Hoàn thiện công nghệ sản xuất nấm men đối kháng kết hợp với màng bao ăn được để bảo quản quả thanh long

Xác định khả năng ức chế các loại nấm mốc chính gây thối hỏng quả thanh long như: Aspergillus niger và Colletotrichum gloeosporioid es của các chủng nấm men Candida sake phân lập được.

Hoàn thiện công nghệ sản xuất nấm men đối kháng kết hợp với màng bao ăn được để

bảo quản quả Thanh Long

Nguyễn Tiến Khương

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học; Mã số:60 42 40

Người hướng dẫn:GS-TS Nguyễn Thùy Châu

Năm báo vệ: 2011

Abstract Phân lập các chủng nấm men Candida sake đối kháng từ các nguồn quả tươi như: táo, lê thu thâ ̣p được từ các nguồn tro ng nước và nước ngoài Định loại các chủng nấm men có khả năng ức chế nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long Xác định khả năng ức chế các loại nấm mốc chính gây thối hỏng quả thanh long như: Aspergillus niger và Colletotrichum gloeosporioid es của các chủng nấm men Candida sake phân lập được Nghiên cứu khảo sát các yếu tố công nghê ̣ thích hợp cho sản xuất sinh khối chủng nấm men Candida sake có hoa ̣t tính đối kháng cao phân lâ ̣p được Tiến hành bảo quản thử nghiê ̣m chế phẩm nấm men Candida sake có hoạt tính đối kháng cao kết hợp với màng bao ăn được CT 27 cải tiến và nhiệt độ lạnh 8-100C.ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô lớn(hay mô hình thực tế)

Keywords Vi sinh vật; Nấm men; Quả thanh long

Content:

Để nâng cao hiệu quả bảo quản thanh long của chế phẩm nấm men đối kháng

Candida sake kết hợp với màng bao ăn được cần phải phân lập được chủng nấm men Candida sake có khả năng ức chế mạnh được cả 2 loài nấm mốc A.niger và Colletotrichum gloeosporioides gây thối hỏng thanh long Do đó chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài:“Hoàn thiện công nghệ sản xuất nấ m men đối kháng kết hợp

với màng bao ăn được để bảo quản thanh long”

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Phân lập và lựa chọn đươc một đến hai chủng nấm men Candida sake có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của nấm mốc Aspergillus niger và Colletotrichum gloeosporioides gây thối hỏng quả thanh long

- Hoàn thiện được công nghệ sản xuất màng bao ăn được và nấm men Candida sake đối kháng để kéo dài thời gian bảo quản quả thanh long được 30 ngày ở điều

kiện nhiệt độ từ 8 đến 10o

C

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân lập các chủng nấm men Candida sake đối kháng từ các nguồn quả tươi

như: táo, lê thu thâ ̣p được từ các nguồn trong nước và nước ngoài

- Định loại các chủng nấm men có khả năng ức chế nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long

- Xác định khả năng ức chế các loa ̣i nấm mốc chính gây thối hỏng quả thanh

long như: Aspergillus niger và Colletotrichum gloeosporioides của các chủng nấm men Candida sake phân lập được

- Nghiên cứ u khảo sát các yếu tố công nghê ̣ thích hợp cho sản xuất sinh khối

chủng nấm men Candida sake có hoạt tính đối kháng cao phân lập được

- Tiến hành bảo quản thử nghiê ̣m chế phẩm nấm men Candida sake có hoạt

tính đối kháng cao kết hợp với màng bao ăn được CT 27 cải tiến và nhiệt độ lạn h

8-100C.ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô lớn(hay mô hình thực tế)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

