(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine O Methyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu chuyển gen mã hóa Enzyme Columbamine OMethyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––––

XAYKHAM THIPPHAVONG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O-METHYLTRANSFERASE (CoOMT)

VÀO CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2021

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––––

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học : TS PHẠM THỊ THANH NHÀN

THÁI NGUYÊN - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme

columbamine o-methyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana

tabacum L.)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi Tôi đã tự tiến hành các

bước thí nghiệm, thu kết quả và viết thành luận văn dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS Phạm Thị Thanh Nhàn Mọi kết quả đã thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2021

Tác giả luận văn

Xaykham THIPPHAVONG

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dành cho tôi học bổng học tập, để tôi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã trang bị cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý giá về các môn học liên quan đến chuyên ngành của tôi và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Tôi xin cảm ơn toàn thể đồng nghiệp, gia đình, bạn bè đã động viên, giúp

em vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinh sống tại Thái Nguyên, Việt Nam

Mặc dù đã cố gắng rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài luận văn nhưng năng lực và kinh nghiệm còn hạn chế, em rất mong nhận được sự ý kiến nhận xét của quý thầy cô để luận văn của em được hoàn thiện hơn

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2021

Tác giả luận văn

Xaykham THIPPHAVONG

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Những chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

CHƯƠNG 1: T NG QUAN TÀI LI U 3

1.1 Giới thiệu về cây mô hình 3

1.2 Hợp chất rotundin và enzyme Columbamine O-methyltransferase 4

1.2.1 Hợp chất rotundin 4

1.2.2 Enzyme Columbamine O- methyltransferase 7

1.3 Kỹ thuật chuyển gen thực vật và ứng dụng cải thiện hàm lượng dược chất trong cây thuốc lá 9

1.3.1 Phương pháp chuyển gen ở thực vật 9

1.3.2 Kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở thực vật 10

1.3.3 Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen 12

CHƯƠNG 2: VẬT LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu nguyên cứu 19

2.1.1 Vật liệu thực vật 19

2.1.2 Chủng vi khuẩn 19

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 19

2.2 Địa điểm nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 22

2.3.2 Phương pháp phân tích cây chuyển gen 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Kết quả chuyển gen CoOMT vào cây thuốc lá 28

3.1.2 Kết quả nuôi hoạt hóa vi khuẩn A tumefaciens AGL1 chứa vector chuyển gen CoOMT 28

3.1.3 Kết quả biến nạp gen CoOMT vào cây thuốc lá 28

3.2 Kết quả phân tích sự biểu hiện của gen chuyển trong cây thuốc lá ở mức độ phiên mã 31

3.2.1 Kết quả xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen 31

3.2.2 Kết quả phân tích biểu hiện gene CoOMT bằng phản ứng semi-quantitative PCR (semi- qPCR) 34

3.2.3 Thảo luận về kết quả đánh giá hoạt động của vector chuyển gen pBI121-1113 - CoOMT 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

TÀI LI U THAM KHẢO 39

dNTP Deoxynucleoside

Triphosphate

Nucletide tổng hợp dùng trong phản ứng PCR

EDTA Ethylene diamine tetraacetic

acid

Axit hữu cơ dùng để khử hoạt tính các enzyme

LB Luria Bertani Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

MS Murashige - Skoog Môi trường nuôi cây cơ bản

PCR Polymerase Chain Reaction Phán ứng chuỗi Polymerase

RT-PCR Polymerase Chain Reaction

Reverse Transcription PCR

Phán ứng chuỗi tổng hợp cDNA từ mRNA

SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi

SIM Shoot induction medium Môi trường tạo đa chồi

TAE Tris - Acetate - EDTA Dung dịch đệm điện di DNA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường tái sinh thuốc lá 20

Bảng 2.2 Cặp mồi đặc trưng của phản ứng RT-PCR 25

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 26

Bảng 2.4 Thông tin trình tự mồi trong phản ứng semi- qPCR và qRT-PCR 27

Bảng 3.1 Kết quả biến nạp vector mang gen CoOMT vào cây thuốc lá 30

Bảng 3.2 Kết quả định lượng RNA tổng số tách chiết từ cây thuốc lá WT và cây chuyển gen 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây thuốc lá 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin [50] 5

