuột nuôi thường là 13.5 g tương đương tăng 42,9 % so với chuột ăn thức ăn chuẩn cùng thời điểm (mức ý nghĩa 0,001) Như vậy, có thể kết luận chuột được nuôi với bằng thức ăn giàu lipid đã béo phì về khối lượng Kết quả này phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu thực nghiệm trên chuột của các tác giả trong nước và ngoài nước

3.6.2 Một số chỉ số hóa sinh của các lô chuột sau 38 ngày nuôi

Bảng 3.6.2 Một số chỉ số hóa sinh của các lô chuột sau 38 ngày nuôi

(p < 0,05)

Kết quả trên cho thấy ở các lô chuột ăn thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng lipid cao đều có chỉ số lipid máu cao hơn hẳn lô chuột ăn thức ăn bình thường Cụ thể là nồng độ cholestron máu tăng 65,53 % triglycerid máu tăng 101,61 % HDLC giảm 43,89 % LDLC tăng 89,13 % và đặc biệt glucose máu tăng 41,17 %

3.7 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lá và vỏ cành sắn thuyền lên chuột béo phì thực nghiệm

3.7.1 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lá và vỏ cành sắn thuyền lên khối lượng cơ thể chuột

Với kết quả xây dựng thành công mô hình gây béo phì rối loạn trao đổi lipid-glucid ở chuột, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tác dụng của các cao phân đoạn dịch chiết

từ lá và vỏ cành sắn thuyền đến trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh ở chuột bằng cách cho chuột uống cao các phân đoạn dịch chiết với liều 2000mg/kg thể trọng vào buổi sáng, chiều hàng ngày Quá trình điều trị đựơc thực hiện trong vòng 21 ngày và trong thời gian này chuột béo phì và chuột bình thường đều được cung cấp thức ăn chuẩn và nước uống bình thường

Bảng 3.7.1.1 Khối lượng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết lá sắn thuyền

Sau 21 ngày điều trị ta thấy lô đối chứng và lô béo phì không điều trị chỉ cho uống nước không cho uống dịch chiết thì trọng lượng cơ thể vẫn tiếp tục tăng đặc biệt là lô béo phì tăng 20,63% Từ kết quả thu được cho thấy rằng trong phân đoạn ethylacetat có chứa những hoạt chất cókhả năng làm giảm trọng lượng của chuột béo phì thực nghiệm khá rõ ràng sau 21 ngày điều trị

Bảng 3.7.1.2 Khối lượng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng

các phân đoạn dịch chiết vỏ cành sắn thuyền

Lô béo + cao EtOAc 45,8 ± 1,4 39,2 ± 0,7  14,41

Kết quả trên cho thấy, các cao phân đoạn dịch chiết vỏ sắn thuyền có tác dụng làm giảm trọng lƣợng cơ thể của chuột cao hơn hẳn so với các cao phân đoạn dịch chiết từ lá Hơn nữa,khi điều trị bằng cao phân đoạn etylacetat , thì trọng lƣợng của chuột giảm đi nhiều hơn khi dùng với meformin

3.7.2 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lá và vỏ cành sắn thuyền lên

Nồng độ glucose (mmol/l) máu chuột béo phì sau điều trị

Kết quả phân tích chỉ số glucose huyết đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.2.1 và hình 3.7.2.1

Bảng 3.7.2.1.Chỉ số glucose huyết của các lô chuột trước và sau

21 ngày điều trị bằng lá sắn thuyền

Bảng 3.7.2.2 Chỉ số glucose huyết của các lô chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng vỏ cành sắn thuyền