Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5 1 tái tổ hợp biểu hiện trong escherichia coli

Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5.1 tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli Trần Thị Nhài Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5.1 tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli

Trần Thị Nhài

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: GS.TS Trương Nam Hải

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về virus cúm và biểu hiện gen: cấu trúc và khả năng gây bệnh của

virus cúm; Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ; Cấu trúc, chức năng của HA và NA; Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A; Vaccine phòng cúm A/H5N1; Hệ biểu hiện E coli; Chủng biểu hiện E coli BL21; Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin Trình bày các phương pháp nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5-1 tái tổ hợp biểu hiệu trong Escherichia Coli Đưa ra kết quả và thảo luận: thiết kế vector biểu hiện PET22TRXHA5-1; biểu hiện GEN HA5-1 trong chúng vi khuẩn E COLI BL21; lựa chọn điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp TRXHA5-1 trong E COLI; tinh chế sơ bộ protein tái tổ hợp TRXHA5-1; kiểm tra tính sinh đáp ứng miễn dịch của protein

tái tổ hợp HA5-1

Keywords: Miễn dịch; Virus cúm; Protein tái tổ hợp; Sinh học

Content

MỞ ĐẦU

Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) dovirus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh

Virus cúm A/H5N1 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên bề mặt

capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1 đến N9)

Tính đến năm 2011 dịch cúm A/H5N1 đã xuất hiện ở hơn 50 quốc gia khác nhau ở châu Á, châu Âu, châu Phi và có nguy cơ lan rộng khắp thế giới Theo thông báo của WHO, tính đến tháng 01/2012 đã có tới 583 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 344 trường hợp tử vong,

120 triệu gia cầm chết do nhiễm virus hoặc bị tiêu hủy Virus lây lan nhanh và có độc lực rất cao

ở các vật chủ khác nhau

Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm do virus cumsA/H5N1 bắt đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm 2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng ở hầu hết các địa phương trong

cả nước Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi

Tiêm vaccine phòng virus cúm A/H5N1 cho gia cầm được coi là một cách phòng chống hiệu quả, đỡ tốn kém và không ảnh hưởng nguy hại tới môi trường

Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của

protein HA5-1 tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli”

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chung về virus cúm

1.1.1 Một số đặc điểm về cấu tru ́ c của virus cúm

Đặc tính cấu trúc chung của tất cả 4 nhóm virus trong họ Orthomyxoviridae là hệ gen của chúng chỉ chứa duy nhất ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, ký hiệu là ss(-) RNA

Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da

Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đã được đặc hiệu

hóa để gắn protein màng của virus vào , bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số protein da ̣ng trần không được glycosyl hóa

Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B) và phức hợp ribonucleoprotein RNP

(C) của virus cúm A A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A; C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

(Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)

Hệ gen của virus cúm A được cấu tạo từ 8 đoạn đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho

2 protein là NS1 và NS2, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2

1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ

Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào biểu mô và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.2)

Hình 1.2: Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ

1.1.3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA

Protein HA (hemagglutinin)

Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng

gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm, kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự

ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory

antibody)

Protein NA (neuraminidase)

Protein neuraminidase còn gọi là sialidase có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA trong quá trình giải phóng hạt virus mới khỏi

tế bào nhiễm và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào

1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

Do kháng nguyên HA và NA của virus thường xuyên biến đổi mà bệnh cúm rất khó kiểm soát

Có hai phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A

Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ gen của virus do virus cúm A không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình

phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích

Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) giữa các gen kháng

nguyên của virus cúm với gen khác ở một số rất ít virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao

1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1

Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn

chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch

Hiện nay có 3 loại vaccine được bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là: Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc: đây là loại vaccine dị chủng; vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N1 (Trung Quốc): là loại vaccine đồng chủng; vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5 (Hà lan): là loại vaccine dị chủng

Hiện có 3 cơ sở đang nghiên cứu thử nghiệm loại vaccine virus phòng bệnh cúm gia cầm H5N1 cho cả người và gia cầm như:

+ Công ty Vắc xin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) của Viện Vệ sinh & Dịch tễ Trung Ương;

+ Viện Pasteur TP.HCM,

+ Viện Vaccine & Chế phẩm sinh học Nha Trang

1.2 BIỂU HIỆN GEN

1.2.1 Hệ biểu hiện E coli

Việc sử dụng rộng E coli dựa vào những ưu điểm nổi bật là: thao tác trên vật liệu di truyền

dễ, có thể biểu hiện các protein ngoại lai lên đến 50% protein tổng của tế bào, biểu hiện lượng lớn protein ngoại lai khi tốc độ tăng trưởng của tế bào cao và mật độ tế bào đủ lớn, môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ

1.2.2 Chủng biểu hiện E coli BL21

Chủng biểu hiện E coli BL21, gen lon protease (một protease nội bào) và ompT protease (một

protease định khu ở màng ngoài) đã bị đột biến Vì vậy, protein ngoại lai sẽ ít bị phân cắt bởi

protease của tế bào chủ

1.2.3 Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin

+ Gen ngoại lai được điều khiển bởi promotor T7

+Phiên mã được điều khiển bởi lac operator, có cơ chế cảm ứng IPTG

+ Sau vùng đa nối có đoạn trình tự mã hóa cho 6 aa Histidin

Ngoài ra Thioredoxin được biết:

+ Như là tá chất làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên khi gây miễn dịch cho gia

cầm

+ Giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt bởi protease

+ Hình thành cấu trúc bậc 3 chính xác hơn

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Các chủng sinh vật và plasmid

- Chủng vi khuẩn E coli DH5α được sử dụng để tách dòng gen trxha5-1;Chủng vi khuẩn

E coli BL21 được sử dụng để biểu hiện gen ha5-1; Plasmid pET22b(+)mang gen trx; Plasmid

pCR2.1 mang gen ha5-1 (pCRha5-l)

2.1.2 Hóa chất và enzym

* Hóa chất:

SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức); X-Gal (Sigma, Mỹ); phenol, metanol isoamylalcohol, EtBr, glyxerol, IPTG, etanol, chloroform (Roth, Đức); agan (Fluka, Đức); d-NTP (Promega, Mỹ);

ampicillin (Merk, Đức); agaroza (Gibco, Mỹ); MgS04 (BioLabs, Anh)

* Enzyme

Các enzyme hạn chế (BioLab, Anh); Taq-DNA polymeraza (BioLabs, Anh); rionucleaza (Sigma, Mỹ); phosphataza kiềm, T4-DNA ligaza (BioLabs, Anh)

2.1.3 Máy móc và thiết bị

Máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); máy ổn nhiệt (Mỹ); máy điện di, máy xác định DNA trên gel agaroza (Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ); máy ly tâm Eppendorf; Bộ tinh sạch DNA từ gel agarose

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

2.1.4.1 Môi trường và dung dịch sử dụng trong biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH5α

2.1.4.2 Các dung dịch được sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli DH5α

2.1.4.3 Các dung dịch được sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose

2.1.4.4 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide-SDS

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn

2.2.2 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid

2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt

2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E coli

2.2.5 Điện di DNA trên gel agarose

2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose

2.2.7 Điện di protein trên gel polyacrylamide

2.2.8 Biểu hiện protein tái tổ hợp

2.2.9 Tinh sạch sơ bộ protein tái tổ hợp bằng dung dịch đệm urê

2.2.10 Kiểm tra tính kháng nguyên của TrxHA5-1

2.2.11 Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà

2.2.11.1 Gây miễn dịch và thu huyết thanh gà

2.2.11.2 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1

3.1.1 Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx

Thu nhận đoạn gen ha5-1 từ plasmid pCRha5-1 và mở vòng vector pET22Trx bằng cặp

enzym cắt giới hạn NcoI và BamHI Sau đó nối đoạn gen ha5-1 vào vactor biểu hiện pET22Trx

để tạo nên vector tái tổ hợp pETTrxha5-1

Kết quả trên điện di đồ cho thấy cả 4 dòng plasmid được tách chiết (1,2,3,4) đều là dòng plasmid tái tổ hợp pET22Trxha5-1 và có kích thước lớn hơn kích thước vector pEt22Trx

3.1.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l bằng enzyme cắt giới hạn

Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI Vector

pET22trx cũng được xử lý bằng cặp enzyme này để làm đối chứng

Trên các đường chạy từ số 2 đến số 5 tương ứng với sản phẩm cắt của dòng plasmid tái tổ

Hình 3.2: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid trên gel agarose 0,8%

1-4: Plasmid ta ́i tổ hợp pET22Trxha1; 5: Plasmid đối chứng (pET22Trx)

pET22Trxha5-1

1 2 3 4 5

pET22Trx

5.9 kb

pET22Trx

1 2 3 4 5 M

Hình 3.3: Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp (pET22Trxha5-1)

bằng enzym cắt giới hạn NcoI và BamHI 1: plasmid pET22Trx (Đối chứng) ;

2-5: các dòng plasmid tái tổ hợp; M: Thang ADN chuẩn 1Kb (Fermentas)

hợp xuất hiện hai băng DNA có kích thước tương ứng khoảng 1 kb và 5,9 kb Dòng đối chứng khi cắt bằng 2 enzyme chỉ tạo ra đoạn DNA có kích thước tương đương 5,9 kb đúng như tính toán lý thuyết