Hình 1.3 Con đường tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine [34] 8

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid [43] 11

Hình 1.5 Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA sang tế bào thực vật [36] 12

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện pBI121 [20] 19

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 21

Hình 3.1 Hình ảnh biến nạp di truyền vào cây thuốc lá 29

Hình 3.2 Một cây thuốc lá chuyển gen trong nhà lưới 31

Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ cây thuốc lá WT và chuyển gen thế hệ T0 32

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 33

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm semi-qPCR phân tích sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng 34

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Thực vật là một nguồn có giá trị cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp như steroid, alkaloids, flavonoid, terpenoid, anthocyanon, quinin và lignan Các hợp chất này được sử dùng làm dược liệu, hương liệu, hóa chất, thuốc nhuộm, nước hoa và phụ gia có giá trị cao Tổng số khoảng 30.000 sản phẩm tự nhiên được biết đến có hơn 80% có nguồn gốc từ thực vật Những sản phẩm này được biết như là những hợp chất trao đổi thứ cấp, thường được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong cây như alkaloid loại L-tetrahydropalmatin (rotundin) Rotundin là một dược liệu được áp dụng trong điều trị một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất

Columbamine O-Methyltransferase (CoOMT) mới được phát hiện là một enzyme làm chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin ở cây thuộc

bộ Mao lương (Rannunculaceae) Biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme CoOMT

có thể sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng rotundin trong cây chuyển gen

Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là một loài cây thuộc họ Cà

(Solanaceae) và đang là loại cây được sử dụng làm cây mô hình phổ biến nhất

để biểu hiện gen chuyển từ nhiều loại sinh vật, bởi vì nó dễ trồng và dễ dàng biến đổi gen Nó cũng cung cấp lượng mô sống đáng kể và có hệ thống nuôi cấy tế bào được thiết lập tốt Enzyme vi khuẩn được tổng hợp trong thuốc lá có thể tăng cường bảo vệ, chống lại các stress phi sinh học và mầm bệnh Thuốc lá cũng được sử dụng như một mô hình cho tính nhạy cảm với các bệnh thực vật, sinh tổng hợp pyridine alkaloid (như nicotine), stress oxy hóa…

Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen và phân tích sinh vật chuyển gen trong nghiên cứu chức năng của gen đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và nhiều gen mới trong hệ gen của cây thuốc lá đã được giải mã chức năng Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần tạo thành công cây thuốc lá chuyển gen (chứa

gen CoOMT) với mục đích nghiên cứu chức năng của gen CoOMT trong quá

trình nâng cao năng suất tổng hợp chất ankaloid loại rotundin, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O-METHYLTRANSFERASE (CoOMT)

VÀO CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được một số dòng cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.) mang gen chuyển CoOMT ở thế hệ T0

3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme CoOMT vào cây thuốc lá

Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Những kết quả về tạo được một số dòng cây thuốc chuyển gen khẳng định cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện sự tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp loại rotundin của cây mô hình và góp phần làm tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào cây trồng (cây đích)

CHƯƠNG 1

T NG QUAN TÀI LI U

1.1 Giới thiệu về cây mô hình

Theo Reed, Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) được phân loại thuộc giới

thực vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà [23], [40]

Giới (Kingdome): Plantae

Ngành (Division): Tracheophyta

Lớp (Class): Anginosperm

Bộ (Order): Solanales

Họ (Family): Solanaceae

Chi (Genus): Nicotiana

Loài (Species): N tabacum Hình 1.1 Cây thuốc lá

Cây thuốc lá là cây trồng vừa có giá trị kinh tế, vừa là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học và trong sự phát triển ban đầu của sinh học phân tử thực vật [21] Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả tại Nhật Bản (2002) đã phát hiện ra rằng, nguồn gốc của cT-DNA trong bộ gen của loài

thuốc lá Nicotiana glauca hoang dã là T-DNA của Ri plasmid loại mikimopine (pRi) chứa trong Agrobacterium rhizogenes Đây là bằng chứng rõ ràng đầu

tiên về mối quan hệ ký sinh – vật chủ trong quá trình tiến hóa ban đầu của cây

thuốc lá Nicotiana [21]

