Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4

Đánh giá khả năng điều hòa của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình sản xuất cytokine tiền viêm trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu của TLR4, ở đây chúng tôi sử dụng LPS.

Antiinflammatory studies of soot and theformer

plant through TLR4 receptors

Nguyen Thi Tuoi

Hanoi University of Science, VNU; Faculty of Biology

Major: Biochemical; Code:60.42.30 Supervisors: Dr Trinh Tat Cuong Date of Presenting Thesis: 2012

Abstract Đánh giá khả năng điều hòa của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá

trình sản xuất cytokine tiền viêm trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu của TLR4, ở đây chúng tôi sử dụng LPS Đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình ức chế yếu tố tự phân bào MAPK ( mitogen-activated protein kinase) Đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu TLR4, ở đây chúng tôi sử dụng LPS

Keywords Sinh học thực nghiệm; Cây nhọ nồi; Cây ngải cứu; Thụ thể; Chống viêm;

Thực vật thân cỏ

Content

I Lý do chọn đề tài:

Viêm là đáp ứng tự nhiên của cơ thể để chống lại các tác nhân gây bệnh từ môi trường bên ngoài như: tia tử ngoại, các chất phóng xạ, các chất hóa học và đặc biệt là các tác nhân gây bệnh Kết quả của viêm là loại bỏ hoặc triệt tiêu hoàn toàn các điều kiện sinh ra nó Như vậy, viêm là đáp ứng có lợi cho cơ thể Tuy nhiên, nếu thời gian tồn tại quá lâu thì viêm sẽ chuyển từ giai đoạn cấp tính sang mãn tính và gây nên những hậu quả nghiêm trọng cho cơ thể Những tác động do viêm mãn tính mang lại phải kể đến như: gây rối loạn quá trình chuyển hóa, trao đổi chất, ảnh hưởng đến hoạt động của các cơ quan, thậm chí nếu để nặng hơn có thể dẫn đến suy giảm chức năng của thận, gan…

Do vậy, điều trị và làm giảm bớt tác động bất lợi của viêm đối với cơ thể là vấn đề hết sức quan trọng hiện nay, đặc biệt là trong quá trình điều trị bệnh Các thuốc kháng viêm trên thị trường mà phổ biến là Dexamethasone, các chất có nguồn gốc là cortiocoid, chủ yếu là các thuốc tổng hợp hóa học Các loại thuốc này tuy có tác động nhanh song cũng tiềm tàng các khả năng gây độc cho cơ thể và có thể gây nên những tác dụng phụ không mong muốn Sử dụng thuốc kháng viêm có nguồn gốc thực vật có thể giải quyết những lo ngại trên với ưu điểm là an toàn, hiệu quả lâu dài và giá thành thấp

Cho đến nay, việc tìm kiếm các chất chống viêm mới có nguồn gốc từ thực vật đang được quan tâm bởi những hiệu quả của nó Gần đây, tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã xây dựng mô hình để sàng lọc

và đánh giá khả năng chất chống viêm trên cả mô hình in vitro và in vivo Với mô hình này, Wedelolactone từ cây nhọ nồi đã được tách chiết và bước đầu khẳng định được khả năng chống viêm

Với hoạt tính phòng chống viêm đầy tiềm năng của Wedelolactone, cũng như trên mô hình sàng lọc chất chống viêm mới này, chúng tôi muốn nghiên cứu sâu hơn nữa các đặc tính, cơ chế chống viêm ở mức in vitro Ngoài ra, chúng tôi cũng tiếp túc đánh giá khả năng chống viêm của cây ngải cứu qua mô hình này Từ những kết quả có được này sẽ tạo cơ sở cho các nghiên cứu khoa học thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đích cuối cùng là làm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị các bệnh viêm nhiễm có nguồn gốc từ thực vật góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ

thể TLR4”

II Mục tiêu đề tài

1 Xác định được chức năng điều hòa quá trình đáp ứng viêm của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong tế bào macrophage thông qua thụ thể TLR4

2 Đánh giá được khả năng chống viêm của cây ngải cứu trong tế bào macrophage thông qua thụ thể TLR4

III.Nội dung nghiên cứu

1 Đánh giá khả năng điều hòa của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình sản xuất cytokine tiền viêm trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu của TLR4, ở đây chúng tôi sử dụng LPS

2 Đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình ức chế yếu

tố tự phân bào MAPK ( mitogen-activated protein kinase)