3.2 BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E COLI BL21

Tế bào vi khuẩn E.coli mang plasmid tth được nuôi cấy cảm ứng với nồng độ IPTG 0,5mM ở 37o

C Kết quả phân tích protein tổng số của tế bào E coli tái tổ hợp cho thấy, ở đường

chạy số 3 protein TrxHA5-1 đã được biểu hiện với kích thước khoảng 57,5 kDa đúng như dự

đoán Dòng đối chứng là chủng E coli BL21 mang vector pET22Trx cũng tổng hợp ra protein

Trx có kích thước 22 kDa

3.3 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG

E COLI

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện của gen ha5-l

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy cảm ứng ở nhiệt độ 22°C, 28°C, 30°C, 37°C và thu mẫu sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng

Hình 3.6: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E coli BL21 mang vector

pET22Trxha5-1 được cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các nhiệt độ khác nhau; 1-4 :

Nhiệt độ cảm ứng tương ứng 22oC, 28oC, 30oC, 37oC; 5:Thang protein chuẩn

kDa

116

66

45

35

25 18.4 14.4

1 2 3 4 5

TrxHA5-1

Hình 3.4: Protein tổng số từ các chủng tái tổ hợp E coli BL21; 1:

Thang Protein chuẩn (Fermentas); 2: E coli BL21 mang vector

pET22Trx; 3: E coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1

TrxHA5-1

Trx

1 2 3 kDa

116

66

45

35

25

18.4 14,4

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l

Khảo sát khả năng biểu hiện của protein TrxHA5-l ở nồng độ IPTG khác nhau (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; và 2 mM)

Như vậy để đảm bảo thu được lượng lớn protein, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất chúng tôi lựa chọn nồng độ IPTG là 0,5 mM để biểu hiện protein tái tổ hợp

3.3.3 Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp

Thu tế bào theo thời gian để kiểm tra lượng TrxHA5-1

Hình 3.8: Protein tổng số từ chủng E.coli BL21 mang vector

pET22Trxha5-1 được cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các thời gian thu

mẫu khác nhau; 1-5 : Thời gian thu mẫu 1, 2, 3, 4, 5 giờ; 6: Thang

protein chuẩn

Hình 3.7: Protein tổng số từ chủng E coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 được

cảm ứng ở các nồng độ IPTG khác nhau; 1-5 : Nồng độ chất cảm ứng IPTG tương

ứng 0,1mM, 0,5mM, 1 mM, 1,5 mM: 2 mM; 6: Thang protein chuẩn

kDa

116

66

45

35

25 18.4 14.4

TrxHA5-1

1 2 3 4 5

6

TrxHA5-1

1 2 3 4 5 6 kDa

116

66

45

35

25 18.4 14.4

Kết quả (Hình 3.8) cho thấy lượng protein thu được cao nhất sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng

3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1

Kết quả (Hình 3.9, đường chạy 3) cho thấy protein tái tổ hợp thu được sau khi loại bỏ pha tan là khá sạch, được thể hiện một băng protein có kích thước khoảng 57,5 kDa khá đậm và sạch hơn rất nhiều so với protein ban đầu

Đối với protein tái tổ hợp sử dụng trong vaccine, một điểm rất quan trọng là phải có tính kháng nguyên giống với tính kháng nguyên của protein tự nhiên Vì lý do này, protein sau khi tinh chế sẽ được tiến hành thử khả năng đáp ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 thu được từ thỏ bằng kỹ thuật Western blot

Trên hình 3.10 (B) thấy đường chạy số 3 là protein tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn

E coli BL21 mang vector pET22trx không mang gen ha5-l, không thấy sự xuất hiện của băng

Hình 3.9: Điện di kiểm tra Trxha5-1 tinh chế trên gel polyacrylamide; 1-

Protein tổng số E coli BL21 mang plasmid pETT22Trxha5-1;2-Thang

protein chuẩn; 3: phân đoạn chứa Trx-HA5-1 hòa tan trong urê 2 M

kDa

116

66

45

35

25 18.4 14.4

1 2 3

TrxHA5-1

A

B

Hình 3.10: Kiểm tra tính kháng nguyên của protein TrxHA5-1 tái tổ

hợp; (A) Phân tích protein trên gel điện di polyacrylamide; (B): Phân

tích khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp với kháng

thể kháng lại HA5 của virus cúm A/H5N1; 1- phân đoạn chứa

TrxHA5-1 sau khi tinh chế; 2 - Thang protein chuẩn; 3 - Protein tổng số E coli

BL21 mang plasmid pETT22Trx

1 2 3

TrxHA5-1

kDa

116

66

45

35

25 18.4 14.4

1 2 3

TrxHA5-1

kDa

116

66

35

25 18.4 14.4