Thuốc lá là loại cây được sử dụng phổ biến nhất để biểu hiện gen chuyển

từ nhiều loại sinh vật, bởi vì nó dễ trồng và dễ dàng biến đổi gen Nó cũng cung cấp lượng mô sống đáng kể và có hệ thống nuôi cấy tế bào được thiết lập tốt Nhiều protein vi khuẩn tham gia vào quá trình tổng hợp các sản phẩm thương mại hiện đang được thiết kế để sản xuất trong thuốc lá Enzyme vi khuẩn được tổng hợp trong thuốc lá có thể tăng cường bảo vệ, chống lại các stress phi sinh học và mầm bệnh [31] Thuốc lá được sử dụng rộng rãi như một hệ thống cây

mô hình trong nghiên cứu chuyển gen vì nhiều lý do: Di truyền phân tử của nó được hiểu rõ, lập bản đồ gen của nó gần như được hoàn tất,… Cây thuốc lá có thể sinh trưởng, phát triển tốt trong ống nghiệm, trong điều kiện nhà kính và tạo

ra một lượng lớn sinh khối Thuốc lá cũng được coi là một trong những hệ thống tốt nhất để biến đổi lục lạp, giúp tăng cường hơn nữa hiệu quả đối với sự biểu hiện của protein tái tổ hợp Cây thuốc lá biến đổi gen cũng là mô hình lý tưởng cho nghiên cứu các chức năng sinh học cơ bản, chẳng hạn như tương tác mầm bệnh, phản ứng môi trường, điều hòa sinh trưởng và lão hóa [31] Thuốc

lá cũng được sử dụng như một mô hình cho tính nhạy cảm với các bệnh thực vật, sinh tổng hợp pyridine alkaloid (như nicotine), stress oxy hóa… [32] Cây mô hình mà nhóm nghiên cứu lựa chọn sử dùng làm vật liệu trong nghiieen cứu là giống K326

Giống K326 là giống thuốc lá được Công ty Novatis lai tạo tờ tổ hợp lai

Mc Nair 225 (coker 139 x coker 319) x (NC nair 30 x NC 95), sản xuất và đưa

ra từ năm 1982, ở trên thế giới giống này đang được trồng rất phổ biến Tại Việt Nam, giống này đã được chọn lọc bởi tập đoàn giống nhập khẩu từ Mỹ và

nó đã chính thức được công nhận là giống quốc gia vào năm 1996 [19] Cây có chiều cao cây là 1,4 m, thân to, lá dài, màu xanh đậm, thời gian sinh trưởng 110

- 120 ngày, số lá thu hoạch 18 - 19 lá Nó có ưu điểm lớn nhất là sinh trưởng tốt

Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản

ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi trong động vật, có dược lực tính mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc

thử của alkaloid Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp chất hữu cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [27]

L-Tetrahydropalmatine (Rotundin) là một alkaloid isoquinoline được tìm thấy trong một số loài thực vật khác nhau, chủ yếu ở các loài Bình vôi

(Stephania glabra (Roxb.) Miers.) thuộc chi Stephania và thân rễ một số loài

thuộc chi Corydalis (như C tuberosa, C caseana, C ochroleuca…) [50] Những loại cây này có công dụng truyền thống trong y học thảo dược Trung Quốc Ngành công nghiệp dược phẩm đã tổng hợp sản xuất chất đồng phân đối quang mạnh hơn L – tetrahydropalmatine và đã được bán trên thị trường

Rotundin có công thức phân tử: C21H25NO4 Khối lượng phân tử là M=355,43 Danh pháp quốc tế của rotundin: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10-tetramethoxy-6H dibenzo [a, g] quinolizine Đây là một hợp chất hữu cơ gồm 4 vòng kết dính, chứa nhân dị vòng isoquinolin, vì thế nó thuộc loại isoquinolin alkaloid và đó cũng là một trong các bộ khung alkaloid rất thường gặp trong một số họ thực vật [50]

