Nghiên cứu phương pháp xác định các axit béo trong một số loại dầu mỡ động, thực vật việt nam bằng kỹ thuật sắc ký

Ứng dụng phương pháp nghiên cứu xác định các axit béo trong 8 mẫu dầu mỡ động thực vật thông dụng của Việt Nam gồm: mỡ cá basa, mỡ lợn, dầu mè, dầu đậu nành, dầu lạc, dầu dừa, dầu hạt ca

Nghiên cứu phương pháp xác định các axit béo trong một số loại dầu mỡ động, thực vật

Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký

Võ Thị Việt Dung

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận án TS ngành: Hóa phân tích; Mã số: 62 44 29 01 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, PGS TS Lưu Văn Bôi

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm - xây dựng mô hình

hồi quy bậc hai tâm trực giao để tìm điều kiện tối ưu cho quá trình xác định các axit béo trong dầu mỡ động thực vật Kết quả nghiên cứu đã thu được tối ưu hơn nhiều

so với các nghiên cứu phân tích axit béo trước đây Đã sử dụng các kỹ thuật sắc ký hiện đại: sắc ký khí ion hóa ngọn lửa (GC/FID) và sắc ký lỏng siêu nhanh (UFLC)

để phân tích đồng thời 37 metyl este axit béo trong hỗn hợp Các nghiên cứu được tiến hành một cách có hệ thống từ khảo sát đơn lẻ đến mô hình hóa các yếu tố có ảnh hưởng tương hỗ Quá trình xử lý thống kê và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp nghiên cứu được tiến hành đầy đủ, đáp ứng yêu cầu khi xây dựng phương pháp phân tích Ứng dụng phương pháp nghiên cứu xác định các axit béo trong 8 mẫu dầu

mỡ động thực vật thông dụng của Việt Nam gồm: mỡ cá basa, mỡ lợn, dầu mè, dầu đậu nành, dầu lạc, dầu dừa, dầu hạt cao su và dầu hạt jatropha Phân tích đề xuất có khả năng xây dụng thành phương pháp tiêu chuẩn để xác định thành phần các axit béo trong dầu mỡ động thực vật, phục vụ nghiên cứu về dinh dưỡng, kiểm nghiệm

thực phẩm, chế tạo nhiên liệu sinh học và các nghiên cứu khác

Keywords Hóa phân tích; Axit béo; Kỹ thuật sắc ký; Dầu động vật; Dầu thực vật

Content

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Dầu mỡ động, thực vật (DMĐTV) đóng vai trò to lớn trong việc cung cấp dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể sống dưới dạng thức ăn, thực phẩm chức năng, làm nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc, nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học (biodiesel), …

Dưới dạng thực phẩm thiết yếu, nếu sử dụng và tiêu thụ DMĐTV đúng cách, đúng hàm lượng chất béo sẽ cân bằng được dinh dưỡng và kiểm soát bệnh tật Với các loại DMĐTV có hàm lượng dinh dưỡng thấp, dầu mỡ thải hoặc đã qua sử dụng, DMĐTV không ăn được như dầu hạt jatropha, hạt cao su, thầu dầu, tảo,… có thể sử dụng để làm nguyên liệu sản xuất biodiesel Đây được xem là nguồn năng lượng thay thế đầy tiềm năng

Trên cả hai phương diện là thực phẩm dinh dưỡng và nhiên liệu sinh học thì tại Việt Nam hiện chưa có cơ sở dữ liệu đầy đủ về hàm lượng các axit béo trong dầu mỡ động, thực

vật Các quy trình phân tích đã công bố và áp dụng chủ yếu từ tài liệu tham khảo của nước ngoài Các số liệu phân tích hàm lượng axit béo không đầy đủ, nên khó so sánh đánh giá toàn diện nguồn cung cấp axit béo cho nhu cầu làm thực phẩm hoặc cho nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học

Vì vậy đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác định các axit béo trong một số loại dầu mỡ

động, thực vật Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký” sẽ giúp cho việc hoàn thiện quy trình phân

tích axit béo, đáp ứng được yêu cầu phân tích cho các phòng thí nghiệm đầu ngành tại Việt Nam

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu tương đối toàn diện các vấn đề liên quan đến quá trình tách và xác định đồng thời các axit béo trong hỗn hợp, quá trình chuyển đổi DMĐTV thành metyl este axit béo (FAME) làm cơ sở khoa học để tách và xác định các axit béo trong 8 mẫu DMĐTV Việt Nam Từ đó xây dựng phương pháp tiêu chuẩn xác định hàm lượng các axit béo trong DMĐTV ở nước ta

Do đó nội dung của luận án gồm:

- Xây dựng mô hình thí nghiệm bậc hai tâm trực giao xét ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến khả năng tách và xác định các FAME bằng phương pháp sắc ký khí

- Dựa trên mô hình thí nghiệm ở trên tối ưu hóa và đánh giá ảnh hưởng các nhân tố khảo sát đến việc tách và xác định các FAME bằng phương pháp sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa (GC/FID)

- Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng siêu nhanh (UFLC) nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu và đánh giá ảnh hưởng đồng thời các nhân tố khảo sát đến hiệu suất quá trình chuyển đổi este dầu mỡ

- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp nghiên cứu

- Ứng dụng phương pháp nghiên cứu xác định các axit béo trong 8 mẫu DMĐTV Việt Nam

3 Những điểm mới về khoa học của luận án

3.1 Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm theo mô hình thí nghiệm bậc hai tâm trực giao nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời các yếu tố như tốc độ pha động, nhiệt độ ban đầu của cột tách, tốc độ tăng nhiệt, tỉ lệ bơm chia dòng đến khả năng tách và xác định các FAME bằng phương pháp sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa

- Lần đầu tiên xây dựng mô hình thí nghiệm bậc hai tâm trực giao xét ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến hiệu suất quá trình chuyển đổi este DMĐTV như tỉ lệ mol metanol/dầu

mỡ, hàm lượng chất xúc tác (axit hoặc kiềm), nhiệt độ, thời gian và môi trường phản ứng nhằm đạt hiêu suất chuyển đổi tối ưu ( 100%)

3.2 Dựa trên các điều kiện tối ưu hóa ở trên lần đầu tiên đã tách và xác định đồng thời

37 FAME trong hỗn hợp với độ lặp lại tốt, làm cơ sở để tiến hành xác định các axit béo trong DMĐTV

3.3 Đã tiến hành nghiên cứu một cách có hệ thống các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách, xác định các axit béo trong DMĐTV bằng phương pháp sắc ký khí Kết quả phân tích các axit béo đã xử lý thống kê, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp, đáp ứng yêu cầu khi xây dựng phương pháp phân tích

3.4 Lần đầu tiên đã tiến hành phân tích đồng thời các axit béo trong 8 mẫu DMĐTV Việt Nam: mỡ cá basa, mỡ lợn, dầu mè, dầu đậu nành, dầu lạc, dầu dừa, dầu hạt cao su và dầu hạt jatropha

3.5 Phương pháp phân tích đề xuất có khả năng xây dựng thành phương pháp tiêu chuẩn xác định thành phần axit béo trong DMĐTV Việt Nam

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 151 trang với 42 bảng số liệu, 37 hình vẽ, 178 tài liệu tham khảo và 11 phần phụ lục được chia thành các phần như sau: mở đầu: 2 trang, chương 1 tổng quan tài

liệu: 31 trang, chương 2 thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu: 23 trang, chương 3 kết quả và thảo luận: 74 trang, kết luận và kiến nghị: 2 trang, tài liệu tham khảo: 18 trang

Chương 1 TỔNG QUAN

Chương này tổng hợp lý thuyết về chất béo và axit béo, các công trình nghiên cứu ở Việt Nam và nước ngoài về các phương pháp định lượng chất béo và axit béo, các phương pháp điều chế và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều chế FAME, phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu tách và xác định các axit béo

Chương 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị thí nghiệm

Nguyên liệu DMĐTV được lựa chọn để nghiên cứu gồm: Mỡ cá basa An Giang do Công

ty cổ phần xuất nhập khẩu thủy sản An Giang (Agifish) cung cấp, mỡ lợn từ các chợ Hà Nội, được nấu chảy thành dạng dầu, dầu đậu nành, dầu mè, dầu lạc, dầu dừa từ Hợp tác xã Nông nghiệp Quảng Ngãi, dầu được ép từ hạt đậu nành, hạt mè, hạt lạc và cơm dừa Quảng Ngãi, dầu hạt cao su và dầu hạt jatropha từ công ty Sản xuất – Xuất nhập khẩu Bình Dương, dầu được ép từ hạt cao su và hạt jatropha Đăk Nông

Chất chuẩn và nội chuẩn của Sigma (Mỹ), dung môi loại phân tích của Merck (Đức), các hóa chất khác: CH3OH công nghiệp 90% (Malaysia), KOH 82%, NaOH 96%, H2SO496% (Trung Quốc),…

Thiết bị sắc ký lỏng siêu nhanh UFLC của Shimadzu (Nhật) với detector chỉ số khúc xạ RID–10A, máy sắc ký lỏng: LC–20AD, degasser: DGU–20A3, lò cột: CTO–20A, cột sắc ký: Cadenzal CD–C18 (250 mm × 4,6 mm ID × 3 μm) của Imtakt (Mỹ); thiết bị sắc ký khí Shimadzu GC–2010 (Kyoto, Nhật) với detector FID, cột mao quản phân cực mạnh SPTM-

2560 (100 m × 0,25 mm × 0,2 m) và cột mao quản ít phân cực Equity-5 (30 m × 0,25 mm × 0,25 m) của Supelco (Mỹ), máy khuấy từ gia nhiệt Velp 1200 rmp (Italia), lò vi sóng Sanyo 1200W (Nhật), bơm chân không IKA (Đức), máy rung siêu âm Telsonic 750W (Thụy Sỹ),

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách và xác định các FAME

Sử dụng sắc ký khí với detector FID, cột mao quản phân cực mạnh SPTM-2560 (100 m × 0,25 mm × 0,25 m) có thành phần 100% poly(xyanoisopropyl siloxan), khí mang Heli, dung môi diclometan, nội chuẩn n-hexadecan

