Khảo sát quá trình tách và một số đặc trưng của canxi hydroxyapatite từ xương động vật

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, áp suất, chất phụ gia trong quá trình tách HA theo các phương pháp nêu trên.. Các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tổng hợp HA ở các dạng bột mịn v

Khảo sát quá trình tách và một số đặc trưng của canxi hydroxyapatite từ xương động vật

Nguyễn Văn Hưởng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Hóa học Luận văn ThS Chuyên ngành: Hóa vô cơ; Mã số: 60 44 25

Người hướng dẫn: PGS.TS Đào Quốc Hương

Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Khảo sát quá trình tách HA từ xương bò theo các phương pháp

nhiệt: ninh ở điều kiện bình thường; ninh trong điều kiện có chất phụ gia; ninh trong nồi áp suất Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, áp suất, chất phụ gia trong quá trình tách HA theo các phương pháp nêu trên Khảo sát một

số đặc trưng như XRD, FTIR, DTA-TGA, SEM và độ xốp tổng của bột HA thu được Xác định hàm lượng Ca và P, tỉ số mol Ca/P, hàm lượng kim loại nặng trong HA

Keywords: Hóa vô cơ; Xương động vật; Canxi; Kim loại nặng;

Chất phụ gia; Phương pháp nhiệt

Content

Trong các hợp chất vô cơ trong cơ thể người và động vật những hợp chất chứa

canxi và photpho đóng vai trò rất quan trọng Thuộc nhóm hợp chất này phải kể đến canxi hydroxyapatite Trong tự nhiên, apatit là tên chung của nhóm khoáng chất, chủ yếu chứa canxi florua photphat Ca5F(PO4)3 và một lượng nhỏ các khoáng trong đó F- được thay thế một phần hay hoàn toàn bởi Cl-, Br- hoặc OH- Canxi hydroxyapatite (hay còn được gọi là Hydroxyapatite, viết tắt là HA) là một dạng apatit trong đó nhóm OH

với công thức Ca5(PO4)3(OH) hay Ca10(PO4)6(OH)2 Trong cơ thể người và động vật HA là thành phần chính trong xương (chiếm đến 65 – 70 % khối lượng) và răng (chiếm 99%)

HA có các đặc tính quý giá như: có hoạt tính và độ tương thích sinh học cao với các tế bào và các mô, tạo liên kết trực tiếp với xương non dẫn đến sự tái sinh xương nhanh mà không bị cơ thể đào thải.… Do có cùng bản chất hoá học và cấu trúc, HA là dạng canxi photphat dễ hấp thu nhất đối với cơ thể con người và có tỷ lệ Ca/P đúng như tỷ lệ Ca/P tự nhiên trong xương và răng

Các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tổng hợp HA ở các dạng bột mịn và siêu mịn, dạng khối xốp, dạng màng bằng các phương pháp khác nhau và khảo sát các đặc tính để mở rộng khả năng ứng dụng của chúng

Ở dạng bột, các nhà nghiên cứu đang cố gắng điều chế HA kích thước nano (trong khoảng 20 – 100 nm) để góp phần nâng cao khả năng hấp thụ của cơ thể HA tự nhiên và nhân tạo ở dạng bột vi tinh thể cùng với một số khoáng chất khác đã được dùng trong bào chế thuốc chống loãng xương và thực phẩm chức năng bổ sung canxi, xử lý các khuyết tật trong xương do chấn thương… HA bột cũng có thể được dùng bổ sung canxi trong nước giải khát

Ở dạng màng, một lớp HA siêu mịn, mỏng phủ trên xương nhân tạo có thể tăng cường khả năng liên kết giữa xương nhân tạo với mô và xương tự nhiên

HA dạng xốp được ứng dụng để sửa chữa các khuyết tật của xương và răng Ngoài

ra, các nghiên cứu cho thấy, HA xốp còn được sử dụng làm chất truyền dẫn thuốc do bền trong các dịch sinh lý của cơ thể, có tác dụng nhả chậm các dược chất đi kèm với nó

Ở nước ta, việc nghiên cứu chế tạo và khảo sát khả năng ứng dụng trong y sinh học nói chung và dược phẩm nói riêng chưa được quan tâm nhiều Từ năm 2005, nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Hoá Vô cơ, Viện Hoá học (Viện KH&CN Việt Nam) đã thực hiện các nghiên cứu về vật liệu HA dạng bột và dạng xốp đã và đang hướng đến ứng dụng trong dược học và y sinh học