Rotundin lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin trong quá trình nghiên cứu cấu trúc palmatin theo phản ứng [25]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin [50]

Rotundin được sử dụng trong công nghiệp dược với tác dụng an thần, giải lo âu mà không gây nghiện như phần lớn các thuốc an thần khác [10] và cũng được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý khác như tác dụng hỗ trợ điều trị cai nghiện và giảm hiện tượng lệ thuộc thuốc [50]

Rotundin là hợp chất ít độc và có nhiều hoạt tính vô cùng phong phú Kết quả nghiên cứu ở Liên Xô (cũ), Rumani, Trung quốc đã chỉ ra rằng L-tetrahydropalmatin rất ít độc Thí nghiệm cho thấy rằng một liều cao hơn 30 mg/kg cơ thể được tiêm đồng tử bị liệt nhất thời rồi hết [1]

Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [2]

Năm 2001, Nguyễn Minh Chính sử dụng thuốc tiêm rotundin sulfat có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, tương tự như diazepam [1] Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150 mg/kg thể trọng), tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống Điều đó chứng tỏ độ an toàn cao của chế phẩm Rotundin ít độc Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy

bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên

30 mg và 60 mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa

2 ml (60 mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày,

hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh [41] Chu

Hongyuan, Jin Guozhang và cộng sự (2010) nghiên cứu cơ chế giảm đau của L-tetrahydropalmatin thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2, ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện ở Trung Quốc [22]

Một số sản phẩm của rotundin đã được thương mại hóa tại Việt Nam như: Rotundin của công ty Dược phẩm TW3, Rotundin của Công ty cổ phần Dược phẩm TW2 [42]

1.2.2 Enzyme Columbamine O- methyltransferase

Columbamine O-methyltransferase là một enzyme xúc tác phản ứng

S-adenosyl-L-methionine + columbamine S-adenosyl-L-homocysteine + palmatine

Do đó, hai cơ chất của enzyme này là S-adenosyl methionine và columbamine, trong khi hai sản phẩm của nó là S-adenosylhomocysteine và palmatine [52] Enzyme này thuộc họ transferase, đặc biệt là những enzyme chuyển methyltransferase nhóm một carbon Tên hệ thống của lớp enzyme này

là S-adenosyl-L-methionine: columbamine O-methyltransferase Enzyme này tham gia vào quá trình sinh tổng hợp alkaloid [52]

Methyltransferase là enzyme chìa khóa trực tiếp tham gia nhiều con đường sinh tổng hợp nhiều hợp chất quan trọng Mỗi methyltransferase trong quá trình sinh tổng hợp palmatine (gồm có S-adenosyl-L-methionine: norcoclaurine 6-O-methyltransferase (6OMT); S-adenosyl-L-methionine: coclaurine N-methyltransferase (CNMT); S-adenosyl-L-methionine: 3‟ -hydroxy-N-methylcoclaurine 4‟-O-methyltransferase (4‟OMT); S-adenosyl-L-methionine: scoulerine 9-O-methyltransferase (SMT) và CoOMT) đòi hỏi tính đặc thù về cơ chất chặt chẽ cho dù các cơ chất có sự tương đồng về cấu trúc [34]

Hiện nay, sự hiện diện và chức năng của các protein tham gia con đường sinh tổng hợp rotundin nói riêng, palmatine nói chung vẫn đang được các nhà khoa học quan tâm, khám phá Takashi và cs (2002) lần đầu tiên đã xác định

được trình tự cDNA của gen CoOMT ở loài Coptis japonica và chứng minh

được vai trò chuyển hóa cơ chất columbamine thành palmatine Đồng thời, các tác giả đề xuất chức năng chuyển hóa cơ chất tetrahydro columbamine thành tetrahydropalmatine (rotundin) dựa trên những kết quả thí nghiệm Từ trình tự

cDNA thu được, Takashi và cs xác định được gen CoOMT có sự tương đồng với gen 6OMT, 4’OMT và các gen OMT khác ở thực vật, mức độ tương đồng cao hơn gen SMT (Hình 1.3) [34]

1.3 Kỹ thuật chuyển gen thực vật và ứng dụng cải thiện hàm lƣợng dƣợc chất trong cây thuốc lá

1.3.1 Phương pháp chuyển gen ở thực vật

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết

kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen Gen chuyển phải được di truyền cho thế hệ sau và ở mỗi thế hệ sản phẩm biểu hiện của gen phải thể hiện được chức năng sinh học như khả năng

mã hóa cho các tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng

di truyền [17]

Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen gián tiếp

- Phương pháp chuyển gen trực tiếp thường được sử dụng là chuyển gen bằng súng bắn gen Với ưu điểm là thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào và nguyên liệu để bắn đa dạng, trong những năm gần đây phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen đã được áp dụng thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông Nhưng phương pháp này đòi hỏi chi phí thiết bị đắt tiền và có nhiều bản sao trong gen biến nạp được chuyển vào tế bào cùng lúc gây khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững

- Phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng phổ biến là chuyển gen

nhờ vi khuẩn Agrobacterium Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970 Việc phát hiện ra Agrobacterium

tumefaciens (A tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu

năm 1980 đã biến loài này trở thành một công cụ quan trọng nhất trong chuyển gen thực vật với những ưu điểm nổi trội: (i) Gen chuyển ít bị đào thải; (ii) Số lượng bản sao ít, do đó tránh được hiện tượng ức chế và câm lặng lẫn nhau; (iii)

Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do phụ thuộc vào hệ thống protein Vir; (iv) Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm; (v) Kỹ thuật đơn giản,

dễ thực hiện và không đòi hỏi thiết bị đắt tiền Mặc dù vậy, phương pháp này mới chỉ được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm, nhưng hiệu quả với cây một lá mầm còn thấp (do ở cây một lá mầm các tế bào khi bị thương có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm) Khi nhược điểm này được khắc phục thì phương pháp

chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium sẽ ngày càng được quan tâm và dẫn

trở thành một phương pháp chuyển gen được các nhà nghiên cứu ưu tiên lựa chọn vì lúa, ngô, lúa mì, … là những cây lương thực thiết yếu [43]

1.3.2 Kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở thực vật

1.3.2.1 Vi khuẩn A.tumefaciens

Agrobacterium được biết đến từ rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là

các vi khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng Trong những thập kỉ gần đây thì các nhà khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gen vào thực vật Chúng được xem như là các “kĩ sư trao đổi chất”, được áp dụng để chuyển gene vào tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần thiết Trong đó,

Agrobacterium tumefaciens được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các khối u

(mô sẹo) và Agrobacterium rhizogenes thì được biết đến với vai trò cảm ứng

tạo ra các rễ bất định ở thực vật hai lá mầm [36]

Vi khuẩn A tumefaciens và hiện tượng khối u ở thực vật

Agrobacterium là vi khuẩn gram âm (-), gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi

xâm nhiễm qua vết thương Vi khuẩn A tumefaciens không tự sản xuất được

một số amino acid như octopin, nopaline Để tồn tại nó chuyển gen của nó vào thực vật, thực vật sản xuất các chất cần thiết, vi khuẩn phân hủy các chất này để

kích thích sinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thực vật Ti plasmid là một loại plasmid đặc hiệu được vi khuẩn chuyển nạp vào tế bào thực vật gây nên tình trạng khối u [44]

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid [44]

Ti plasmid là một phân tử DNA kép, gồm 150.000 - 200.000 cặp nucleotid Tuy nhiên chỉ có một đoạn gồm 20.000 - 30.000 cặp nucleotid có khả năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ, đó là đoạn T-DNA T-DNA

có chứa các đoạn gen gây ra sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào thực vật, đó là các gen mã hóa auxin và cytokynin Trên Ti plasmid còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm lây nhiễm, chuyển nạp và chuyển hóa opine [44], [45]

1.3.2.2 Chuyển gen qua A tumefaciens

Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất có bản chất phenol là acetosyringone (AS) và hydroxyacetosyringone Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng

vir là A, B, C, D, E, F, G và tạo ra các protein tương ứng Các protein này có

hai chức năng chính: (i) Cắt đứt đoạn bờ phải và bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA; (ii) Bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật để tiếp cận với genome cây chủ Vết thương của cây được nhận diện thông qua tín hiệu hóa học acetosyringone Tín hiệu này được nhận biết đầu tiên bởi vir A Gen

vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự

trao đổi chất của vết thương trên thực vật Protein vir A tự phosphoryl hóa đồng

thời làm cho protein vir G được phosphoryl hóa và kích hoạt sao mã các gen vir

B, C, E, F, G, H Tiếp đó, các protein được mã hóa bởi vir D, vir E thực hiện

chức năng giải phóng sợi T-DNA Protein D2 cắt T-DNA ở vị trí 5‟ của bờ phải

và 3‟ của bờ trái, protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây Protein C1, C2 đồng thực hiện chức năng tăng cường giải phóng T-DNA Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm Protein vir B có chức năng tạo kênh xuyên màng tế bào giúp sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào Đồng thời protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển T-DNA [36], [49]

Hình 1.5 Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA sang

tế bào thực vật [36]

1.3.3 Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen

Các cây được chuyển trồng trên giá thể có nguồn gốc in vitro được gọi là

cây T0 Ở thế hệ T0, cây chuyển gen được xác nhận sự có mặt của gen chuyển

1.3.3.1 Phân tích bằng phương pháp PCR và Southern blot

Phương pháp PCR

Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính DNA và tái bản DNA Phản ứng được thực hiện khi có sự tham gia của: (i) DNA khuôn, (ii) Các đoạn DNA oligonucleotide (là đoạn DNA ngắn), (iii) DNA polymerase bền nhiệt, như Taq

polymerase (enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus), (iv) dNTP, (v)

Dung dịch đệm và ion Mg2+ Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn ở nhiệt độ khác nhau:

- Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong

20-40 giây để mồi gắn vào sợi DNA đơn Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi DNA, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là, mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu Nếu quá cao, mồi có thể không gắn Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với

Tm của mồi dùng trong phản ứng Liên kết hydro bền giữa phân tử DNA- DNA chỉ được hình thành khi mồi bổ sung hoàn toàn với khuôn

- Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các DNA

polymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75-80°C,

và nhiệt độ 72°C thường được sử dụng với enzyme này Tại giai đoạn này DNA polymerase tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùng ngưng xảy ra giữa nhóm 5′ - phosphate của dNTP với nhóm 3′ - hydroxyl phía cuối của sợi DNA vừa mới được hình thành Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase và độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại Thông thường, các DNA polymerase có khả năng khuếch đại được hàng nghìn bazo nito trên một phút Trong điều kiện không có hạn chế do giới hạn của cơ chất hoặc chất phản ứng thì sau mỗi giai đoạn kéo dài, số lượng DNA được khuếch đại sau mỗi chu kì tuần theo hàm mũ

- Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn này đôi khi được thực hiện ở nhiệt

độ 70-74°C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme polymerase dùng trong phản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo rằng tất cả DNA sợi đơn còn lại đều được tổng hợp hoàn toàn

Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4-15°C trong một thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng [4], [38]

Phương pháp Southern blot

Southern blot là kỹ thuật lai giữa DNA đích (đoạn DNA cần tìm) với

đoạn DNA dò (DNA đã biết trình tự trước hoặc probe) để cho phép phát hiện trình tự DNA đích [8],[12] và được ứng dụng thông thương trong nghiên cứu DNA của bộ gene, kiểm tra kết quả chuyển gene hoặc kiểm tra sự có mặt của một gene nào đó trong bộ gene của tế bào [46] Nguyên lý của kỹ thuật Southern blot dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA (phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hoá chất gây biến tính DNA như NaOH hoặc Formandehyt) và nguyên tắc bổ sung giữa các cặp nucleotide: A-T, G-C (các đoạn polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung) Áp dụng màng lai nitrocellulose hay nylon có khả năng tiếp nhận DNA Lai Southern đòi hỏi một đoạn DNA (RNA) đã biết trình tự để làm mồi “Probe” Probe được đánh dấu trước, các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR [46]

Kỹ thuật Southern blot gồm các thao tác (1) Tách chiết, làm biến tính các DNA sợi kếp thành sợi đơn, DNA tinh sạch được xử lý với kiềm, cắt bởi các enzyme giới hạn (RE) thành các đoạn kích thước khác nhau, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose; (2) Chuyển DNA đã biến tính từ gel agarose lên màng lai (nylon hoặc nitrocellulose); (3) Lai với mẫu dò (chuyển màng lai đã chứa DNA vào bể chứa dung dịch đệm và bổ sung DNA dò) và (4) Kiểm tra kết quả lai bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi, kết quả lai được phát hiện nhờ kỹ

(với đầu dò đánh dấu bằng biotin) hay dựa vào sự phát quang (với các đầu dò phát quang sinh học) để định vị DNA-probe [8], [46]

Phương pháp RT-PCR

Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (Reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR) là một kỹ thuật trong phòng thí nghiệm kết hợp giữa sao chép ngược (phiên mã ngược) RNA thành DNA (trong bối cảnh này được gọi là DNA bổ sung hoặc cDNA) và khuếch đại các mục tiêu DNA cụ thể bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) [12]

Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự từ RNA gồm 2 giai đoạn (1) tổng hợp trình tự DNA 2 sợi từ sợi RNA làm khuôn (2) trình tự DNA 2 sợi làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR [12]

Phản ứng biến đổi RNA thành DNA phải nhớ enzyme phiên mã ngược (reverse tráncriptase) được gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở nhiệt độ 50-55 C trong 30 phút Sau khi có sản phẩm DNA 2 sợi thì phản ứng tiếp theo là PCR thông thường gồm 3 giai đoạn RT-PCR được sử dụng để nhân RNA của retroviruus hoặc mRNA tách từ tế bào chất

Quy trình tiến hành phản ứng RT-PCR bao gồm 2 giai đoạn chính như:

- Giai đoạn 1 (RT): 1 chu kì, thực hiện sao chép ngược từ RNA sợi đơn sang cDNA sợi ghép ở nhiệt độ 50-55 C trong 30 phút

- Giai đoạn 2 (PCR): (1) Biến tính ở nhiệt độ 94 - 95 C/1 phút; (2) Tiếp hợp mồi ở 40 - 65 C; (3) Tổng hợp cDNA ở 72 C/1 phút

Kết quả của phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của các yếu tử như: DNA

khuôn, Taq polymerase, mồi (primer), nhiệt độ nhóng chảy của mòi, ion Mg++, nguyên liệu là các dNTP, nước, dung dịch đệm…

Sản phẩm PCR cùng với DNA chỉ thị (marker) dược kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel ảgarose 0,8 - 2% [39] Tiến hành chụp ảnh trên ảnh sáng đèn UV để xác định sự có mặt của đoạn DNA được nhân bởi PCR [12]

Phương pháp semi quantitative PCR (qPCR)

PCR bán định lượng (qPCR) cung cấp một phương pháp nhanh chóng để

ước tính lượng thông điệp tương đối trong quần thể RNA bằng cách sử dụng một gen quản lý đã biết làm tiêu chuẩn nội bộ để chuẩn hóa mức độ biểu hiện của gen mục tiêu quan tâm [8],[12]

Phản ứng RT-PCR chủ yếu được sử dụng để đo lượng RNA cụ thể Điều này đạt được bằng cách theo dõi phản ứng khuếch đại bằng huỳnh quang, một

kỹ thuật gọi là PCR thời gian thực, còn gọi là PCR định lượng (qPCR) Phương pháp kết hợp RT-PCR và qPCR với nhau thường được sử dụng để phân tích biểu hiện gen và định lượng RNA của virus trong các nghiên cứu và thực nghiệm lâm sang [53]

Sự kết hợp chặt chẽ giữa RT-PCR và qPCR đã dẫn đến việc sử dụng một cách hoán dụ thuật ngữ qPCR với nghĩa là RT-PCR Việc sử dụng như vậy có thể gây nhầm lẫn vì RT-PCR có thể được sử dụng mà không cần đến qPCR, ví

dụ để cho phép nhân bản phân tử, giải trình tự gen hoặc phát hiện RNA đơn giản Ngược lại, qPCR có thể được sử dụng mà không cần đến RT-PCR, ví dụ

để định lượng số lượng bản sao của một đoạn DNA cụ thể

1.4 Một số thành tựu trong nghiên cứu chuyển gen ở cây thuốc lá

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens trở thành một công cụ quan trọng nhất trong chuyển gen thực vật

với các mục đích nhữ tăng khả năng chống chịu, nâng cao năng suất và chất lượng, cải thiện khả năng tích lũy dĩnh dưỡng và tăng cường các họp chất có hoạt tính sinh học [27] Trong vài năm trở lại đây các nhà nghiên cứu đã thực hiện xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen ở nhiều loại cây thiết yếu trong lĩnh vực lương thực-dược phẩm và nông lâm nghiệp, trong đó có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen vào thuốc lá

Kết quả nghiên cứu chuyển gen GmCHI1A để tăng hàm lượng isoflavone dạng aglucone vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A tumefaciens là tiền đề

Hồng Trang, Chu Hoàng Mậu và Nguyễn Hữu Quân (2019) Trong nghiên cứu

đã dùng chủng vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp mang vector chuyển gen

pCB301_GmCHI1A có nguồn gốc từ cây đậu tương vào cây thuốc lá giống

K326 và tạo cây thuốc lá chuyển gen Từ 90 mẫu biến nạp đã tạo được 30 cây thuốc lá chuyển gen sinh trưởng phát triển bình thường trong điều kiện nhà lưới, hiệu suất chuyển gen là 33,33% Kết quả phân tích PCR thu được 22 cây

thuốc lá chuyển gen có gen chuyển GmCHI1A và hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn phân tích này là 24,44% Gen chuyển GmCHI1A được xác nhận sự có mặt

ở cây thuốc lá bằng phân tích RT-PCR [11]

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen của Lò Thanh Sơn (2015) trong định hướng cải thiện kích thước bộ rễ nhằm nâng cao khả năng chịu hạn

của cây đậu tương đã nhận xét rằng, gen chuyển GmEXP1 (Expansin) được xác

định tồn tại trong hệ gen của các dòng cây thuốc lá, hiệu suất chuyển gen đạt 5

% Kết quả nghiên cứu xác định được gen chuyển di truyền ổn định và biểu hiện protein expansin tái tổ hợp qua thế hệ T0 và T1 Trong điều kiện hạn và không gây hạn, các dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả năng kéo dài rễ chính cao hơn so với đối chứng từ 34,56 % - 41,23 % [16] Đặc biệt, Lò Thanh Sơn

đã thành công chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84 nhờ A tumefaciens và tạo được cây đậu tương chuyển gen T0 cho sản phẩm dương tính với PCR Protein expansin tái tổ hợp được biểu hiện ở một dòng cây đậu tương chuyển gen và hiệu suất chuyển gen đạt 0,27 % [33]

Nghiên cứu chuyển gen kháng chống mọt (ZmDEF1) nhờ Agrobacterium

tumefaciens vào giống thuốc lá C9-1 của Vì Thị Xuân Thủy và cộng sự (2017)

Kết quả cho thấy, biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào 60 mảnh lá của

giống thuốc lá C9-1 trong 3 lần thí nghiệm thu được 56 mảnh sống sót, tạo được 69 chồi, chuyển được 12 cây chuyển gen ra trồng trong bầu đất và có 6 cây trồng tại nhà lưới sinh trưởng, phát triển bình thường, biểu hiện xanh tốt,

mập mạp Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở các dòng thuốc lá

chuyển gen bằng phản ứng PCR thu được 5/6 dòng cây chuyển gen chứa gen

chuyển ZmDEF1, hiệu suất chuyển gen đạt 8,33 % [18]