Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon (hedychium bousigonianum pierre ex gagn)

Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên Bousigon Hedychium Bousigonianum Pierre ex Gagn Đỗ Thị Hiền Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận vă

Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên Bousigon (Hedychium Bousigonianum Pierre

ex Gagn)

Đỗ Thị Hiền

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Hóa hữu cơ; Mã số: 60 44 27 Người hướng dẫn: PGS.TS Văn Ngọc Hướng

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên bousigon Nghiên cứu qui

trình chiết chọn lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các sản phẩm chiết được Nghiên cứu phân lập các γ - lacton α, β không no trong các cặn chiết từ thân rễ cây ngải tiên bousigon Khảo sát invitro hoạt tính gây độc tế bào của 3 loại ưng thư của các sản phẩm phân lập được Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập

được

Keywords Hóa hữu cơ; Hợp chất; Cây ngải tiên; Hoạt tính sinh học

Content

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên hệ thực vật vô cùng đa dạng

và phong phú đặc biệt là cây có tinh dầu và cây làm thuốc Theo thống kê bước đầu, nước ta

có hơn 600 loài cây có tinh dầu, nhưng phần lớn chưa được nghiên cứu đầy đủ, hệ thống và triệt để Hệ thực vật phong phú và đa dạng của mỗi vùng, mỗi quốc gia được xem là một trong những nguồn tài nguyên quí giá, có quan hệ trực tiếp tới đời sống con người

Hóa học các hợp chất thiên nhiên với vai trò nghiên cứu thành phần hóa học và tìm hiểu hoạt tính sinh học của cây thuốc mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn Việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây thuốc dân tộc là vấn đề không những hấp dẫn về khoa học mà còn đóng góp cho việc sử dụng cây thuốc có hiệu quả hơn, chính xác hơn

Góp phần phong phú cho hệ thực vật Việt Nam, lại rất gần gũi với đời sống nhân dân

phải kể đến họ gừng (Zingiberaceae) Nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ các cây họ gừng

làm thuốc và hương liệu trên thế giới và trong nước ngày càng tăng Các nghiên cứu về các cây họ gừng đến nay là rất nhiều nhưng nó luôn là điều hấp dẫn với các nhà nghiên cứu Trong họ gừng có một chi mà ở Việt Nam chưa được nghiên cứu rộng rãi đó là chi ngải

Hedychium Trong khi đó thế giới với rất nhiều các nghiên cứu báo cáo rằng đây là một chi

rất hấp dẫn bởi hương thơm của hoa và những hợp chất có hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy các  - lacton diterpen ,  không no Đây là những hợp chất có hoạt tính chống ung thư, chống viêm rất mạnh đang được các nhà khoa học thế giới quan tâm một cách đặc biệt Với

định hướng như vậy chúng tôi đã chọn đề tài: “ Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt

tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon ( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ”

Hedychium (chi ngải) là một chi thuộc họ gừng (Zingiberaceae) gồm những cây lâu

năm phổ biến với chiều cao khi phát triển khoảng 120 – 180 cm Chi này thường được gọi với cái tên là chi của những cây hoa loa kèn gừng và chi của các loại cây thân thảo, thân rễ mập và phân nhánh Chi này có nguồn gốc từ những vùng đất nhiệt đới ở Châu Á và dãy Himalaya Các loài của chi này thường có hoa rất đẹp, rực rỡ và hấp dẫn bởi mùi hương Tại Nam Á, chi Hedychium đã có hơn 80 loài Các nghiên cứu gần đây báo cáo có 41 loài ở Ấn

Độ, trong đó có 17 loài đặc hữu của Ấn Độ Ba loài mới của chi Hedychium từ Thái Lan mới

được nhận dạng và phân lập năm 1995 là H samuiense, H tomentosum và H biflorum Theo cuốn ―Cây cỏ Việt Nam‖ của Phạm Hoàng Hộ thì ở Việt Nam chi Hedychium có 12 loài,

phân bố ở hầu hết các tỉnh từ Bắc chí Nam Về thành phần tinh dầu mới chỉ có một công trình của Nguyễn Thị Thủy và cộng sự nghiên cứu thân rễ cây Ngải tiên Cây Ngải tiên