2.2.2 Xác định hàm lượng axit béo tự do trong dầu mỡ

Sử dụng phương pháp chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,01M, chỉ thị phenolphatalein

2.2.3 Chuyển đổi este dầu mỡ động thực vật

Sử dụng phản ứng transeste hóa DMĐTV với metanol xúc tác kiềm và phản ứng este hóa DMĐTV với metanol xúc tác axit

2.2.4 Xác định mức độ chuyển đổi este

Sử dụng sắc ký lỏng siêu nhanh với cột sắc ký Cadenzal CD–C18 (250 mm × 4,6 mm ×

3 μm), detector: RID–10A, nhiệt độ lò cột: 350 C, pha động: Ace/ACN (7/3; v/v), tốc độ: 0,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 25µl

2.2.5 Thu thập mẫu phân tích

Sử dụng phương pháp lấy mẫu DMĐTV theo TCVN 2625:2005 (hay ISO 05555:2001)

2.2.6 Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình tách và xác định các axit béo

Sử dụng phương pháp mặt mục tiêu theo mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao với sự

hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0

2.2.7 Đánh giá thống kê phương pháp phân tích

Thông qua việc xây dựng đường chuẩn, tính sai số, độ nhạy, độ lặp lại, độ đúng, hiệu suất thu hồi và so sánh kết quả phân tích với kết quả kiểm nghiệm Vilas (ISO 17025:2005)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện GC/FID xác định các FAME

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện GC/FID theo phương pháp đơn biến

Trước hết chúng tôi khảo sát, so sánh khả năng tách các FAME (độ phân giải R) và độ lặp lại (độ lệch chuẩn tương đối RSD%) về tỉ lệ diện tích pic các FAME/IS để lựa chọn loại cột tách (cột mao quản phân cực mạnh SPTM-2560) và loại khí mang (khí He) cố định dùng cho GC/FID do trong quá trình phân tích việc thay đổi hai nhân tố này gặp nhiều khó khăn

Độ nhạy, độ ổn định (độ lặp lại) của hệ thống phân tích thay đổi đáng kể khi thay đổi hai yếu

tố này Sau đó chúng tôi tiếp tục khảo sát xác định khoảng biến thiên các điều kiện phân tích của GC/FID để tối ưu hóa các điều kiện này nhằm tách tốt các FAME Kết quả khảo sát đơn biến tìm khoảng biến thiên các điều kiện phân tích GC/FID thu được như sau:

- Tốc độ pha động (tốc độ khí mang) He: 18 – 25 cm/s

- Tốc độ tăng nhiệt của cột tách: 2 – 40C/phút

- Nhiệt độ ban đầu của cột tách: 60 – 1400C

- Tỉ lệ bơm chia dòng: 10:1 – 200:1

3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện GC/FID theo phương pháp đa biến

3.1.2.1 Xây dựng mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao

Sử dụng mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao để xây dựng phương trình hồi quy (PTHQ) và đánh giá ảnh hưởng đồng thời của 4 nhân tố khảo sát: tốc độ pha động, X1; nhiệt

độ ban đầu của cột tách, X2; tốc độ tăng nhiệt của cột tách, X3; tỉ lệ bơm chia dòng, X4 đến khả năng tách (độ phân giải R) các FAME, y1 và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS, y2 Kết quả thực nghiệm được trình bày trên bảng 3.2

Quan hệ giữa hàm mục tiêu và các nhân tố khảo sát được mô tả theo phương trình bậc hai: y = b0x0 + b1x1 + + b12x1x2 + b13x1x3 + + b11(x12 – ) + b22(x22 – ) +… Với tham số hồi quy  và cánh tay đòn sao d được tính sẵn cho mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao khi

n = 4 là:  = 0,8000, d = 1,4142

Bảng 3.2 Kết quả thực nghiệm tìm điều kiện GC/FID tách và xác định các FAME theo mô

hình hồi quy bậc hai tâm trực giao

9 1,76

2 1 -1 -1 -1 25 60 2 10 0,6 1,88

2 1,75

1 1,79

3 1,69

9 -1 -1 -1 1 18 60 2 200 0,6 3,85

2

7 3,92

9 3,82

4 3,88

7 3,84

18 1,4142 0 0 0 26,4 100 3 105 0,1

5 3,18

-1,4142 0 0 21,5 43,4 3 105

0,6

8 3,2

20 0 1,4142 0 0 21,5 156,6 3 105 0,9

9 3,23

-1,4142 0 21,5 100 1,6 105

0,6

6 3,16

251 0 0 0 0 21,5 100 3 105 0,9

6 3,24

252 0 0 0 0 21,5 100 3 105 0,9

6 3,19

253 0 0 0 0 21,5 100 3 105 0,9

7 3,23

Ở đây, cần tiến hành N = 27 thí nghiệm để xác định các hệ số trong PTHQ Thí nghiệm thứ 25 là thí nghiệm ở tâm được tiến hành 3 lần Phương sai của các thí nghiệm được xác định theo thí nghiệm bổ sung ở tâm là 2

t < t(0,05)(2) = 4,3 Kết quả được chỉ ra trên bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phân tích ảnh hưởng của các nhân tố khảo sát đến khả năng tách các