Biê ̣n pháp sinh học trong bảo quản rau quả

Các loại nấm mốc thường gây thối hỏng ở các loại quả như: Asperigllus, Cladosporium, Botritis Cinerea, các loài khác nhau của chi Altenaria, Aspergillus, Cladosporium, Colletotrichum, Phomopsis, nấm Fusarium gây bệnh thối hỏng ở quả vải, nấm Penicillium, Phoma, Phytophthora, Pithyum và Rhizopus gây bệnh thối hỏng ở cam, Ceratocystis fimbriata, Rhizoctonia solani, Sclerotoni sclerotonum, nấm mốc gây bệnh thối hỏng ở xoài như gleosporoinos Những loài nấm này đã gây

nhiều tổn thất cho các loài quả khác nhau

Việc sử dụng hiện tượng đối kháng sinh học trong công tác bảo quản được gọi là biện pháp bảo quản sinh học bằng vi sinh vật đối kháng Trong quần thể vi sinh vật, mỗi loài đều phải đấu tranh sinh tồn suốt cả quá trình tiến hóa dưới các

hình thức khác nhau và rất linh hoạt Vi sinh vật có thể thay thế các tác nhân cạnh tranh của chúng bằng cách nhân lên với số lượng lớn bằng cạnh tranh về môi trường dinh dưỡng và không gian sống

Candida sake là một loài thuộc chi Candida có khả năng ức chế các nấm mốc

trên quả Candida sake là nấm men thường được tìm thấy ở bia, rượu, các loại hoa, các loại rau, các loại nấm ăn, dịch hoa quả Chủng nấm men Candida sake có khả

năng ức chế nấm mốc gây thối hỏng quả nhờ có hoạt tính enzyme ngoại bào như protease, chitinase… có khả năng phân huỷ thành tế bào nấm mốc trên quả Đây là

cơ sở để tạo các chế phẩm nấm men đối kháng dùng trong bảo quản quả

Tình hình sản xuất và bảo quản thanh long ở Việt Nam

Chúng có tên gọi khoa học như sau: Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus, ruột trắng với vỏ hồng hay đỏ Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus, ruột đỏ với vỏ hồng hay đỏ Hylocereus megalanthus, trước đây được coi là thuộc chi

Selenicereus, ruột trắng với vỏ vàng Gần đây, thanh long ruột đỏ được nhiều người tiêu thụ quan tâm do chứa nhiều vi lượng có giá trị chống oxy hóa và tác nhân chống bệnh ung thư

Các thông số độ chín thu hoạch quả thanh long

Tên Chỉ tiêu Giá trị

Độ tuổi của quả Từ 25 đến 43 ngày (tối ưu là 30 đến 33

ngày) Độ cứng Nhỏ hơn 0,85kg/cm

Màu sắc Xuất hiên 1/3 màu đỏ

Chất khô hòa tan Lớn hơn 11%

Các bệnh thường gặp va ̀ các biê ̣n pháp phòng trừ sau khi thu hoạch thanh long

Các loại nấm mốc Aspergillus niger, Aspergillus flavus , Penicillium, Colletotrichum gloeosporioides là những loại chính gây thối hỏng thanh long

 Loại nấm mốc Aspergillus niger chiếm tỉ lê ̣ lớn nhất , là nguyên nhân

chính gây thối hỏng Thanh long

 Nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bê ̣nh thán thư trên quả thanh

long

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp phân lập nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long

Phương pháp phân lập nấm men đối kháng

Phương pháp tuyển chọn chủng nấm men đối kháng nấm mốc gây thối hỏng thanh long

Phương pháp định loại các chủng nấm men Candida sake đối kháng dùng trong bảo quản thanh long

Để định loại các chủng nấm men Candida sake đối kháng tiến hành giải trình

tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 và 26S rRNA của các chủng nấm men phân lập

được và sử dụng phần mềm FASTA để so sánh với trình tự các đoạn gen này của chủng nấm men trong ngân hàng gen thế giới

Nghiên cứu công nghê ̣ nhân nuôi nấm men Candida sake quy mô phòng thí nghiê ̣m Phương pháp tạo màng bao ăn được

Phương pháp tạo chế phẩm nấm men đối kháng Candida sake ở quy mô phòng thí nghiệm

Phương pháp bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu quả bảo quản thanh long của các công thức màng bao

Phương pháp đi ̣nh lượng mật độ vi sinh vật trong các mẫu nghiên cứu

Xác định mức độ ngăn cản trao đổi hơi nước qua màng

Xác định mức độ ngăn cản trao đổi khí

Phương pháp đánh giá cảm quan

Phương pháp bố trí thí nghiệm bảo quản quả thanh long bằng chế phẩm Candida sake kết hợp với chế phẩm màng bao ăn được ở quy mô phòng thí nghiệm và qui mô lớn