(Hedychium coronarium Koenig) mọc tự nhiên tại huyện Sapa, tỉnh Lào Cai, được đem về

trồng tại trại Thực nghiệm của viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh Vật (Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội) từ năm 2000 và thu hoạch cuối năm 2002 để nghiên cứu Thành phần hoá học của tinh dầu được biết gồm các thành phần chính là 1,8 - Cineol - 43,32%,  - Pinen - 25,45%,  - Pinen - 10,32%, 3- Cyclohexen- 1-methanol - 5,29% [5]

Mới đây, vào tháng 11 năm 2011, trên tạp chí Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Phan văn Kiệm và các cộng sự đã công bố nghiên cứu mới nhất về các hợp chất được phân lập từ thân rễ ngải tiên ở Sapa – Việt Nam Trong báo cáo này, họ đã phận lập được ba labdane loại diterpenes mới, đặt tên là coronarins G,H,I và 7 hợp chất đã được biết đến là:

coronarin D, coronarin D methyl ether, hedyforrestin C, (E)-nerolidol, -sitosterol,

daucosterol, và stigmasterol Các hợp chất từ cây có tác dụng ức chế sản xuất các cytokine của tế bào đuôi gai có nguồn gốc từ tủy xương là các tác nhân gây viêm hoặc tiền gây viêm được giải phóng ra khi bị kích thích bởi LPS (lypopolysacchride) Trong số các hợp chất này,

các hợp chất coronarins D, G, H là chất ức chế đáng kể tới LPS kích thích TNF-, IL-6 và IL-12 p40 sản xuất với IC50 khác nhau, từ 0,19 ± 0,11 ; 10,38 ± 2,34 M.[16]

Ba hợp chất mới được phân lập (1-3 : coronarins G,H,I)

Cây ngải tiên bousigon, tên khoa học là Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn, thuộc họ Gừng ( Zingiberaceae) Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn có nguồn gốc là

từ vùng Himalayas của Nepal và Ấn Độ sau đó phát tán tới khu vực Nam châu Phi và Nam

Mỹ Loài còn phân bố ở Nam Trung Quốc, Malaixia, Úc và Việt Nam Cây mọc ở những vùng có khí hậu mát lạnh

Thân cỏ, cao 1-1,2 m Căn hành to 6 – 7 mm Lá có phiến thon hẹp, nhọn, dài 30 – 50

cm, rộng 7 cm, không lông Gié thưa, dài 20 cm; lá hoa có lông, dài 2,5 cm; hoa to, vàng; tiểu nhụy lép hẹp, dài 4cm; môi xoan, chẻ đến ½; noãn sào có lông Thường mọc trong rừng ở Đà Lạt

Hình 1.1: Thân rễ cây ngải tiên Bousigon

Các loài trong chi Hedychium rất hấp dẫn bởi hương thơm của hoa và những hợp chất

có hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy các  - lacton diterpen ,  không no Đặc biệt là các γ-lacton α, β không no thuộc dãy labdan Các hợp chất này theo Kumakara AB và cộng sự là những hợp chất không chỉ có tác dụng ức chế sự tạo thành tác nhân gây ưng thư và nhiều bệnh nguy hiểm khác như là NF-kB hoạt động mà còn có tác dụng ức chế sự hoạt động của tác nhân này gây bệnh tật Chính đặc tính lưỡng dụng này mà các γ-lacton α, β không no thuộc dãy labdan ditecpen đang là đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm nghiên cứu Chúng tôi càng quan tâm các hợp chất này và tìm kiếm nó trong các cây thuộc chi Ngải (Hedychium) Trong công trình trước chúng tôi đã nghiên cứu các labdan ditecpen có hoạt tính gây độc tố tế bào ưng thư trong cây ngải tiên (Hedychium coronarium

Koen) [6] Trong công trình này chúng tôi chọn cây ngải tiên Bousigon và tên đề tài: “Góp

phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon

( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ‖

Mục tiêu của đề tài

a Nghiên cứu thành phần hóa học của thân rễ cây ngải tiên bousigon

b Nghiên cứu, phân lập, xác định cấu trúc phân tử và hoạt tính chống ung thư của các 

- lacton ,  không no dãy labdan diterpene trong thân rễ ngải tiên bousigon

Nhiệm vụ của đề tài

1 Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên bousigon

2 Nghiên cứu qui trình chiết chọn lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon

3 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các sản phẩm chiết được

4 Nghiên cứu phân lập các  - lacton ,  không no trong các cặn chiết từ thân rễ cây ngải tiên bousigon

5 Khảo sát invitro hoạt tính gây độc tế bào của 3 loại ưng thư của các sản phẩm phân lập được

6 Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập được

Mẫu thực vật và phương pháp xử lí:

Nguyên liệu thân rễ cây ngải tiên bousigon (Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn)

được Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình ở Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam cung cấp và giám định Mẫu thân rễ ngải tiên bousigon được lấy tại tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 4 năm 2011 Sau khi thu mua về, mẫu được rửa sạch đất cát, loại bỏ phần thối rữa, hư hỏng và thái

ngang thân rễ thành lát dày 1- 3 mm, rồi nghiền thành bột cỡ hạt 1 – 2 mm và bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành nghiên cứu

- Từ 0,2 kg nguyên liệu khô đã chuẩn bị cho nghiên cứu phần tinh dầu

- Từ 3,6 kg nguyên liệu tươi đã chuẩn bị cho nghiên cứu các hoạt chất sinh học

Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon

a/ Cho 0,2 kg nguyên liệu (đã chuẩn bị ở phần 2.3.1) cùng 2,5 lít dung dịch NaCl 10% cho vào bình cất A của thiết bị chưng cất đặc biệt (hình 2.1) có bẫy tinh dầu D bằng 60ml dung môi toluen

Hình 2.1: Thiết bị cất cuốn hơi nước hồi lưu

Đun hồi lưu 03 giờ, lấy toluen trong bẫy ra và cất lấy dịch dầu – nước cho đến khi âm tính với KmnO4 0,2%

b/Bão hòa dịch dầu-nước cất được bằng NaCl rồi chiết 03 lần bằng toluen mỗi lần 100ml c/ Gộp lượng toluen lấy trong bẫy chiết với lượng dịch chiết toluen từ dịch dầu nước,, làm khô bằng Na2SO4, cất loại dung môi, thu hồi tinh dầu, giữ trong lọ kín và bảo quản trong

tủ lạnh trước khi xác định thành phần hoá học và các nghiên cứu khác Hàm lượng tinh dầu được tính bằng tỉ lệ phần trăm khối lượng tinh dầu trên khối lượng mẫu khô (gam) Kết quả được 0,5g tinh dầu Tính hiệu suất là 0,25% Tinh dầu có màu vàng chanh nhạt, mùi thơm dễ chịu, hấp dẫn

Chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ ngải tiên bousigon :

a/ Từ 3,6 kg nguyên liệu tươi đã chuẩn bị ở phần 2.3.1, ngâm vào 10 lít etanol 96% trong ba ngày, lọc Busne, ngâm tiếp 2 lần nữa, mỗi lần 1,5 lít EtOH 96% lọc Busne Gộp dịch chiết etanol, thu được 10 lít dịch lọc

b/ Cô dịch lọc bằng cách đun cách thủy đến còn 1/6 thể tích Thêm vào 4 thể tích nước bão hòa muối và chiết 3 lần bằng n – hexan

Lần 1 : 150 ml

Lần 2: 150 ml

Lần 3: 150 ml

Gộp dịch chiết n – hexan, làm khô bằng Na2SO4, cất loại dung môi bằng cách thủy thu được cặn H, 3gam Hiệu suất 0.088% tính theo nguyên liệu tươi

c/ Sau khi chiết bằng n – hexan, dịch được chiết tiếp bằng diclometan, cũng tiến hành

3 lần, mỗi lần 100 ml, thu được dịch diclometan Làm khô bằng Na2SO4 khan, cất cách thủy

để loại dung môi thu được cặn C khối lượng 4 gam, hiệu suất 0.11 % tính theo nguyên liệu tươi

d/ Sau khi chiết bằng diclometan, dịch được chiết tiếp bằng etylaxetat, cũng tiến hành

3 lần, mỗi lần 100 ml, thu được dịch etyaxetat Làm khô bằng Na2SO4 khan, cất cách thủy để

A: Bình cất B: Ống nối C: Sinh hàn D: Bẫy tinh dầu

E: Khóa

loại dung môi thu được cặn E khối lượng 1 gam, hiệu suất 0.027 % tính theo nguyên liệu tươi

Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity)

Theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlink (1994) tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampixilin, Tetracylin, Amphoterilin

B và Nystatin.Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm các nhóm:

- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922);Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)

- Vi khuẩn Gr (+) : Bacillus subtillis (ATCC 27212); Staphylococcus aureus (ATCC 12222)

- Nấm mốc : Aspergillus niger (439); Fusarium oxysporum (M42)

- Nấm sợi : Candida albicans (ATCC 7754); Saccharomyces cerevisiae (SH20)

Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon:

Đối với chất lỏng dễ bay hơi và nhiệt độ sôi thấp như tinh dầu thì phương pháp hiện đại nhất để phân tích và nhận biết các thành phần là phương pháp sắc kí khí kết hợp với khối phổ Theo phương pháp này, chạy theo chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ đầu 900C, gia nhiệt

50C /phút đến 2800C trên máy GC-6890 MS-5973, chúng tôi xác định trong tinh dầu thân rễ

ngải tiên bousigon khô có 45 thành phần (xem phụ lục số 1), chúng tôi đã nhận dạng được 21

thành phần là những thành phần có độ trùng lặp về phổ khối trên 90% so với phổ khối các chất trong thư viện máy (xem bảng 3.1)

Bảng 3.1: Các thành phần chính của Tinh dầu thân rễ cây ngải tiên bousigon vùng Vĩnh

Phúc STT Thời gian

Hàm lượng (%)

Độ trùng lặp(%)

19 30.08 Drim-8-en-11-all-1-naphthalen 0.57 90

Kết quả trên cho thấy số thành phần xác định được chiếm 73.83%; còn 26.17% trong tinh dầu chưa xác định được thành phần Đây là một điều thú vị đối với tinh dầu ngải tiên bousigon, cần được nghiên cứu tiếp tục vì nó chiếm trên 1/4 lượng tinh dầu

Khi so sánh thành phần chính của tinh dầu thân rễ cây ngải tiên bousigon trồng tại Vĩnh Phúc với thành phần chính của tinh dầu ngải tiên trồng tại Sapa, chúng tôi thấy có sự

giống và khác nhau về thành phần và hàm lượng các thành phần Điều này được thể hiện trên bảng 3.2

Bảng 3.2: So sánh một số thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên Sapa và tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon Vĩnh Phúc

Thành phần

Loại (%)

Tinh dầu

Linalool

α-Terpineol

β-tumerone Nerollidol

37,94-zerubone 1,8-cineole Tinh dầu ngải

Tinh dầu ngải

tiên bousigon

Vĩnh phúc

Sự khác biệt này có thể do phương pháp điều chế, cũng có thể do thổ nhưỡng và khí hậu, mùa lấy mẫu và loài

Chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ ngải tiên bousigon

Sau khi chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon bằng các dụng môi n-hexan, diclometan và etylaxetat cho thấy trong thân rễ cây ngải tiên bousigon hàm lượng các chất không phân cực hay kém phân cực rất thấp, 0,088% tính theo nguyên liệu tươi; trong khi đó hàm lượng các chất có độ phân cực trung bình cao: 0,11% và 0.027% tính theo nguyên liệu mẫu tươi Đây cũng là điều mong ước của chúng tôi

Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cặn chiết của thân rễ ngải tiên

bousigon

Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của mẫu các cặn chiết H, C, E từ thân rễ ngải tiên đối với 8 loại vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) thuộc 4 nhóm khác nhau: Gram (+), Gram (-), nấm mốc, nấm men theo phương pháp thử hiện đại Vanden Bergher và Vliethin Gah Kết quả thử được chỉ ra trên bảng 3.3

Bảng 3.3 : Hoạt tính kháng VSVKĐ của các cặn chiết của thân rễ ngải tiên bousigon

VSV-

KĐ

Mẫu

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC:g/ml)

Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men

E

coli

P

Arugin

osa

B

subtillis

S

aureus

Asp

niger

F

Oxysporum

C

Albicans

S cerevis iae

Dấu (-) : không có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Kết quả trên cho các cặn chiết từ thân rễ cây ngải tiên Bousigon đều có hoạt tính chống

2 loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột là E.coli gây bệnh tiêu chảy và B.subtullis gây bệnh viêm đạ tràng

Khảo sát các cặn chiết H và C bằng SKLM

chúng tôi tiến hành khảo sát cặn chiết H bằng SKLM với hệ dung môi n – hexan/EtOAc, 9/1,v/v; cặn C với hệ dung môi n – hexan/diclometan, 1/9,v/v và hai thuốc hiện vanilin/H2SO4 1% và FeCl3 1M (pH = 4) Kết quả được chỉ ra trong bảng 3.4 và 3.5

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát cặn H bằng SKLM

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát cặn C bằng SKLM

Kết quả trên cho thấy cặn chiết H phức tạp, có 8 thành phần nhưng chỉ có 2 thành phần là lacton dạng este có Rf = 0,5 và 0,33 xanh đen với FeCl3 1M (pH =4) khi nóng Còn cặn C thì ít phức tạp hơn, chỉ có 7 thành phần và có tới 1 thành phần hiện màu xanh đen với FeCl3 khi đun nóng, không màu khi nguội, các thành phần này có thể là lacton hoặc este

Phân lập các chất tinh khiết trong các cặn chiết H và cặn C

Đối với hợp chất có nhiệt độ sôi cao, phương pháp phân lập tốt nhất là phương pháp sắc kí cột Hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tỉ lệ các chất cần phân tách trên chất hấp phụ, hoạt tính của các chất hấp phụ, kích thước cột, phương pháp rửa cột

và dung môi rửa cột… Chúng tôi phân lập các chất lacton trong cặn H chiết từ thân rễ cây ngải tiên bousigon, kích thước cột 2,5 x 70 cm và dung môi rửa cột là n- hexan/EtOAc 9/1, v/v, tốc độ rửa 2 ml/phút Kiểm tra và thu gom sản phẩm bằng SKLM Kết quả chúng tôi phân lập được 4 chất sạch kí hiệu HB1, HB2, HB3 và HB5

Tương tự như trên nhưng với dung môi rửa cột là n – hexan/diclometan, 1/9,v/v từ cặn chiết C chúng tôi phân lập được một chất HB7, có Rf = 0,76 dung môi CH2Cl2/CH3OH, 7/3, v/v Như vậy chúng tôi đã phân lập được 5 chất tinh khiết từ các cặn chiết từ thân rễ cây ngải tiên bousigon

Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất HB3

Hợp chất HB3, dạng dầu không màu, Rf =0,45 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4)

Phổ IR của HB3 cho thấy phân tử có một vòng -lactone có vị trí , - chưa no có

C=O 1762 cm-1 và C=C 1681 cm-1; nhóm exo- methylene C=C 1641 cm-1 , C-H 954 cm-1 và nhóm ete C –O-C = 1118cm-1

Phổ 1HNMR) thấy tín hiệu của các nhóm methyl (H = 0,68 ppm; 0,78ppm; và

0,85ppm) và H của exo-methylene (H = 4,32ppm; 4,37ppm và 4,77ppm)

Quan sát những phổ 13

C – NMR cho thấy 8 Cacbon olefin vùng 107 – 147 ppm là 4 cặp đôi cacbon olefin liền kề có cùng cường độ Tổng số cacbon của hai đồng phân này là 42 Trong đó có 8 nhón CH, 15 nhóm CH2, 8 nhóm CH3)

Tất cả các dữ kiện trên cho phép nghĩ đến đây là cặp đồng phân epime của metyl coronarin D ete

Điều này được khẳng định thêm nhờ trên phổ khối của HB3 có pic ion phân tử tại m/z

= 331,7 (M+) , cùng với 1 phân mảnh có điểm ion m/z = 300,7 (M+ – CH3OH) Tất cả thỏa mãn với công thức phân tử C21H32O3

Số liệu phổ của HB3 được ghi trên bảng 3.8 và công thức cấu tạo của HB3 được chỉ

ra trên hình

O 20

H

19 18

17

O

O 21

1 2

4 5 6 7

8

9 10

11

12 13 14 15 16

Hình 3.1 Công thức cấu tạo của HB3 – metyl coronarin D ete

Bảng 3.6 Số liệu phổ 13 C của hợp chất HB3 Nguyên tử C

Số liệu phổ 13 C của hợp chất HB3

Xác định cấu tạo phân tử của hợp chất HB5

Hợp chất HB5 là tinh thể hình kim, màu trắng và Rf= 0,79 ( n- hexan/EtOAc, 3/7,v/v), hiện màu xanh đen với FeCl3 1M (pH = 4) khi đun nóng Phổ IR của HB5 cho thấy

có vòng - lacton , không no (C=O 1751 cm-1, và liên kết đôi 3 nhóm thế có C=C 1643 cm -1

, C-H =829 cm-1); có liên kết đôi 2 nhóm thế dạng E ( exo – metylen) với C=C 1603 cm-1, 

C-H 900 cm-1

Trên phổ 13

C – NMR và DEPT cho thấy rõ phân tử HB5 có 20 nguyên tử C, trong đó

có 3 nhóm metin olefin vùng trường yếu 120 – 145 ppm, 2 nhóm metin của Cacbon bậc 3 no vùng 55 – 65 ppm, 6 nhóm metylen và đặc biệt nhóm exo metylen có C = 108,40 ppm

Khối phổ của HB5 cho pic M+ = 300,6 Từ các số liệu trên suy ra công thức phân tử

của HB5 là C20H28O2 và độ bội liên kết là 7 Vì phân tử hợp chất HB5 có 20 nguyên tử cacbon, có vòng - lacton , không no, nhóm exo – metylen vì 3 nhóm metyl ở vùng trường mạnh nên có thể suy ra đây là diterpen và dựa vào qui luật đầu đuôi và đặc điểm các phổ chúng tôi xây dựng khung labdan Những dữ kiện trên cho phép khẳng định HB5 là Villosin

có công thức như hình 3.1 Các số liệu phổ 1H và 13

C-NMR được chỉ ra trong bảng 3.6 Số liệu phổ HB5 tương ứng với số liệu phổ của villosin công bố trong tài liệu 26

Hình 3.2 Công thức cấu tạo của HB5 - Villosin Bảng 3.7 Số liệu phổ 1 H và 13

C-NMR của hợp chất HB5

Vị

trí C C (ppm)

của

HB5

C (ppm) của villosin [26]

H (ppm) của HB5

Độ bội, J(Hz) của HB5

H (ppm) của villosin [26]

8 149,40 149,4

12 120,66 120,7 6,10 d (15,84) 6,11

13 129,55 129,6

16 172,31 172,3

17 108,40 108,4 4,5; 4,76 d(1,7); d(1,7) 4,51; 4,76

Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất HB7

Hợp chất HB7 là chất rắn, màu trắng, điểm nóng chảy 164oC và Rf= 0,76 (CH2Cl2/CH3OH, 7/3,v/v), hiện màu xanh đen với Vanilin/H2SO4đ

Phổ IR của HB7 OH= 3542.06 cm-1, 3391.40 cm-1C=O =1710.80cm-1; liên kết đôi 3 nhóm thế C=C =1640.30 cm-1 ; C-O-C của vòng piran không no 1073.52 cm-1

Trên phổ 13

C – NMR và DEPT cho thấy rõ phân tử HB7 có 17 nguyên tử C, trong đó

có 10 nhóm CH, 3 nhóm CH2, 1 nhóm CH3 và có 3C không liên kết trực tiếp với H

Khối phổ của HB7 cho pic M+ = 387.4 Từ các số liệu trên suy ra công thức phân tử của HB7 là C17H24O10

Qua phân tích phổ 13

C – NMR của HB7 thấy rõ 4 nguyên tử C của nhân pyrano-D-glucose trong vùng dịch chuyển từ 70-77ppm, cacbon anome ở 98.6, H anome có δH=4.53ppm và nhóm etylencacbinol δH=3.06ppm, δC=66.99ppm Điều này cho thấy HB7 là

1 glucosit Lấy công thức phân tử của HB7 ( C17H24O10) trừ đi phần glycon C6H11O5 ta được phần còn lại là C11H13O5 Trong đó có các nhóm chức: OH, C=O, C=C ba nhóm thế, C-O-C của vòng pyran không no, 5 nhóm CH, 2 nhóm CH2, 1 nhóm CH3 và 3 C không liên kết với

H Tổng số vòng và liên kết đôi trong aglycose là 5 Phổ 1 H – NMR của HB7 cho thấy có 2 nhóm proton olefin là δH=7.46ppm δH=5.68ppm và có 2 nhóm metoxyl δH=3.64ppm δC=51.02ppm Vì có nhóm >C=O nên số vòng và số liên kết đôi còn lại là 4, có 1 vòng piran Vậy có thể là vòng không no Từ dự kiện trên chúng tôi xây dựng được công thức của aglycon như hình

O COOCH3

O

Hình 3.3: Cấu tạo của agycon

Ghép với phần D-glucosit ta được công thức của HB7 như hình