FAME (I) và độ lệch chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tich pic FAME/IS (II) của GC/FID theo

mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao

Độ tin cậy (±)

b0 0,95 3,24 1,42.10-168,01.10

19

-8,0.107 3,6.109 0,03 0,06

x1 -0,22 0,01 3,89.10-13 0,30 3,7.105 0,018 0,01 0,03

x2 0,12 -0,02 2,84.10-10 0,17 7,0.103 0,049 0,01 0,03

x3 -0,21 6,00.10 -4 6,10.10-13 0,96 2,7.105 6,1.10-4 0,01 0,03

x4 0,01 1,04 0,12 1,45.10

16

R 0,9983 RSDI =0,025

P =0,95

2 II

R 0,9984 RSDII=0,053

*Ghi chú: Những hệ số in nghiêng, đậm là hệ số không có ý nghĩa trong PTHQ

Những kết quả thu được ở bảng 3.3 cho thấy có ảnh hưởng bậc nhất tới khả năng tách các FAME y1 là tốc độ pha động x1 (tiêu cực), nhiệt độ ban đầu x2 (tích cực) và tốc độ tăng nhiệt của cột tách x3 (tiêu cực), còn tỉ lệ bơm chia dòng x4 thì ảnh hưởng không đáng kể Ngược lại tỉ lệ bơm chia dòng lại là nhân tố bậc nhất ảnh hưởng chủ yếu (tích cực) đến độ lệch chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS y2, ba nhân tố còn lại thì ít ảnh hưởng Khả năng tách các FAME chịu ảnh hưởng tiêu cực ở bậc hai của cả bốn nhân tố khảo sát và ảnh hưởng đồng thời của tốc độ pha động và nhiệt độ ban đầu của cột tách, x1x2 (tiêu cực), tốc độ pha động và tốc độ tăng nhiệt của cột tách, x1x3 (tích cực) Trong khi đó độ lệch chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS chỉ chịu ảnh hưởng bậc hai của tỉ lệ bơm chia dòng, x42 (tiêu cực), ảnh hưởng bậc hai và ảnh hưởng đồng thời của các nhân tố khác là không đáng kể

Từ kết quả thu được trên bảng 3.3, sau khi loại những nhân tố không phù hợp, có thể viết được PTHQ dạng mã hóa mô tả sự phụ thuộc của y1, y2 vào các nhân tố xi như sau:

S

4 5

S

3 4

1,33.10

1,91 7.10



  < Fbảng = F0,95(23, 2) = 19,45

Fmô hình < Fbảng : mô hình thống kê mô tả đúng thực nghiệm

Do đó mô hình toán học mô tả quan hệ giữa khả năng tách các FAME và độ lệch chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS vào các biến thực như sau:

Y1 = -8,67 + 0,76X1 + 0,03X2 + 0,99X3 + 0,01.10-1X4 – 0,75.10-3X1X2 + 0,03X1X3 – 0,02X12 – 0,33.10-4X22 – 0,31X32 – 0,05.10-4X42 (3.3)

Hai PTHQ ở trên phản ánh khá chính xác mô hình thực nghiệm, điều này được khẳng định qua các giá trị độ lệch chuẩn R2

của mô hình (bảng 3.3) Mô hình có thể dự đoán khả năng tách các FAME và độ lệch chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS với độ chính xác cao, tương ứng là 99,83% và 99,84%, giữa giá trị thu được từ mô hình dự đoán và giá trị thực nghiệm chỉ có một sự sai khác nhỏ

3.1.2.2 Xác định điều kiện tối ưu của GC/FID

Dựa trên mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao xây dựng được khi thực nghiệm khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các nhân tố của GC/FID đến khả năng tách các FAME và độ lệch chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS để xác định điều kiện tối ưu Bằng cách lấy đạo hàm của hàm hồi quy theo từng biến và cho bằng 0 để tìm ra cực trị của hàm (thông qua

phần mềm Modde 5.0) tìm được điều kiện tối ưu để tách và xác định các FAME như sau: tốc

độ khí mang He: 20,5 cm/s; tốc độ tăng nhiệt của cột tách: 2,4 0

C/phút; nhiệt độ ban đầu của cột tách: 140 0 C; tỉ lệ bơm chia dòng: 30:1 Ở điều kiện tối ưu trên, khả năng tách các FAME

và độ lệch chuẩn tương đối của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS có giá trị dự đoán theo mô hình tối ưu hóa lần lượt là 1,08 và 2,11% Các giá trị trung bình tương ứng thu được khi tiến hành thực nghiệm 3 lần với chất chuẩn FAME 20–40–60 ppm là 1,08 và 2,12%

Giá trị các phương sai thực nghiệm theo điều kiện tối ưu thu được:

I

2 tu

S = 6,43.10-5,

II

2 tu

5,33.10-4 và của mô hình tương ứng là:

I

2 0

S = 7,43.10-5,

II

2 0

S = 7,00.10-4 Có Ftính I = 7,43.10

-5

/6,43.10-5 = 1,16; Ftính II = 7,00.10-4/5,33.10-4 = 1,31 < Fbảng (0,95; 2; 2) = 19 Như vậy độ chính xác của các số liệu theo mô hình và theo thực nghiệm ở điều kiện tối ưu là giống nhau Kết quả này cho thấy mô hình dự đoán có độ chính xác cao, đảm bảo độ tin cậy Đây là một công cụ hữu ích trong việc tiên đoán kết quả cũng như tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm

3.2 Nghiên cứu chuyển đổi DMĐTV thành FAME

3.2.1 Kiểm tra hàm lượng axit béo tự do, lựa chọn quy trình chuyển đổi

Hàm lượng axit béo tự do (%FFA) có ảnh hưởng đến quy trình chuyển đổi DMĐTV thành FAME Các phản ứng chuyển đổi este dùng xúc tác kiềm cần có nguyên liệu đầu với hàm lượng FFA < 2,5% Nếu hàm lượng FFA > 2,5% thì cần sử dụng nhiều kiềm hơn để trung hòa FFA, đồng thời sản phẩm tạo ra xà phòng và nước nhiều hơn Xà phòng sinh ra làm tăng độ nhớt của hỗn hợp, tạo thành nhũ và làm cho việc tách glyxerin trở nên khó khăn Phản ứng sinh ra nhiều nước có thể làm cho metyl este bị thủy phân tạo ra axit béo và metanol, do vậy tiêu tốn nhiều xúc tác hơn và hiệu suất phản ứng bị giảm đi đáng kể Do đó với dầu mỡ có hàm lượng FFA > 2,5% cần chuyển đổi qua hai giai đoạn, giai đoạn đầu thực hiện phản ứng este hóa xúc tác axit để chuyển axit béo tự do thành FAME sau đó tiếp tục giai đoạn hai với phản ứng transeste hóa dầu mỡ sử dụng xúc tác kiềm Vì vậy trước hết chúng tôi chuẩn độ kiểm tra hàm lượng axit béo tự do của nguyên liệu DMĐTV để lựa chọn quy trình chuyển đổi DMĐTV thành FAME thích hợp

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng FFA trong mỡ cá basa: 1,26%; mỡ lợn: 0,45%; dầu đậu nành: 0,21%; dầu mè: 1,68%; dầu lạc: 0,33% và dầu dừa: 0,21% Các mẫu dầu mỡ này đều có hàm lượng FFA < 2,5%, hoàn toàn thích hợp tiến hành chuyển đổi thành FAME bằng phương pháp metyl este hóa xúc tác kiềm một giai đoạn Riêng dầu hạt cao su và dầu hạt jatropha có hàm lượng FFA rất lớn, tương ứng 46,19% và 21,01%, phải tiến hành chuyển đổi qua hai giai đoạn, giai đoạn đầu este hóa với xúc tác axit, giai đoạn hai chuyển vị este với xúc tác kiềm

3.2.2 Điều kiện chuyển đổi este theo phương pháp đơn biến

Qua khảo sát đơn biến các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng chuyển đổi este giữa mỡ cá basa và metanol sử dụng xúc tác kiềm và có mặt của dung môi chúng tôi thu được

khoảng biến thiên các điều kiện phản ứng như sau:

+ Tỉ lệ mol metanol/mỡ cá (X1, mol/mol)): 4/1 – 7/1;

+ Nồng độ xúc tác KOH (X2, % m/m): 0,75 – 1,25%;

+ Nhiệt độ phản ứng (X3, 0C): 30 – 600C;

+ Thời gian phản ứng (X4, phút): 10 – 40 phút.;

+ Hàm lượng dung môi axeton (X5, % m/m): 10 – 30%

Kết quả khảo sát đơn biến các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng este hóa xúc tác axit (giai đoạn 1) của quá trình chuyển đổi 2 giai đoạn điều chế FAME từ dầu hạt cao su thu được khoảng biến thiên các nhân tố như sau (tất cả các phản ứng đều thực hiện ở nhiệt độ sôi của hỗn hợp,  600

C):

+ Tỉ lệ mol metanol/dầu (X1, mol/mol): 3/1 – 9/1

+ Hàm lượng xúc tác H2SO4 (X2, % m/m): 0,5 – 2%

+ Thời gian phản ứng (X3, giờ): 1 – 6 giờ

+ Hàm lượng dung môi axeton (X4, % m/m): 10 – 50%

3.2.3 Điều kiện chuyển đổi este theo phương pháp đa biến

* Xây dựng mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao

Tương tự như quá trình thực nghiệm tối ưu hóa các điều kiện GC/FID để tách và xác định các FAME, với quá trình chuyển đổi DMĐTV, qua mô hình hồi quy bậc hai tâm trực giao, chúng tôi thu được các PTHQ dạng mã hóa sau khi loại bỏ các nhân tố ảnh hưởng không đáng kể như sau:

- Hiệu suất phản ứng este hóa xúc tác kiềm điều chế FAME từ mỡ cá basa ( = 0,7698):

y1 = 94,06 + 5,88x1 + 1,53x2 + 2,18x3 + 4,46x4 + 0,99x5 – 0,80x1x2 – 0,77x1x3 – 0,71x1x4– 4,76x42 + 0,96x52 (3.5)