3 Đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu TLR4, ở đây chúng tôi sử dụng LPS

IV Phương pháp nghiên cứu

1.Tách chiết macrophage từ tủy xương của chuột

Tế bào đại thực bào (BMDM) được tách ra từ xương đùi của chuột Sau đó, BMDM được phân chia từ 5 đến 7 ngày trong môi trường DMEM đã được bổ sung cùng với 10% môi trường điều kiện nuôi tế bào L929 (được xem như yếu tố kích thích M-CSF (macrophage-specific colony stimulating factor)), 10% FBS, 1mM sodium pyruvate, 50U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin và 5 × 10−5 M 2-mercaptoethanol

2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng sống của BMDM bằng kít CCK-8

Khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng sử dụng Cell Counting Kit-8 (CCK-8,

Dojindo Laboratories, Kumammoto, Japan) BMDMs được ủ cùng Wedelolactone hoặc Dexamethasone (Dex) trong một số thời gian nhất định Sau quá trình này, 10µl của dung dịch CCK-8 được đưa vào macrophage đã được ủ cùng với Wedelolactone trong 1 giờ Khả năng hấp thụ của các mẫu này sẽ được đo ở bước sóng 450nm bằng máy đọc ELISA Giá trị hấp thụ ở 450nm của mỗi mẫu này được tính như tỉ lệ phần trăm so với mẫu không được xử lý với Wedelolactone hoặc Dex (xem như 100% tế bào sống)

3 Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme Immuno Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:

(1) Kháng nguyên – antigen chưa biết được gắn trên một bề mặt

(2) Kháng thể - antibody biết trước được "rửa" qua bề mặt đó Kháng thể này được gắn kết với enzyme

(3) Thêm vào một cơ chất; enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được

4 Phương pháp Western blot

Để xác định một loại protein trong mẫu sinh học bằng phương pháp điện di trên gel SDS-page (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), được thực hiện theo nguyên tắc lai và được gọi là lai Westerblot Lai Westerblot là phương pháp định tính protein dựa trên nguyên tắc miễn dịch, vì vậy nó còn được gọi là thẩm tách miễn dịch (immunoblotting) 6,3

Là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp thực hiện trên băng giấy, cho phép xác định kháng thể kháng các thành phần khác nhau của protein Trong phương pháp lai Westerblot, các phân tử protein sau khi được phân tách trên điện di sẽ được chuyển lên màng Màng này sau đó được ủ với một dung dịch chứa kháng thể đặc hiệu với protein được quan tâm nghiên cứu Kháng thể sẽ gắn vào loại protein tương ứng ở trên màng Cuối cùng, bằng phản ứng enzyme hiện màu, người ta có thể quan sát được vị trí kháng thể ở trên màng, qua đó cho biết sự có mặt và khối lượng phân tử của protein Nhưng trong luận văn tôi sử dụng phương pháp lai Westerblot nhằm mục đích phát hiện sự có mặt của một hoặc một số loại phân tử cần nghiên cứu trong hỗn hợp phức tạp

5 Phân tích ức chế của Wedelolactone trong quá trình tạo phản ứng oxy hóa[17]

BMDMs được sử lý cùng với Laminarin hoặc galactan trong 60 phút, và tích lũy với

zymosan sau khi đã được ủ với không hoặc cùng với Wedelolactone trong 60 phút Sau đó, các

tế bào được ủ với DHE (Fluorescent Dyes (dihydroethidium) - chất huỳnh quang) trong 15 phút

ở 37◦C trong 5% CO2 Những tế bào này sẽ được kiểm tra bằng laser-scanning confocal

microscopy (LSM 510) để xác định mật độ khác nhau của ROS trong các mẫu đã được xử lý

6.Phân tích thống kế

Đối với phân tích thống kê, các số liệu được lấy từ các kết quả độc lập, được thể hiện ý nghĩa bằng ± SD và được phân tích bằng student‟s t-test cùng với điều chỉnh Bonferroni hoặc ANOVA đối với nhiều phép so sánh Sự khác nhau sẽ được chỉ ra ý nghĩa bằng P< 0.05

V Kết quả nghiên cứu

1 Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hưởng bởi Wedelolactone

Hình 12 Biểu đồ Wedelolactone không gây độc đối với tế bào BMDM

0

50

75

100

DM 10 20 30 (µg/ml )

Khả năng sống

của tế bào(%)

BMDMs được nuôi với mật độ 1×105 tế bào/ giếng Sau 3-4 ngày, các tế bào này được xử lý cùng với Wedelolactone ở các nồng độ lần lượt là 10, 20, 30 μg/ml Các tế bào sống đã được đo bằng kit đếm tế bào Dữ liệu chỉ ra sự sai số của ba thí nghiệm độc lập

2 LPS kích thích tế bào BMDM sinh cytokine

Hình 13: Biểu đồ LPS kích thích tế bào BMDM sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm

BMDMs từ chuột được ủ với LPS 100 (ng/ml) Dịch tế bào được ủ với LPS ở các thời gian khác

nhau lần lượt là 0 giờ, 4 giờ, 8 giờ, 18 giờ, 48 giờ sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa bởi 5 thí nghiệm độc lập

TNF-α

0

5000

10000

15000

0 4 8 18 48 (h) 0

500

0

1000

0

1500

0

0 4 8 18 48 (h)

0

50

0

100

0

150

0

0 4 8 18 48 (h)

0

200

0

400

0

600

0

800

0

0 4 8 18 48 (h)

IL-6

Quá

trình

tiết

của

cytok

ine

(pg/

ml)

Quá

trình

tiết

của

cytoki

ne

(pg/m

l)

3 Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine thông qua thụ thể TLR4 kích thích bằng LPS

Hình 14: Biểu đồ Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine tiền viêm trong BMDM được kích thích bằng LPS

BMDMs từ chuột được ủ cùng với Wedelolactone ở các nồng độ khác nhau 2,5; 5; 10; 20 hoặc đối chứng DMSO (0.1% DMSO) trong 45 phút trước khi ủ với với LPS 100 (ng/ml) Dịch sau khi tế bào được ủ với LPS 18 giờ sẽ được đánh giá đối với quá trình sản xuất cytokine bằng ELISA Các kết quả được biểu hiện sai số ý nghĩa bởi 5 thí nghiệm độc lập (DM: đối chứng; W: Wedelolactone)

DM 2.5 5 10 20

(µg/ml )

0

500

0

10000

15000

DM 2.5 5 10

20 (µg/ml )

0 5000 10000 15000

DM 2.5 5 10

20 (µg/ml )

0

500

100

0

150

0

DM 2.5 5 10 20

(µg/ml )

INF-ү

0 2000 4000 6000 8000 IL-10

4 Wedelolactone ức chế quá trình phospho của yếu tố tự phân bào bằng LPS kích thích thông qua thụ TLR4

Hình 16 Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho của ERK1/2 và p38 trong BMDM

BMDMs đã được ủ cùng với Wedelolactone (20 µg/ml) hoặc Dexamethasone (100nM) trong 45 phút Sau đó, các tế bào tiếp tục được ủ với LPS (100ng/ml) trong 18 giờ Sau khi ly tâm các tế bào được phá vỡ nhờ đệm phá tế bào trong 4ºC Quá trình phospho hóa được đánh giá thông qua quá trình western blot (Môi trường: M; dung môi đối chứng: SD; Wedelolactone: W; Dexamethasone: Dex)

5 LPS kích thích hoạt động p47 phox trong quá trình tạo ra ROS

p47phox-ser345

p47phox

Hình 18 LPS kích thích quá trình phospho hóa của p47phox trong BMDM

ERK

p38

M SD W SD Dex P-ERK

P-p38

LPS

0 5 15 30 60 120 (min)

LPS

BMDM được ủ với LPS (100ng/ml) tại các thời điểm từ 0 cho đến 120 phút Sau khi ly tâm các

tế bào được phá vỡ nhờ đệm phá tế bào trong 4ºC Quá trình phospho hóa được đánh giá thông qua quá trình western blot

6 Dầu ngải cứu không gây độc đối với BMDM

VI KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1 Wedelolactone đã ức chế quá trình sản xuất cytokine tiền viêm nhưng không ức chế quá trình sinh cytokine kháng viêm với nồng độ (20μg/ml) thông qua thụ thể TLR4 kích thích bằng cấu tử đặc hiệu LPS

2 Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho hóa của yếu tố tự phân bào là ERK1/2 (extracellular-signal-regulated kinases) và p38

3 Wedelolactone đã giảm quá trình sinh ROS bằng ức chế quá trình phospho hóa của p47phox

4 Tinh dầu ngải cứu bước đầu không thấy có khả năng ức chế quá trình sản xuất cytokine thông qua thụ thể TLR4 thông quá cấu tử đặc hiệu LPS

25

50

75

100

TỶ LỆ

TẾ BÀO SÔNG (%)

ĐC 10 20 40 (µg/ml )

KIẾN NGHỊ

1 Tiếp túc đánh giá vai trò của Wedelolactone có phải là một chất thuộc cấu tử của thụ thể Glucocorticoid

2 Đánh giá khả năng điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm khuẩn bằng tiêm chuột với LPS của Wedelolactone

References

Tài liệu tiếng Việt

1 Nguyễn Thị Bích Hằng, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Tro ̣ng Thông, Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn

Thị Hoa Hiên (2009), “Nghiên cứu tác du ̣ng chống viêm của cao lỏng lá vo ̣ng cách (Premna

2 Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nguyễn Minh Thanh, Châu Văn Minh, Nguyễn Trọng

Thông (2008), “Nghiên cứu khả năng kháng viêm từ rong tảo biển Việt Nam”, Tạp chí Hoá

học, 46(5A), tr 81-90

3 Đinh Đoàn Long (Chủ biên), Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội

4 Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội

5 Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và

kỹ thuật, Hà Nội

6 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2009), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, NXB Đại Học

Quốc Gia Hà Nội

7 Đỗ Thị Oanh , Phạm Thanh Kỳ , Nguyễn Thi ̣ Bích Hằng , Nguyễn Tro ̣ng Thông , Phạm Thị

Vân Anh (2010), “Nghiên cứu tác du ̣ng chống viêm và bảo vê ̣ gan của cao sói rừng (Sapium

8 Hà Vân Oanh, Phạm Xuân Sinh, Nguyễn Thái An, Nguyễn Tro ̣ng Thông, Phạm Thị Vân Anh (2010), “Nghiên cứ u tác du ̣ng chống viêm cấp của cao lỏng rễ ba ̣ch đồng nữ (Clerodendrum

20-23

Tài liệu tiếng Anh

9 Boguski MS (2002), “News and views comparative genomics: The mouse that roared”,

Nature, 420, pp 515-516

10 Bhattacharjee R, Akira S (2005), “Toll-like receptor rignaling: emerging opportunities in

human diseases and medicine”, Current Immunology Reviews, 1, pp 81-90

11 Blanqué R, Meakin C, Millet S, Gardner CR (1998), “Selective enhancement of LPS-induced

serum TNF-alpha production by carrageenan pretreatment in mice”, General Pharmacology,

31(2), pp 301-6

12 Brown GD (2006), “Dectin-1: a signaling non-TLR pattern-recognition receptor”, Nature, 6,

pp 33-43

13 Chao WW, Hong YH, Chenc ML, Lina BF (2010), “Inhibitory effects of Angelica sinensis

ethyl acetate extract and major compounds on NF-КB trans-activation activity and

LPS-induced inflammation”, Journal of Ethnopharmacology, 129, pp 244–249

14 Chao W and Lin B (2010), “Isolation and identification of bioactive compounds in

Andrographis paniculata (Chuanxinlian)”, Chinese Medicine, 5, pp 17

15 Coghlan MJ, Jacobson PB, Lane B, Nakane M, Lin CW, Elmore SW (2003), „A novel

anti-inflammatory maintains glucocorticoid efficacy with reduced side effects”, Molecular

Endocrinology, 17, pp 860–869

16 Cohen J (2002), “The immunopathogensis of sepsis”, Nature, 420, pp 885–991

17 Cuong TT, Yang CS, Yuk JM, Lee HM, Ko SR, Cho BG, Jo EK (2009), “Glucocorticoid receptor agonist compound K regulates dectin-1-dependent inflammatory signaling through

inhibition of reactive oxygen species”, Life Sciences, 85, pp 625-633

18 Dang Diem Hong, Hoang Minh Hien, Hoang Thi Lan Anh (2011), “Studies on the analgesic

and anti-inflammatory activities of Sargassum swartzii (Turner) C Agardh (Phaeophyta) and

Ulva reticulata Forsskal (Chlorophyta) in experiment animal models”, African Journal of Biotechnology, 10(12), pp 2308-2314

19 Elewaut D (2009), “Selective glucocorticoid receptor agonists in rheumatoid arthritis reality

or fiction”, European Musculoskeletal Review, 4(1), pp 24-25

20 Ferwerda B, McCall MB, Verheijen K, Kullberg BJ, Van der Ven AJ, Van der Meer JW, and Netea MG (2008), “ Functional consequences of toll-like receptor 4 polymorphisms”

Molecular Medicine, 14, pp 346–352