Phương pháp xử lý số liệu theo phần mềm Microsoft Excel

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập chủng nấm men đối kháng

Kết quả phân lập củng nấm men đối kháng

Nguồn phân lập Số

mẫu

Số chủng nấm men đối kháng phân lập

Tỷ lệ chủng nấm men đối kháng / số

đƣợc mẫu thu thập (%)

Lê

Táo

Hình 1: Hình thái khuẩn lạc của nấm men đối kháng

Đánh giá khả năng ức chế nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long của các chủng nấm men đối kháng phân lập được:

Khả năng ức chế nấm mốc A.niger gây thối hỏng quả Thanh long của các chủng

nấm men đối kháng phân lập được

Tổng số chủng

Candida phân lập

được

Khả năng ức chế nấm mốc A.niger ở các mức độ khác nhau

Số chủng ức chế ở mức độ yếu

Số chủng ức chế ở mức độ trung bình

Số chủng ức chế ở mức độ mạnh

Kết quả cho thấy có 2 chủng nấm men có khả năng ức chế mạnh nấm A.niger sau 7 – 8 ngày nấm A.niger vẫn chưa mọc lại

Hình 2: Nấm mốc A.niger bị ức chế hoàn toàn bởi chủng nấm men L1.5.4 đối kháng Khả năng ức chế nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides gây thối hỏng Thanh

long của các chủng nấm men đối kháng phân lập được

Tổng số chủng

Candida phân lập

được

Khả năng ức chế nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides ở

các mức độ

Số chủng ức chế

ở mức độ yếu

Số chủng ức chế ở mức độ trung bình

Số chủng ức chế ở mức độ mạnh

Kết quả cho thấy chỉ có 1 chủng nấm men ức chế được cả 2 loại nấm mốc

Colletotrihcum gloeosporioides và A.niger ở mức độ mạnh là ức chế sau 7 ngày mà

cả 2 loại nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides và A.niger đều không mọc trở lại

Hình 3: Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides bị ức chế hoàn toàn bằng chủng

nấm men L1.5.4đối kháng

Hình 4: Hình tế bào nấm men đối kháng L1.5.4 phân lập từ quả lê

- Đặc điểm sinh hóa của chủng Candida spp L1 5.4 tuyển chọn được

Khả năng lên men các loại đường

Tên

chủng

Khả năng lên men loại đường Hoạt tính

Urease Glucose Maltose Sucrose Lactose

Candida

sake L1

5.4

3.2 Định loại chủng nấm men đối kháng

Trình tự đoạn gen mã hóa rRNA ITS và 2,5s của chủng nấm men đối kháng đã

được xác định thông cả hai chiều Kết quả trình tự như sau

ID CsVn_ITS PRELIMINARY; DNA; 708 BP

SQ SEQUENCE 708 BP; 212 A; 139 C; 156 G; 201 T;

CCGTAGGTGA CCCTGCGGAA 60

AAATCTGCGT AAGCCGAGTT GTAATTTGAA GATGGCTACT

3.3 Đánh giá hiệu quả bảo quản của các công thức màng bao

3.3.1 Kiểm tra khả năng sống sót của nấm men Candida sake L1.5.4 trên các công

thức màng bao

Khả năng sống sót của chủng Candida sake L1.5.4 trên các công thức màng

bao khác nhau

Công thức màng bao Mật độ tế bào nấm men Candida sake L1.5.4(CFU/ml)

1 tháng 3 tháng 6 tháng Màng bao Chitosan 1,81.108 2,12.107 6,1.106 Màng bao CT27 2,19.108 7,3.107 1,23.107 Màng bao CT27 cải tiến 2,86.108 1,05.108 0,59.108

3.3.2 Hiệu quả bảo quản quả thanh long của các công thức màng bao

Hiệu quả bảo quản quả Thanh long bằng các màng bao khác nhau

Tên lô

thí

nghiệm

Chỉ tiêu Thời gian

bảo quản

(ngày)

Hao hụt khối lương(%)

Biến đổi màu sắc

Cường độ

hô hấp (mgCO2/k g/h)

Độ

cứng Cảm quan

Đối

chứng 30 6,15 11,9 32,4 Mềm Hỏng

Màng

Chitosan 30 3.48 6,25 18,6

Quả hơi mềm

Ngọt nhưng mất mùi vi ̣ ban đầu

Màng

CT27 30 3,15 5,2 21.5

Quả cứng Vị ngọt đậm Màng

CT27

cải tiến

30

2,29 5,15 20,9

Quả cứng Vị ngọt đậm

Kết luận: Từ kết quả so sánh hiệu quả bảo quản của 3 loại màng: màng CT27,

CT27 cải tiến và màng Chitosan cho thấy màng CT27 cải tiến cho hiệu quả bảo quản quả thanh long tốt nhất

3.4 Kết quả khảo sát yếu tố nhân nuôi thích hợp chủng nấm men Candida sake

L1.5.4

Chỉ tiêu theo

dõi

Môi trường nuôi cấy PH Nhiệt độ Oxy hòa tan

Giá trị thích

hợp Malt 6,5 30oC 100%

3.5 Kết quả thử nghiệm bảo quản quả thanh long bằng chế phẩm Candida sake L1.5.4 đối kháng kết hợp với màng bao ăn đƣợc CT27 cải tiến ở quy mô phòng

thí nghiệm

: Hiệu quả bảo quản quả thanh long ở nhiệt độ thường (25 – 280C) bằng chế phẩm

nấm men Candida sake L1.5.4 kết hợp với màng bao ăn được CT27 cải tiến

Chỉ tiêu Lô đối chứng Lô thí nghiệm

Thời gian bảo quản 10 ngày 10 ngày

Mức độ mốc mọc trên quả

(%) với P>95%

97 - 98 7 - 8

Độ cứng của quả Quả mềm Quả cứng

Màu sắc của quả Quả thâm đen Quả màu đỏ

Tai quả Vàng, mềm Xanh, cứng

Độ ngon ngọt Thối ủng Vị ngọt đậm

Tỷ lệ thối hỏng (%) 96 - 97 6 - 7

Hiệu quả bảo quản quả thanh long bằng chế phẩm nấm men Candida sake L1.5.4

đối kháng kết hợp với màng bao ăn được ở nhiệt độ lạnh 8 - 100

C

Chỉ tiêu Lô đối chứng Lô thí nghiệm

Thời gian bảo quản 30 ngày 30 ngày

Mức độ mốc mọc trên

quả (%) với P>95%

65 - 66 1- 1,5

Độ cứng của quả Quả mềm Quả cứng

Màu sắc của quả Quả thâm đen Quả đỏ màu sắc đều

Tai quả Vàng, mềm Xanh, cứng

Độ ngon ngọt Vị nhạt Vị ngọt đậm

Tỷ lệ thối hỏng (%) 65 - 66 0,5 - 1

3.6 Kết quả xây dựng mô hình bảo quản quả thanh long bằng chế phẩm nấm

men đối kháng Candida sake kết hợp với màng bao ăn đƣợc tại Bình Thuận

3.6.1 Mô hình công ty Rau quả Bình Thuận

Nhận xét sau 37 ngày thanh long được bảo quản

Về hình thái bên ngoài:

Thí nghiệm 1: Màu vỏ bóng đẹp, nhưng có một số quả tai bị vàng

Thí nghiệm 2: Màu vỏ bóng, tai xanh nhưng đầu trái có hiện tượng nhăn lại

Thí nghiệm 3: Tai xanh, cứng, vỏ quả tươi bình thường, hình dạng quả giử nguyên khoảng 75 % so với ban đầu

Đối chứng:Tai héo, đầu trái tóp lại vỏ quả không tươi như những thí nghiệm

trên

Về thịt quả: Về thịt quả thì không thấy sự khác biệt giữa các thí nghiệm, mùi vị

và độ cứng đều như nhau

Kết luận: Thí nghiệm 3 là thí nghiệm có ưu việt nhất

Ngoài ra thí nghiệm 1 và 2 ngăn ngừa không cho một số nấm phát sinh trong thời gian bảo quản

3.6.2 Mô hình tại công ty TNHH Lộc Tú

Nhận xét kết quả thử nghiệm:

Sau 23 ngày bảo quản ở nhiệt độ 5 đến 6oC có bọc túi polyetylen đục lỗ, các công thức thí nghiệm 1,2,3,4 cho kết quả tốt hơn so với mẫu đối chứng và mẫu sử dụng chế phẩm bảo quản UMIKAI, trong đó công thức 2 là tốt nhất Sau 30 ngày bảo quản độ tươi của quả, màu sắc quả giảm đi so với ban đầu tuy nhiên không vẫn đảm bảo giá trị thương phẩm các mẫu đối chứng và mẫu bảo quản bằng chế phẩm UMIKAI đều bị thối hỏng nhiều

3.6.3 Mô hình tại công ty trách nhiệm hữu hạn Lan Anh

Kết quả sau 28 ngày bảo quản cho thấy:

Thí nghiệm 1: Màu vỏ trái bóng, có khoảng 20% số trái tai vàng nhẹ

Thí nghiệm 2: Màu vỏ đẹp, tai hơi vàng

Thí nghiệm 3: Làm trên cả lành và trái mang mầm bệnh Kết quả cho thấy màu đỏ của vỏ trái đẹp,bóng,tai hơi vàng nhẹ Nấm bệnh không phát triển mà khô, teo lại Thí nghiệm 4: màu vỏ bóng, có 25% số trái tai vàng nhẹ

Các mẫu đối chứng sử dụng Umikai và Longlife : Tai héo, đầu trái tóp lại, vỏ quả không còn tươi

Kết luận của công ty TNHH Lan Anh:

Qua các thí nghiệm, công ty nhận thấy : thí nghiệm 3 sử dụng 1 lít nấm men Candida sake và 3 lít nước là khả quan và ưu việt nhất vì ngăn ngừa không cho nấm bệnh trên trái thanh long phát triển

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN

 Phân lập, định loại được chủng nấm men Candida sake L1.5.4 có khă năng

ức chế tốt với Colletotrichum gloeosporioides và A.niger

 Xác định được các yếu tố công nghê ̣ thích hợp cho nhân nuôi chủng nấm men

Candida sake L1.5.4 cho sản lươ ̣ng sinh khối lớn nhất trong điều kiện : môi trường malt, pH=6,5; nhiê ̣t đô ̣ 30oC, độ ôxi hòa tan 100%

 Đã tạo được màng bao Chitosan và màng bao CT27 cải tiến phù hợp với bảo quản trái thanh long

 Lựa chọn phương pháp nhúng chế phẩm cho thực tiễn bảo quản thanh long ở qui mô lớn

 Thanh long bảo quản bằng chế phẩm nấm men đối kháng Candida sake

L1.5.4 kết hợp với màng bao ăn được CT27 cải tiến ở điều kiện nhiệt độ lạnh

8 – 10oC được 30 ngày

References :

1 Tiếng viê ̣t

[1]: Nguyễn Thùy Châu và cô ̣ng sự Viê ̣n Bảo Quản Sau Thu Hoa ̣ch : Nghiên cứu sản xuất một số chế phẩm sinh học, hóa học sử dụng trong bảo quản rau quả, hoa tươi Đề tài trọng điểm cấp Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn giai đoạn

2007-2009

[2]: Nguyễn Duy Lâm : Báo cáo tổng thuật taì liệu TQ 01/2007 Tình hình nghiên cứu công nghê ̣ và thiết bi ̣ sản xuất chế phẩm ta ̣o màng bảo quản

[3]: Cao Văn Hùng và CS, 2006: Nghiên cứu độ thấm khí O2 và CO2 của một số màng plastic sử dụng trong công nghệ bao gói khí điều biến (MAP) bảo quản rau quả Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 21, 59-66

[4]: Đặng Xuyến Như và CS, 2002: Nghiên cứu công nghệ sử dụng một số loại màng để bảo quản một số loại quả Việt Nam Thông tin báo cáo tổng kết 20 năm thành lập Viện Ứng dụng công nghệ http://www.nacentech.ac.vn

[5]: Nguyễn Duy Lâm, 2003: Nghiên cứu cải tiến tính năng và chế tạo mới vật liệu làm màng bao từ chitosan bằng xử lý chiếu xạ để bảo quản quả tươi và hạt giống Đề tài cấp Bộ KH-CN-MT, 2 năm 2001-2002