- Hiệu suất phản ứng este hóa xúc tác axit (giai đoạn 1) của quá trình chuyển đổi hai giai đoạn điều chế FAME từ dầu hạt cao su ( = 0,8000):

y2 = 105,36 + 9,24x1 + 3,61x2 + 3x3 + 2,08x4 – 1,18x1x2 – 1,04x1x4 – 1,47x2x3 – 11,08x12– 3,2x42 (3.6)

Biến đổi

o

i i

X X



 để đưa phương trình (3.5) và (3.6) về dạng thực tương ứng là :

Y1 = 38,41 + 7,18X1 + 7,88X2 + 0,30X3 + 1,60X4 – 0,28X5 – 1,07X1X2 – 0,03X1X3 – 0,04X1X4 – 0,03X42 + 0,01X52 (3.7)

Y2 = – 20,39 + 17,71X1 + 4,43X2 + 2,18X3 + 0,68X4 – 0,52X1X2 – 0,02X1X4 – 0,78X2X3 – 1,23X12 – 0,01X42 (3.8)

Kết quả phân tích cho thấy có ảnh hưởng tích cực nhất ở bậc 1 đến hiệu suất phản ứng chuyển đổi mỡ cá basa thành FAME là tỉ lệ mol metanol/mỡ cá (x1), tiếp đến là thời gian phản ứng (x4), nhiệt độ phản ứng (x3), hàm lượng xúc tác (x2) và hàm lượng dung môi (x5) ít ảnh hưởng nhất Ảnh hưởng tiêu cực nhất ở bậc hai đến hiệu suất phản ứng là nhân tố thời gian (x42) Ảnh hưởng bậc hai của tỉ lệ mol metanol/mỡ cá (x12), hàm lượng xúc tác (x22), nhiệt độ phản ứng (x32) và ảnh hưởng đồng thời của tỉ lệ mol metanol/mỡ cá và hàm lượng dung môi (x1x5), hàm lượng xúc tác và nhiệt độ phản ứng (x2x3), hàm lượng xúc tác và thời gian phản ứng (x2x4), hàm lượng xúc tác và hàm lượng dung môi (x2x5), nhiệt độ phản ứng và thời gian phản ứng (x3x4), nhiệt độ phản ứng và hàm lượng dung môi (x3x5), thời gian phản ứng và hàm lượng dung môi (x4x5) đến hiệu suất phản ứng là không đáng kể Sự tăng đồng thời của tỉ lệ mol metanol/mỡ cá với hàm lượng xúc tác (x1x2), với nhiệt độ phản ứng (x1x3)

và với thời gian phản ứng (x1x4) đều làm giảm hiệu suất phản ứng (ảnh hưởng tiêu cực) Kết quả này được thể hiện trên hình 3.14

Hình 3.14 Ảnh hưởng của các nhân tố khảo sát đến hiệu suất phản ứng chuyển đổi este xúc

tác kiềm mỡ cá basa

Đối với quá trình chuyển đổi hai giai đoạn, kết quả phân tích cho thấy cả bốn nhân tố khảo sát đều ảnh hưởng tích cực bậc 1 đến hiệu suất phản ứng este hóa xúc tác axit dầu hạt cao su trong đó tỉ lệ mol metanol/dầu (x1) có ảnh hưởng tích cực nhiều nhất, tuy nhiên sự tăng đồng thời tỉ lệ metanol/dầu (x1x1) lại làm giảm nhiều nhất hiệu suất phản ứng (ảnh hưởng tiêu cực) Các ảnh hưởng bậc hai và ảnh hưởng đồng thời của các nhân tố khảo sát cũng đều là ảnh hưởng tiêu cực Sự thay đổi đồng thời hàm lượng xúc tác (x2x2), thời gian phản ứng (x3x3), tỉ lệ mol metanol/dầu và thời gian phản ứng (x1x3), xúc tác và dung môi (x2x4), thời gian phản ứng và dung môi (x3x4) ít ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Ảnh hưởng của các nhân tố khảo sát đến hiệu suất phản ứng este hóa dầu hạt cao su được thể hiện trên hình 3.17

Hình 3.17 Sự biến thiên của hiệu suất phản ứng este hóa xúc tác axit dầu hạt cao su theo tỉ

lệ mol metanol/dầu (3/1 – 9/1) và hàm lượng dung môi (10 – 50%) khi cố định hàm lượng xúc tác (1,25%) và thời gian phản ứng (3,5 giờ)

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy độ tương quan giữa hiệu suất phản ứng chuyển đổi este mỡ cá basa thành FAME thu được

từ thực nghiệm và tính toán từ PTHQ là 99,7%, của phản ứng este hóa xúc tác axit dầu hạt cao su là 98,7% Như vậy giữa giá trị thu được từ mô hình dự đoán và giá trị thực nghiệm chỉ có một sự sai khác nhỏ