Phòng Hóa Vô Cơ, Viện Hóa Học (Viện KH&CN Việt Nam) đã chế tạo HA dạng bột và dạng khối xốp bằng các phương pháp khác nhau Để góp phần hoàn thiện các

nghiên cứu về chế tạo HA nhân tạo và tự nhiên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Khảo sát quá

trình tách và một số đặc trưng của canxi hydroxyapatite từ xương động vật” Đề tài

có mục đích tách HA từ xương động vật, cụ thể là xương bò và khảo sát một số đặc tính của HA thu được Đề tài tập trung khảo sát các nội dung sau:

- Khảo sát quá trình tách HA từ xương bò theo các phương pháp nhiệt: ninh ở điều kiện bình thường; ninh trong điều kiện có chất phụ gia; ninh trong nồi áp suất

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, áp suất, chất phụ gia trong quá trình tách HA theo các phương pháp nêu trên

- Khảo sát một số đặc trưng như XRD, FTIR, DTA-TGA, SEM và độ xốp tổng của bột HA thu được

- Xác định hàm lượng Ca và P, tỉ số mol Ca/P, hàm lượng kim loại nặng trong HA

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tính chất của hyđroxyapatit

1.1.1 Tính chất vật lý

Hydroxyapatite (HA), Ca10(PO4)6(OH)2, có màu trắng, trắng ngà, vàng nhạt hoặc xanh lơ, tuỳ theo điều kiện hình thành, kích thước hạt và trạng thái tập hợp HA có nhiệt

độ nóng chảy 17600

C và nhiệt độ sôi 28500C, độ tan trong nước 0,7 g/l, khối lượng mol phân tử 1004,60 g, khối lượng riêng là 3,156 g/cm3, độ cứng theo thang Mohs bằng 5 Các tinh thể HA tự nhiên và nhân tạo, tùy thuộc vào điều kiện hình thành mà có thể tồn tại ở các dạng hình que, hình kim, hình vảy,… [3] Sử dụng phương pháp hiển vi điện tử

SEM hoặc TEM có thể nhận biết được các dạng tồn tại của tinh thể HA 1.1.2 Tính chất

hoá học

HA không phản ứng với kiềm nhưng phản ứng với các axit tạo thành muối canxi và nước:

Ca10(PO4)6(OH)2 + 2HCl  3Ca3(PO4)2 + CaCl2 + 2H2O (1)

HA tương đối bền nhiệt, bị phân huỷ chậm trong khoảng nhiệt độ từ 8000C đến

12000C tạo thành oxy-hydroxyapatite theo phản ứng:

Ca10(PO4)6(OH)2  Ca10(PO4)6(OH)2-2xOx + xH2O (0  x  1) (2)

Ở nhiệt độ lớn hơn 12000C, HA bị phân huỷ thành β - Ca3(PO4)2 (β – TCP) và

Ca4P2O9 hoặc CaO:

Ca10(PO4)6(OH)2  2β – Ca3(PO4)2 + Ca4P2O9 + H2O (3)

Ca10(PO4)6(OH)2  3β – Ca3(PO4)2 + CaO + H2O (4)

1.1.3 Tính chất sinh học

Như đã trình bày ở trên, do có cùng bản chất và thành phần hoá học, HA tự nhiên

và nhân tạo đều là những vật liệu có tính tương thích sinh học cao Ở dạng bột mịn kích thước nano, HA là dạng canxi photphat dễ được cơ thể hấp thụ nhất với tỷ lệ Ca/P trong phân tử đúng như tỷ lệ trong xương và răng Ở dạng màng và dạng xốp, HA có thành phần hoá học và các đặc tính giống xương tự nhiên, các lỗ xốp liên thông với nhau làm cho các mô sợi, mạch máu dễ dàng xâm nhập Chính vì vậy mà vật liệu này có tính tương thích sinh học cao với các tế bào và mô, có tính dẫn xương tốt, tạo liên kết trực tiếp với xương non dẫn đến sự tái sinh xương nhanh mà không bị cơ thể đào thải Ngoài ra, HA là hợp chất không gây độc, không gây dị ứng cho cơ thể người và có tính sát khuẩn cao

Hợp chất HA tương đối bền với dịch men tiêu hoá, ít chịu ảnh hưởng của dung dịch axit trong dạ dày Ở dạng bột mịn kích thước nano, HA được cơ thể người hấp thụ rất nhanh qua niêm mạc lưỡi và thực quản Vì những đặc tính này, bột HA kích thước nano được dùng làm thuốc bổ sung canxi với hiệu quả cao

Để chế tạo vật liệu HA có tính tương thích sinh học cao và phù hợp với mục đích

ứng dụng trong y sinh học và dược học, cần chọn lựa quy trình chế tạo chúng bằng phương pháp hóa học hay tách từ xương động vật

1.2 Ứng dụng của HA

1.2.1 Ứng dụng của HA bột

Do lượng canxi hấp thụ thực tế từ thức ăn mỗi ngày tương đối thấp nên rất cần bổ sung canxi cho cơ thể, đặc biệt cho trẻ em và người cao tuổi Canxi có trong thức ăn hoặc thuốc thường nằm ở dạng hợp chất hoà tan nên khả năng hấp thụ của cơ thể không cao và thường phải dùng kết hợp với vitamin D nhằm tăng cường việc hấp thụ và chuyển hoá canxi thành HA Có thể bổ sung canxi cho cơ thể người bằng cách dùng thức ăn, thuốc tiêm hoặc truyền huyết thanh… Một phương pháp hữu hiệu là sử dụng HA tự nhiên hoặc nhân tạo ở dạng bột mịn, kích thước nano để bổ sung canxi [10] Với kích thước cỡ 20 –

100 nm, HA được hấp thụ trực tiếp vào cơ thể mà không cần phải chuyển hoá thêm

Để chữa trị căn bệnh loãng xương, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) đã cho phép sử dụng HA trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng Nhiều loại thuốc và thực phẩm bổ sung canxi có sử dụng HA đã được lưu hành trên thị trường

Trong số đó có thể kể đến Ossopan của Pháp, Bone Booster Complex, Bone Dense Calcium của Mỹ, Calcium Complex của Anh, SuperCal của New Zealand

Hình 1.4 là hình ảnh của một số loại thực phẩm chức năng và thuốc bổ sung canxi

sử dụng HA bột tự nhiên hoặc nhân tạo ở dạng vi tinh thể đang được lưu hành trên thị trường

1.2.2 Ứng dụng của HA dạng màng

Lớp màng HA có chiều dày cỡ µm được phủ lên bề mặt vật liệu nhân tạo như hợp kim Ti6Al4V bằng các phương pháp plasma, bốc bay, điện phân… đã hạn chế những nhược điểm như bị ăn mòn, tạo ra các chất độc hại, liên kết lỏng lẻo giữa xương tự nhiên

và chi tiết cấy ghép… Tuy vậy, độ bám dính của lớp màng trên vật liệu nền vẫn không thật bền chặt, do vậy tuổi thọ và phạm vi ứng dụng của chúng không cao

Để cải thiện độ bám dính, người ta đã phủ lên các kim loại và hợp kim nền một lớp màng gốm HA có chiều dày cỡ nm (màng n – HA) bằng phương pháp điện hoá nói chung

và phương pháp điện di (Electrophoretic Deposition, EPD) Lớp màng n – HA có độ bám dính cao với vật liệu nền (> 60MPa) và rất bền theo thời gian Công nghệ màng n – HA

đã tạo ra những chi tiết xương nhân tạo có khả năng tự liên kết với xương và mô tự nhiên,

có tính tương thích sinh học cao với cơ thể con người

1.2.3 Ứng dụng của HA dạng xốp

Như đã trình bày ở trên, vật liệu gốm xốp HA có tính tương thích sinh học cao, có nhiều lỗ liên thông với nhau, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của mô sợi và mạch máu, có tính dung nạp tốt, không độc, không dị ứng Nhờ có khả năng đặc biệt này mà ngày nay,

HA dạng gốm xốp được ứng dụng đặc biệt rộng rãi trong y sinh học

- Chế tạo mắt giả

HA xốp tổng hợp từ san hô có cấu trúc xốp bền vững, nhẹ và đặc biệt là có khả năng thích ứng cao với cơ thể Việc sử dụng loại vật liệu này đã khắc phục được hiện tượng sụp mi do trọng lượng, hạn chế các phản ứng của cơ thể và làm tăng thời gian sử dụng của mắt giả [14]

- Chế tạo những chi tiết để ghép xương và sửa chữa những khuyết tật của xương

1.2.4 Ứng dụng của HA dạng compozit

- Bản chất của gốm xốp và màng HA là có độ bền cơ học thấp Một giải pháp để tăng độ bền cơ học là tạo ra một tổ hợp gốm compozit bằng cách phân tán HA bột vào các polyme sinh học như collagen, chitosan, xenlulo, đường sacaro

1.4 Các phương pháp tổng hợp HA

Phương pháp ướt

Phương pháp khô

1.5 Một số phương pháp nghiên cứu vật liệu HA

1.5.1 Phương pháp nhiễu xạ tia X (X – Ray Diffraction, XRD)

1.5.2 Phương pháp phổ hồng ngoại (Fourier Transformation Infrared Spectrophotometer, FTIR)

1.5.3 Phương pháp hiển vi điện tử

1.5.4 Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng

1.5.5 Tách HA từ xương động vật băng phương pháp đông khô

1.6 Xác định độ xốp tổng của các mẫu HA theo trọng lượng riêng

1.7 Vai trò của xương trong cơ thể người và động vật

1.8 Khái quát về chất phụ gia thực phẩm

1.8.1 Định nghĩa

Theo định nghĩa của Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc (FAO), phụ gia thực phẩm là chất không dinh dưỡng được thêm vào các sản phẩm với các ý định khác nhau Thông thường, các chất này có hàm lượng thấp dùng để cải thiện tính chất cảm quan, cấu trúc, mùi vị cũng như bảo quản sản phẩm

Còn theo định nghĩa của Viện Thông tin Y học Trung ương, phụ gia thực phẩm là một chất có hay không có giá trị dinh dưỡng, không được tiêu thụ thông thường như một thực phẩm Nó là một chất chủ ý bổ sung vào thực phẩm để giải quyết mục đích công nghệ trong sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nhằm cải thiện kết cấu hoặc đặc tính kĩ thuật của thực phẩm đó

1.8.2 Tầm quan trọng của việc sử dụng phụ gia trong thực phẩm

Phụ gia góp phần điều hòa nguồn nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất thực phẩm, tạo được nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của người tiêu dùng Giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho tới khi sử dụng, kéo dài thời gian sử dụng ủa thực phẩm Tạo sự dễ dàng trong sản xuất, chế biến thực phẩm va làm tăng giá trị thương phẩm trên thị trường đồng thời làm giảm phế liệu trong các công đoạn sản xuất

Những nguy hại của phụ gia thực phẩm: Sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lượng, chủng loại nhất là phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây hại cho sức khỏe như gây ngộ độc cấp tính, nếu dùng quá liều cho phép sẽ gây ngộ độc mạn tính, dù dùng liều lượng nhỏ, thường xuyên, liên tục một chất phụ gia thực phẩm tích lũy trong cơ thể, gây tổn thương lâu dài

1.8.3 Phụ gia natri bicacbonat

Natri hiđrocacbonat hay natri bicacbonat là tên gọi phổ biến trong hóa học, còn tên thường gọi bình dân là bột nở, bột nổi, thuốc sủi có công thức hóa học là NaHCO3 Thường ở dạng bột mịn, màu trắng, dễ hút ẩm, tan nhanh trong nước, có đặc tính không mùi, không vị, khi có sự hiện diện của ion H+ khí CO2 sẽ phát sinh và thoát ra NaHCO3

là phụ gia phổ biến, không có tính độc và nằm trong danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong các ngành công nghiệp hóa chất, thực phẩm, dược phẩm

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2 2 Nghiên cứu quy trình tách bột HA

2.2.1 Chuẩn bị phụ gia

Tiến hành pha dung dịch NaHCO3: Hòa tan 1,14 g NaHCO3 trong 1,0 lít nước cất, được dung dịch NaHCO3 0,114%

2 2 2 Lấy mẫu và sơ chế mẫu

Tiến hành khảo sát trên xương ống của con bò ở hai vị trí khác nhau là thân xương

và đầu xương Xương bò tự nhiên chưa qua xử lí, loại bỏ phần thịt, mỡ và lớp màng bám bên ngoài xương, sau đó cưa và cắt xương thành những khối nhỏ có kích thước khoảng 4

x 6 x 6 mm

Xương sau khi được cắt, đem rửa bằng etanol và nước cất để làm sạch, loại bỏ các tạp chất cơ học và các hợp chất hữu cơ, rồi tiến hành ninh mẫu ở các điều kiện nhiệt độ,

áp suất và với phụ gia NaHCO3

2 3 Phương pháp tiến hành

Việc tách HA từ phần thân xương và đầu xương của xương bò tự nhiên được tiến hành bằng phương pháp ninh, dưới ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, áp suất và chất phụ gia

Phương pháp 1: Ninh mẫu xương ở điều kiện áp suất thường, không có phụ gia Phương pháp 2: Ninh mẫu xương ở điều kiện áp suất thường, có phụ gia

Phương pháp 3: Ninh mẫu xương ở điều kiện trong nồi áp suất, không có phụ gia

2 4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình tách HA

2 4 1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình tách HA, ở điều kiện áp suất thường, không có phụ gia

2 4 2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình tách HA, ở điều kiện áp suất thường, có chất phụ gia

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả các mẫu HA nguyên bản

Kết quả phân tích các mẫu HA của xương nguyên bản, với mục đích là để đánh giá

và so sánh với các sản phẩm HA tách từ xương trong các điều kiện khác nhau

Các mẫu HA nguyên bản được khảo sát bằng phương pháp XRD, FTIR, SEM, phân tích nhiệt, thành phần hóa học và độ xốp tổng

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình tách HA, ở điều kiện áp suất thường, không có phụ gia

Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian ninh đến độ đơn pha, độ tinh thể và trạng thái tập hợp hạt của bột HA Các thí nghiệm được thực hiện ở áp suất thường, không có phụ gia, một số mẫu đem nung ở 700 0 C, với thời gian khác nhau Sản phẩm HA được khảo sát bằng các phương pháp XRD, FTIR, SEM, phân tích nhiệt và độ xốp tổng

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình tách HA, ở điều kiện áp suất thường, có chất phụ gia

Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến độ đơn pha, độ tinh thể của sản phẩm HA

trong quá trình tách Các thí nghiệm được khảo sát ở điều kiện áp suất thường, có phụ gia với thời gian khác nhau, một số mẫu nung ở 700 0 C trong 2 giờ Sản phẩm HA được khảo sát bằng các phương pháp XRD, FTIR và độ xốp tổng

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình tách HA, ở điều kiện trong nồi

áp suất, không có phụ gia

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ninh mẫu đến độ đơn pha, độ tinh thể và trạng

thái tập hợp hạt của sản phẩm HA Các thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện trong nồi

áp suất1,7 atm, nhiệt độ khoảng 120 0 C, không có phụ gia với thời gian khác nhau, một số mẫu đem nung ở 700 0 C trong 2 giờ Sản phẩm HA được khảo sát bằng các phương pháp XRD, FTIR, SEM, phân tích nhiệt, phân tích thành phần hóa học và độ xốp tổng

3.5 Sản phẩm HA tách ra ở thân xương

3.5.1 Giản đồ XRD

Giản đồ XRD của các mẫu HA nung trong 2 giờ ở 7000C, được tách ra theo các phương pháp khác nhau

3.5.2 Phổ FTIR

Phổ XRD của một số mẫu HA đem nung ở 7000C trong 2 giờ, tách ra ở thân xương khảo sát ở các điều kiện khác nhau

3.5.3 Ảnh SEM

Ảnh SEM của mẫu HA ninh đến nhừ ở điều kiện áp suất thường, không có phụ gia (T6.a, T6.b, T6.c) và ninh trong nồi áp suất, không có phụ gia (A6.a, A6.b, A6.c) sau đó nung ở 7000C trong 2 giờ

3.6 Đặc trƣng nhiệt – trọng lƣợng của các mẫu HA

Kết qua giản đồ nhiệt - trọng lượng (TGA, DTA) của các mẫu HA T5 và NB2

3.7 Phân tích thành phần hóa học và các kim loại nặng

3.7.1 Kết quả thành phần chínhcủa một số sản phẩm HA

Bảng 3.4: Hàm lượng Ca, P và tỉ lệ mol Ca : P của các mẫu HA: NB1, A2, A6 3.7.2 Kết quả hàm lượng các kim loại nặng có trong một số sản phẩm HA

Bảng 3.5: Chỉ tiêu phân tích các kim loại nặng của các mẫu HA: NB1, A2 và A6 3.8.1 Độ xốp tổng của các mẫu HA tách ra ở hai đầu xương

Bảng 3 6: Độ xốp tổng của các mẫu HA NB3, T3, P3 và A3 tách ra ở hai đầu xương 3.8.2 Độ xốp tổng của các mẫu HA tách ra ở thân xương

Bảng 3.7: Độ xốp tổng của các mẫu HA tách ra ở thân xương

KẾT LUẬN CHUNG

1 Đã tách được bột HA từ nguyên liệu là xương động vật, cụ thể là xương bò

2 Đã sử dụng các phương pháp vật lý như nhiễu xạ tia X (XRD), phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR), phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM), phương pháp phân tích nhiệt - trọng lượng (DTA, TGA), để khảo sát chất lượng sản phẩm HA trong quá trình tách Dựa vào giản đồ XRD đã xác định được độ tinh thể của sản phẩm HA, tính toán theo phương pháp phân giải pic Áp dụng công thức Scherrer đã tính được kích thước hạt trung bình của sản phẩm

3 Đã khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố như: Nhiệt độ, phụ gia, áp suất, đến thời gian ninh mẫu, độ đơn pha và độ tinh thể của sản phẩm HA Kết quả cho thấy: