Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông cỏ (gossypium arboreum l ) phục vụ lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn

Đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn và một số đặc tính nông sinh học chính của các giống bông đã thu thập.. Sử dụng chỉ thị phân tử SSR để phân tích mối quan hệ di truyền phân tử giữa các

Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông

cỏ (Gossypium arboreum L.) phục vụ lập bản đồ

gen kháng bệnh xanh lùn

Nguyễn Thanh Quân

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Thanh Thủy

Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Thu thập một số giống bông cỏ có tiềm năng năng suất cao, chất

lượng xơ tốt và một số dòng bông kháng bệnh xanh lùn Đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn và một số đặc tính nông sinh học chính của các giống bông đã thu thập Sử dụng chỉ thị phân tử SSR để phân tích mối quan hệ di truyền phân tử giữa các giống bông cỏ Xác định cặp giống bông vải kháng bệnh và giống bông không kháng bệnh nhưng có nhiều đặc tính ưu việt về năng suất cũng như chất lượng sợi làm vật liệu lai tạo quần thể, phục vụ lập

bản đồ phân tử gen kháng bệnh xanh lùn

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Đa dạng di truyền; Gen; Bông cỏ;

Bệnh xanh lùn

Content

Cây bông (Gossypium L ) là loại cây trồng lấy sơ ̣i tự nhiên hàng đầu và quan tro ̣ng nhất trên thế giới , được trồng khắp mo ̣i nơi ở điều ki ện khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đớ i Bông vải cũng là m ặt hàng thương m ại quan trọng mang lại lợi nhu ận cho hàng triệu nông dân ở các nước phát triển cũng như đang phát triển Sản phẩm chính xơ bông được biết đến như là nguồn nguyên li ệu chủ yếu cho ngành công nghi ệp dệt may Tuy nhiên , sản lượng bông vải hàng năm phu ̣ thu ộc vào nhiều yếu tố trong đó yếu tố ngoại cảnh như sâu bệnh và giống là hai yếu tố quan tro ̣ng nhất

Hiện nay đã có hơn 20 loại bệnh ha ̣i bông do virus gây ra được công bố , trong đó bệnh xanh lùn hay còn gọi là bệnh xanh lá (cotton blue disease ) là loại bệnh xuất hiện từ sớm và gây ha ̣i nghiêm tro ̣ng cho sản xuất bông (Correae et al., 2005) Sự lựa cho ̣n tối ưu nhất cho công tác quản lý b ệnh cây cũng như hạn chế ô nhiễm môi trường do d ùng thuốc

hóa ho ̣c hi ện nay chính là việc sử du ̣ng giống kháng và nguồn gen kháng bền vững nhất vẫn là nguồn gen được cho ̣n lo ̣c tự nhiên từ các giống bông kháng bệnh xanh lùn

Xuất phát từ vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

Nghiên cứu đa da ̣ng di truyền nguồn gen bông cỏ (Gossypium arboreum L.)

phục vụ lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn

1.1 Mục tiêu của đề tài

Thu thập các giống bông cỏ đi ̣a phương và nh ập nội để tiến hành đánh giá khả năng kháng/nhiễm bệnh xanh lùn qua chỉ tiêu hình thái , đồng thời đánh giá sự đa da ̣ng di truyền của các giống bông bằng chỉ thi ̣ phân tử (SSR), từ đó xác đi ̣nh các c ặp lai phu ̣c vu ̣ nghiên cứu lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn và cho ̣n tạo giống bông kháng bệnh

1.2 Nội dung nghiên cứu của đề tài

1 Thu thập một số giống bông cỏ có tiềm năng năng suất cao, chất lượng xơ tốt và một số dòng bông kháng bệnh xanh lùn

2 Đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn và một số đặc tính nông sinh học chính của các giống bông đã thu thập

3 Sử dụng chỉ thị phân tử SSR để phân tích mối quan hệ di truyền phân tử giữa các giống bông cỏ

4 Xác định cặp giống bông vải kháng bệnh và giống bông không kháng bệnh nhưng có nhiều đặc tính ưu việt về năng suất cũng như chất lượng sợi làm vật liệu lai tạo quần thể, phục vụ lập bản đồ phân tử gen kháng bệnh xanh lùn

Phần 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1 Sơ đồ các bước triển khai đề tài

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu thực vật

30 giống bông cỏ (Gossypium arboreum L.) nhập nội và địa phương được chọn

lọc từ nguồn gen có sẵn của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố và những giống này được thu thập từ các nước Việt Nam, Ấn Độ, Liên xô cũ (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Tên và nguồn gốc của 30 giống bông cỏ thu thập được

TT

MS

TĐ

Tên giống

Nguồn gốc

TT

MS

TĐ

Tên Giống

Nguồn gốc

1 2 Cỏ Thanh Hóa Việt Nam 16 77 91-B-16 Ấn độ

2 3 Hà Sơn Bình Việt Nam 17 78 91-B-36 Ấn độ

3 5 Cỏ Phú Khánh Việt Nam 18 79 BAA (bar x arb) Ấn độ

4 6 Cỏ Nghệ An Việt Nam 19 80 BAA (bar x arb) Ấn độ

5 7 Cỏ Bắc Ái Việt Nam 20 81 BAA (bar x arb) Ấn độ

6 15 AK-235 Ấn Độ 21 82 BAA (bar x arb) Ấn độ

7 18 Lục Ngạn Việt Nam 22 83 BAA (bar x arb) Ấn độ

8 34 B2III4 Ấn Độ 23 85 BAA (bar x arb) Ấn độ

9 35 B2IV10 Ấn Độ 24 86 BAA (bar x arb) Ấn độ

10 42 Akola Ấn Độ 25 87 BAA (bar x arb) Ấn độ

11 43 Tka 283 Ấn Độ 26 92 BAA (bar x arb) Ấn độ

12 44 Tka 188 Ấn Độ 27 93 BAA (bar x arb) Ấn độ

13 46 Ava Liên Xô 28 94 BAA (bar x arb) Ấn độ

Bảng 2.2 Các nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

Số cặp mồi

sử dụng

1 BNL Brookhaven National Laboratory, 2007 20

2 MUCS Mauricio Ulloa, 2005 6

3 MUSS Mauricio Ulloa, 2005 4

4 NAU Nanjing Agricultural University, 2007 10

5 STV Taliercio E, Scheffler J 2006 4

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG

2.2.1 Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn

Phương pháp đánh giá bệnh được tiến hành dựa trên mức độ biểu hiện bệnh xanh lùn theo 4 cấp của Junior và cs (2008), thang điểm được ghi nhận như sau:

+ Cấp 0: Không nhiễm bệnh

+ Cấp 1: Màu lá bình thường nhưng lá bị biến dạng nhẹ

+ Cấp 2: Lá có màu đậm và bị biến dạng dễ nhận thấy

+ Cấp 3: Lá có màu xanh nhạt, bị biến dạng nhiều và gân lá vàng

Cách tính điểm kháng/nhiễm: Cây có bệnh cấp 0: được đánh giá kháng Cây có có bệnh 1-3 được đánh giá nhiễm

2.2.2 Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học của các giống bông

Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học của các giống bông cỏ dựa trên 3 nhóm chỉ tiêu chính:

(1) Nhóm chỉ tiêu về sinh trưởng: Thời gian sinh trưởng (ngày); Chiều cao cây (cm); Số

cành đực/cây; Số cành quả/cây; Vị trí cành quả 1 (đốt)

(2) Nhóm chỉ tiêu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất: Khối lượng quả (g); Số

quả/cây; Năng suất lý thuyết (tạ/ha); Khối lượng 100 hạt (g); Tỷ lệ xơ (%); Năng suất bông hạt (tạ/ha); Năng suất bông xơ (tạ/ha)

(3) Nhóm chỉ tiêu về hạt, tỉ lệ xơ và chất lượng xơ: Chiều dài xơ (mm); Độ đều xơ (%);

Độ mịn xơ (mix); Độ chín xơ (%); Độ bền xơ (g/tex)

Số liệu theo dõi về các chỉ tiêu trong đánh giá đặc tính nông sinh học các giống bông được nhập vào phần mềm thống kê IRRISTAT v.4.0 (IRRI, 1998) để xử lý

2.2.3 Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR

2.2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số và quy trình chạy phản ứng PCR

a) Tách chiết ADN tổng số

ADN lá bông được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle, J.J và cs (1987)

Quy trình tách chiết ADN tổng số:

- Mẫu lá non được nghiền mịn trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2ml

- Thêm 1ml dung dịch đệm chiết

- Để khô ADN sau đó cho 50µl TE

- Khử ARN bằng cách thêm 4µl RNAse/eppendorf trong tủ ấm 370C trong 3h

Kiểm tra ADN tổng số: Chất lượng và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra trên gel agarose 0.8% Nồng độ chính xác được đo trên máy quang phổ Nanodrop

72 2 phút Tổng hợp

3 72 7 phút 1 Tổng hợp

2.2.3.2 Phân tích số liệu đa hình di truyền

Những số liê ̣u thống kê bao gồm số allen trên locus , tần số allen phổ b iến nhất, số allen cá biệt, chỉ số PIC (Polymorphism Information Content ) được tính toán sử du ̣ ng phần mềm Excel , trong đó: (1) Chỉ số Tần số allen phổ biến nhất được tính bằng tỷ lệ % của số cá thể xuất hiện allen phổ biến nhất tr ên tổng số allen xuất hiê ̣n ở từng locus nghiên cứu (2) Allen cá biệt của từng chỉ thi ̣ SSR được xác đi ̣nh là allen xuất hiê ̣n duy nhất ở 1 giống trong toàn bô ̣ các giống bông nghiên cứu (3) Đa da ̣ng di truyền allen của các chỉ th ị SSR được đánh giá thông qua hệ số PIC (Botstein,1980) và được tính theo phương trình:

Trong đó: Pij là tần số xuất hiện của alen thứ j tương ứng với mồi i

Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại càng lớn, tức là càng nhiều allen được sinh ra

- Hệ số tương đồng di truyền S: phản ánh mức độ giống nhau và khác nhau giữa các giống Cơ sở để tính toán hệ số này là mô hình toán Nei và Li (1979) như sau:

2 xy

N S

Sự có mă ̣t hay vắng mă ̣t của các allen của từng chỉ thi ̣ SSR được ghi nhâ ̣n cho tất

cả các giống bông nghiên cứu , trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là có băng ADN ở

cùng một vị trí Số liệu đươ ̣c nh ập vào chương trình NTSYS-pc v 2.1 (Rohlf, 1997) để xây dựng ma trâ ̣n tương đồng di truyền Tiếp theo, sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hê ̣

di truyền giữa các giống bông nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages)

Phần 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

30 giống bông cỏ nhập nội và địa phương đã được triển khai gieo trên đồng ruộng tại Viện Nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố (hình 3.1a) và duy trì trong nhà lưới của Viện (hình 3.1b) Mẫu lá non của từng giống bông riêng biệt (hình 3.1c) đã được thu thập

và đưa vào phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp

để tách chiết ADN tổng số, phục vụ phân tích chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền

Hình 3.1 Gieo trồng ngoài đồng (a) để duy trì và trong nhà lưới (b,c) để lấy mẫu lá

3.1 ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ (G.arboreum L.)

Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong 30 giống bông cỏ được đưa vào đánh giá bệnh, giống bông cỏ Nghệ An là giống duy nhất có biểu hiện kháng với bệnh xanh lùn, các giống còn lại đều có biểu hiện nhiễm bệnh

Đề tài đã tiến hành chọn dòng đối với tính kháng bệnh xanh lùn trên giống bông

cỏ Nghệ An, kết quả đã chọn lọc được 6 dòng biểu hiện tính kháng bệnh, trong đó có 4 dòng kháng hoàn toàn, đó là các dòng KXL-00-02, KXL-00-03, KXL-00-04, KXL-00-05 (bảng 3.1) Những dòng bông này được lưu giữ làm vật liệu để lai với các dòng giống bông vải khác, tạo quần thể con lai lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn

Bảng 3.1 Kết quả chọn lọc các dòng kháng bệnh xanh lùn của bông Nghệ An

Tổng số cây

Tỷ lệ bệnh (%)

Thời gian ủ bệnh trung bình (ngày)

Qua đánh giá các đặc tính nông sinh học từ 30 giống bông nghiên cứu trên, đề tài

đã thu thập được 14 giống mang những đặc điểm ưu việt nhất dựa trên các chỉ tiêu chính

về năng suất bông xơ (tạ/ha) và chất lượng xơ bông (độ bền-g/tex) Những giống có phẩm chất tốt được trình bày ở bảng 3.2 dưới đây:

Bảng 3.2 Một số giống bông cỏ tiềm năng đạt năng suất cao và chất lượng tốt

TT

MS

TĐ Tên giống

Thời gian sinh trưởng (ngày)

Năng suất bông xơ (tạ/ha)

Độ bền (g/tex)

3.3 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG BÔNG NGHIÊN CỨU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

3.3.1 Tách chiết ADN tổng số của các giống bông phục vụ phân tích SSR

Mẫu lá non của 30 giống bông cỏ và 1 dòng bông kháng (KXL-00-02) sau khi được tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB đã thu được nồng độ khá cao, từ

200 – 1.500ng/µl

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra ADN của các giống bông trên gel agarose 0,8%

Giếng số 1-31: ADN các giống bông nghiên cứu Giếng ngoài cùng bên phải:  ADN chuẩn với nồng độ 100ng

3.3.2 Kết quả phân tích đa hình ADN các giống bông bố mẹ bằng chỉ thị SSR

ADN tổng số của 30 giống và 1 dòng bông cỏ kháng bệnh xanh lùn sau khi tinh sạch được sử dụng để tiến hành làm phản ứng PCR với 50 chỉ thị phân tử SSR Tuy nhiên, đối với hệ gen bông, việc xác định được những locus SSR cho các alen đa hình là tương đối khó khăn, chính vì vậy, trong số 50 cặp mồi nằm rải rác trên hệ gen bông đã nghiên cứu, chỉ có 15 cặp mồi cho kết quả đa hình, chiếm 30% tổng số cặp mồi Số chỉ thị còn lại không cho đa hình giữa các giống, cho băng sản phẩm mờ hoặc không cho sản phẩm PCR, nên bị loại bỏ khỏi nghiên cứu Hình 3.3 và 3.4 là ảnh gel minh họa đa hình ADN giữa các giống bông cỏ khi khảo sát với một số cặp mồi SSR Kết quả cho thấy cặp mồi này đã cho đa hình ADN tương đối rõ giữa các giống bông

Hình 3.3 Sản phẩm PCR của một số giống bông nghiên cứu với các cặp mồi nhóm

BNL trên gel agarose 3%

Giếng 1: Thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 2-32: Sản phẩm PCR các giống bông

(đánh số theo tên mã số tập đoàn)

Hình 3.4 Sản phẩm PCR của một số giống bông nghiên cứu với một số cặp mồi nhóm NAU, TM và

STV trên gel agarose 3%

Giếng 1: Thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 2-32: Sản phẩm PCR các giống bông

(đánh số theo tên mã số tập đoàn)

Số liệu phân tích kiểu gen được đưa vào phần mềm Excel để đánh giá các chỉ tiêu

đa dạng chính, kết quả được tổng hợp ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Các chỉ tiêu về alen, chỉ số đa dạng PIC của các locus SSR nhận biết trên

31 giống bông nghiên cứu

TT SSR allen sản phẩm

PCR (bp)

allen phổ biến nhất

Đề tài đã tiến hành so sánh kết quả thu được trong nghiên cứu này với các kết quả

về đánh giá đa dạng di truyền genom cây bông đã được công bố trong và ngoài nước Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Một số kết quả phân tích đa dạng SSR ở cây bông đã đƣợc công bố

giống

Số

chỉ thị

Tổng số allen

Trung bình

Số

allen

PIC

Kết quả phân tích cho thấy số allen trung bình trong nghiên cứu thu được là khá cao, là 2,3; trong khi hầu hết các nghiên cứu còn lại đều có số allen trung bình thu được dưới 2,2 (Rehman và cs, 2009; Khan và cs, 2009; Boopathi và cs, 2008; Dongre và cs, 2007; Wangzhen Guo, 2006; Liu và cs, 2006; Bertini và cs, 2006) Khi so sánh về chỉ số

đa dạng PIC giữa các nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy chỉ số đa dạng PIC của nghiên cứu này cũng có giá trị trung bình khá cao, 0,41, trong khi các nghiên cứu tương tự có giá trị này đa số nằm trong khoảng từ 0,37 đến 0,41, duy chỉ có công trình của Guang và cs (2006) thu được giá trị PIC trung bình cao nhất là 0,62

Giá trị PIC trung bình phản ánh mức độ đa dạng chung cho tất cả các locus nghiên cứu Điều này chứng tỏ những chỉ thi ̣ SSR được sử du ̣ng trong nghiên cứu này đã cho kết quả đa dạng cao giữa các giống bông nghiên cứu và vi ệc sử dụng những chỉ thị này sẽ có

ý nghĩa khi phân tích đa hình di truyền cây bông

3.3.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống bông nghiên cứu

Số liệu phân tích SSR với các giống bông tiếp tục được đưa vào xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1 để phân tích mức độ tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các giống bông nghiên cứu Kết quả thu được ở bảng 3.5 và hình 3.5

Bảng 3.5 Mối quan hệ di truyền giữa 31 giống bông cỏ trong nghiên cứu

Hình 3.5 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của các giống bông cỏ trong

nghiên cứu

Kết quả cho thấy độ tương đồng di truyền giữa các giống bông nghiên cứu dao động từ 0,26 đến 0,97 với giá trị trung bình là 0,61, điều đó cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về mặt di truyền giữa các giống bông nghiên cứu khá cao Hai giống bông cỏ nguồn gốc Ấn Độ, BC93 và BC94 (ký hiệu các giống bông theo mã số tập đoàn) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,97

Ở mức độ tương đồng di truyền khoảng 0,61, 31 giống bông đã phân tách thành 3 nhóm chính riêng biệt:

- Nhóm I gồm 3 giống bông với hệ số tương đồng dao động trong khoảng 0,62 – 0,71: BC2, BC3 và KXL

- Nhóm II gồm 9 giống bông với hệ số tương đồng dao động từ 0,63 – 0,91: BC5, BC6, BC34, BC18, BC87,BC35, BC79, BC46 và BC101

- Nhóm III gồm 19 giống bông với hệ số tương đồng từ 0,64 – 0,97: BC7, BC76, BC42, BC43, BC15, BC100, BC80, BC92, BC86, BC82, BC81, BC93, BC94, BC83, BC85, BC75, BC78, BC77, BC44

Những kết quả phân tích mối quan hê ̣ di truyền giữa các giống bông c ỏ thông qua

ma trâ ̣n tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây phân nhóm di truyền đã cho thấy sự đa dạng khá lớn về mặt di truyền giữa 31 dòng/giống bông nghiên cứ u Kết hợp kết quả phân nhóm di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR với những thông tin nổi trội về đặc tính