* Xác định điều kiện tối ƣu

Dựa trên PTHQ xây dựng được, với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0, bằng phương pháp đạo hàm tìm được điều kiện tối ưu của quá trình chuyển đổi DMĐTV thành FAME từ

mỡ cá basa: tỉ lệ mol metanol/mỡ cá: 6/1 (mol/mol); nồng độ xúc tác KOH: 0,98% (m/m); nhiệt độ phản ứng: 37,80C; thời gian phản ứng: 23,5 phút; hàm lượng dung môi axeton: 30% (m/m) Ở điều kiện tối ưu này, hiệu suất chuyển đổi một giai đoạn các FAME dự đoán có giá trị là 99,9%, giá trị tương ứng thu được khi tiến hành thực nghiệm lặp lại ba lần với mẫu mỡ

cá basa là 99,7% Giá trị phương sai theo điều kiện tối ưu thu được là Stu2 = 0,0233, theo mô hình là S02 = 0,0351, Ftn = 0,0351/0,0233 = 1,51 < Fbảng (0,95, 2, 2) = 19, vậy độ chính xác của các số liệu theo mô hình và theo thực nghiệm ở điều kiện tối ưu là giống nhau

Điều kiện tối ưu của phản ứng este hóa xúc tác axit (giai đoạn một) của quá trình hai giai đoạn điều chế FAME từ dầu hạt cao su thu được như sau: tỉ lệ mol metanol/dầu: 7,5/1 (mol/mol); hàm lượng xúc tác H2SO4: 1,65% (m/m); thời gian phản ứng: 4 giờ; hàm lượng dung môi axeton: 35%; phản ứng thực hiện ở 60o

C Ở điều kiện tối ưu này, hiệu suất phản ứng este hóa dự đoán có giá trị là 97,9% Kết quả thực nghiệm thu được giá trị trung bình của

3 lần thí nghiệm ở điều kiện này là 98,3% Giá trị phương sai theo điều kiện tối ưu thu được

là Stu2

= 0,034, của mô hình là S02 = 0,350, Ftn = 0,350/0,034 = 10,29 < Fbảng (0,95, 2, 2) = 19,

độ chính xác của các số liệu theo mô hình và theo thực nghiệm ở điều kiện tối ưu là giống nhau

Qua so sánh kết quả nghiên cứu với các kết quả chuyển đổi este DMĐTV theo hướng khảo sát đơn biến từng nhân tố với các loại xúc tác khác nhau cho thấy phản ứng chuyển đổi theo hướng tối ưu hóa đồng thời các nhân tố trong môi trường đồng thể đạt được hiệu suất cao hơn với lượng metanol cần dùng ít hơn, thời gian ngắn và nhiệt độ thấp hơn nhiều Đó chính là ưu điểm của phương pháp tối ưu hóa chuyển đổi DMĐTV thành FAME này so với các nghiên cứu chuyển đổi trước đây

3.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Để tiến hành xây dựng đường chuẩn dùng cho việc phân tích các FAME, một dãy chuẩn hỗn hợp 37 FAME có nồng độ từ 2–4–6 ppm đến 50–100–150 ppm được tiêm vào hệ GC/FID Từ các kết quả phân tích, vẽ đồ thị sự phụ thuộc tỉ lệ diện tích pic FAME/IS vào nồng độ của các FAME thu được các đường chuẩn tương ứng Dựa trên phương trình đường chuẩn: y = ax + b để tính LOD theo công thức: LOD  3.S / bB , trong đó SB: độ lệch chuẩn của mẫu trắng, nếu không làm thí nghiệm với mẫu trắng thì SB = Sy (độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy) LOQ = 3,3LOD Kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 3.16 Từ kết quả phân tích cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẻ của tỉ lệ diện tích pic FAME/IS vào nồng độ các FAME (R  0,999) và hệ thống phân tích GC/FID có độ nhạy cao, phát hiện được các FAME đến 0,2 ppm và định lượng được đến 0,7 ppm

Bảng 3.16 Phương trình hồi quy, giới hạn phát hiện, giới hạn

định lượng các FAME của phương pháp phân tích

LO

D (pp m)

LO

Q (pp m)

Bảng 3.16 Phương trình hồi quy, giới hạn phát hiện, giới hạn

định lượng các FAME của phương pháp phân tích

LO

D (pp m)

LO

Q (pp m)

Bảng 3.16 Phương trình hồi quy, giới hạn phát hiện, giới hạn

định lượng các FAME của phương pháp phân tích

LO

D (pp m)

LO

Q (pp m)

Độ lặp lại của hệ thống sắc ký khí (thời gian lưu, tỉ lệ diện tích pic FAME/IS) được khảo

sát bằng cách bơm 7 lần song song mẫu chuẩn hỗn hợp 37 FAME 20-40-60 ppm trong cùng điều kiện tối ưu của GC/FID Kết quả thu được cho thấy độ lặp lại của hệ thống sắc ký khí rất tốt, giá trị độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu của mẫu chuẩn hỗn hợp 37 FAME 20-40-

60 ppm dao động trong khoảng từ 0,03 đến 0,08%, độ lệch chuẩn tương đối về tỉ lệ diện tích pic FAME/IS dao động trong khoảng từ 1,28 đến 4,98% Khi hàm lượng chất phân tích 10 ppm thì RSD (%) cho phép là 7,3%, hàm lượng chất phân tích 100 ppm thì RSD (%) cho phép là 5,3% [117] Như vậy với mẫu chuẩn FAME 20-40-60 ppm, độ lệch chuẩn tương đối của hệ thống GC đều dưới 5%, đáp ứng được yêu cầu phân tích định lượng

Kết quả khảo sát độ lặp lại 6 lần của phương pháp phân tích khi tiến hành thực nghiệm trên 8 mẫu DMĐTV Việt Nam ở các điều kiện tối ưu của quá trình chuyển đổi este và của GC/FID cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về hàm lượng FAME điều chế từ mỡ cá basa dao động từ 1,02 đến 4,65%, mỡ lợn: từ 1,25 đến 5,13%, dầu đậu nành: từ 0,87 đến 5,18%, dầu

mè từ 1,18 đến 4,72%, dầu lạc: từ 1,28 đến 4,96%, dầu dừa: từ 0,95 đến 4,89%, dầu hạt cao su: từ 0,95 đến 4,96% và dầu hạt jatropha: từ 0,92 đến 4,98% Với hàm lượng FAME đo được trong 8 mẫu DMĐTV dao động từ 0,178 đến 433,471 mg/g thì RSD (%) cho phép tối

đa là 5,3% [117] Giá trị độ lệch chuẩn tương đối cao nhất thu được khi phân tích FAME là 5,18% trên mẫu dầu đậu nành Vậy RSD% thu được khi phân tích các FAME đều < 5,3%, do

đó độ lặp lại của phương pháp phân tích đáp ứng được yêu cầu định lượng trong hóa học

3.3.3 Xác định độ đúng và hiệu suất thu hồi

Độ đúng của phương pháp phân tích được xác định bằng cách thêm chuẩn trên nền mẫu trắng Hiệu suất thu hồi được xác định bằng cách thêm chuẩn trên nền mẫu thực Các mẫu thực sau khi tiến hành định lượng FAME và biết được hàm lượng của chúng trong mẫu, thêm chính xác một lượng chuẩn FAME sao cho tổng hàm lượng các FAME trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát và tiến hành định lượng theo quy trình

Kết quả thực nghiệm thu được cho thấy quy trình phân tích có độ thu hồi và độ đúng khá tốt, sai số khi phân tích mỡ cá basa dao động từ -10,93% đến 9,83%, mỡ lợn từ -13,34% đến 9,70%, dầu đậu nành từ -10,64% đến 9,79%, dầu mè từ -12,70% đến 9,57%, dầu lạc từ -

11,95% đến 9,81%, dầu dừa từ -8,16% đến 9,12%, dầu hạt cao su từ -10,29% đến 8,87%, dầu hạt jatropha từ -10,26% đến 9,71% Như vậy phương pháp nghiên cứu có độ sai số nằm trong ngưỡng cho phép, từ -20% đến 10% [22], đáp ứng được yêu cầu phân tích

3.3.4 Kiểm tra đối chứng kết quả phân tích

Để xem xét tính chính xác của phương pháp nghiên cứu, chúng tôi tiến hành gửi kiểm nghiệm hàm lượng axit palmitic, axit oleic và axit linoleic trong một mẫu mỡ động vật (mỡ

cá basa) và một mẫu dầu thực vật (dầu mè) đến phòng thí nghiệm được công nhận VILAS (theo ISO 17025:2005) (hệ thống công nhận phòng thí nghiệm của Việt Nam), Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia và so sánh kết quả phân tích với kết quả kiểm nghiệm Kết quả kiểm tra độ chính xác của phương pháp nghiên cứu được chỉ ra trên bảng 3.28

Bảng 3.28 So sánh kết quả phân tích và kết quả kiểm nghiệm một số axit béo của mẫu mỡ cá

basa và mẫu dầu mè Việt Nam

Thông số phân tích

Kết quả phân tích (mg/g)

Kết quả kiểm nghiệm Vilas (mg/g)

Vậy kết quả kiểm tra thống kê cho thấy phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt, độ nhạy

và độ thu hồi cao, đạt yêu cầu về độ chính xác và độ tin cậy, có thể áp dụng trong việc phân tích thành phần axit béo trong các mẫu DMĐTV Việt Nam

3.4 Phân tích mẫu thực tế

3.4.1 Chuyển đổi DMĐTV thành FAME

Áp dụng các điều kiện tối ưu tìm được theo hai quy trình chuyển đổi DMĐTV thành FAME dùng metanol với xúc tác kiềm hoặc axit được tiến hành ở 3.2 Với các mẫu mỡ lợn, dầu đậu nành, dầu mè, dầu lạc, dầu dừa sử dụng các điều kiện tối ưu của quy trình chuyển đổi một giai đoạn xúc tác kiềm như mẫu mỡ cá basa Với dầu hạt jatropha sử dụng các điều kiện tối ưu của phản ứng este hóa xúc tác axit (giai đoạn một) của quy trình hai giai đoạn điều chế FAME như dầu hạt cao su

Sau khi thực hiện các quá trình chuyển đổi, độ chuyển đổi thành FAME của các mẫu DMĐTV được phân tích trên máy UFLC và được tính theo công thức: