Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu việt nam thuộc chi đảng sâm (codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạch

Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô quan sát bằng mắt và vi mô quan sát tiêu bản hiển vi của mẫu vật.. Trong t

Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạch

Nguyễn Thị Thanh Nga

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: PGS.TS Đinh Đoàn Long

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Tìm hiểu chi codonopsis; tổng quan về mã vạch AND (DNA barcode);

một mã vạch AND được sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu; ứng dụng mã vạch AND trên thực vật Trình bày các phương pháp nghiên cứu: tách chiết AND tổng số; kiểm tra sản phẩm AND sau tách chiết; phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR; tinh sạch sảm phẩm PCR và giải trình tự; phương pháp phân tích

số liệu Kết quả nghiên cứu: tách chiết AND tổng số; khuyếch đại vùng gen nghiên

cứu bằng kỹ thuật PCR

Keywords Sinh học; Di truyền học; Đa dạng di truyền; Cây dược liệu; Kỹ thuật

AND mã vạch

Content

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây thuốc trồng Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới hơn 20.000 tấn mỗi năm Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể Những số liệu này cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh tế - xã hội Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự nhau

Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên

La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử dụng Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện không hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng các thuốc thảo mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị tương đối phổ biến hiện nay

Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát tiêu bản hiển vi) của mẫu vật Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế Vì vậy, các phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác các loài cây thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của chúng đã được phát triển vào cuối những năm

1990 Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất

cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản lâu dài

Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài

Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN” Đề tài góp phần xác định các mã vạch

có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN của một gen mã

vạch như ITS, matK, trnK

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chi Codonopsis

1.1.1 Phân loại học

Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:

 Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)

 Giới: Plantae (Thực vật)

 Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)

 Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)

 Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm)

 Phân lớp: Asteriades

 Bộ: Asterales (Bộ Cúc)

 Họ: Campanulaceae (Họ Hoa chuông; Cát kiến)

 Phân họ: Campanuloideae

 Chi: Codonopsis

1.1.2 Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố

Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn Rễ

hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có nhiều vết sẹo lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn

Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, mép nguyên, màu xanh hơi pha vàng, mặt trên

có lông nhung, mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có lông rải rác, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4

cm Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài tràng hình chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc sắp rụng trở thành màu vàng nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nhụy hơi dẹt, bao phấn đính gốc Quả bổ đôi, hình chùy tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng, có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng

Hình 1 Hình thái loài Codonopsis pilosula

Một số loài Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm

có:

- Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): cây thảo lâu năm, thân mọc bò hay leo Rễ hình

trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm Lá mọc đối có khi mọc cách hay hơi vòng Hoa (Hình

1) mọc đơn độc ở nách lá Đài 5, Tràng hình chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5 Bầu 5

ô, quả nang, phía trên có một núm nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ

- Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) còn có

tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô

(Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân leo Rễ hình

trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít khi mọc so le hình

tim, nhẵn hoặc có ít lông, đầu lá nhọn, mép lá

nguyên hoặc có khía răng nhỏ, bấm vào lá có

nhựa mủ Phiến lá dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm

Hoa (Hình 2) mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông

màu trắng hoặc hơi vàng, họng có vân tím

Hình 2 Hoa của loài C javanica

- Đảng sâm hoa xanh (Codonopsis viridiflora M.xim) lá mọc đối hay mọc cách, dài 2 –

3 cm, hai mặt đều có lông gai ngắn, lá nguyên không có răng cưa, cuống lá tương đối ngắn, Hoa mọc đơn trên ngọn, tràng hình chuông, dài khoảng 1 cm màu xanh vàng, trong có nếp nhăn ngắn Loài này mới chỉ tìm thấy ở khu tự trị A-pa tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc

- Đảng sâm hoa ống (Codonopsis tubulosa Kom) cây thảo thân lá đều có lông dài, lá

hẹp dài hình bầu dục, 3-8cm, đuôi lá có răng thưa Cánh hoa sâu, dài bằng nửa ống hoa, tràng

hình ống, dài độ 3cm, phân bố ở khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc

- Xuyên đảng sâm (Codonopsis tangshen

Oliv); hình thái cơ bản giống loài C pilosula

(Franch) Nannf nhưng lá hình trứng hay hình

trứng đuôi nhọn, mặt lá không có lông, chỉ rìa

lá có lông nhung Sau khi ra hoa (Hình 3) thì

có quả đuôi màu trắng tím, trong hoa có sọc

nhỏ màu tím, cuống dài, hình dẹt, to hơn loại

trên, ở chổ núi cao mưa nhiều về mùa thu quả

chín không nứt

Hình 3 Hoa Codonopsis tangsheng

- Đảng sâm mõm chó (Codonopsis nervosa Nannf) lá mọc đối, hình trứng dài 1-1,5cm, mép

nguyên, hai mặt đều có lông Hoa (Hình 4a) có tràng hình chuông dài độ 1,5cm, màu lam

nhạt, trong có thới màu tím đậm

Ngoài ra còn có các loài Codonopsis lanceolata Benth et Hook (Hình 4b) có rễ hình chùy và loài Codonopsis ussuriensis Hemsl (Hình 4c) có rễ hình củ tròn, thường được trộn

lẫn với Codonopsis để bán ở Trung Quốc Ở Việt Nam, trong thời gian 1961 – 1985, Viện Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm (Codonopsis spp.) tập trung ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc;

còn ở phía Nam, chỉ có ở khu vực Tây nguyên Vùng phân bố tập trung nhất là các tỉnh Lai châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà Nẵng và Lâm Đồng

Hình 4 Hoa của các loài (a) Codonopsis nervosa, (b) Codonopsis lanceolata, và (c)

C ussuriensis

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ truyền

Bộ phận chính của Codonopsis được dùng làm thuốc là rễ Dựa vào chất lượng của rễ

sau khi thu hoạch, người ta chia ra làm 5 loại sau: Tây đảng sâm, Đông đảng sâm, Lộ đảng

sâm, Điều đảng sâm, Bạch đảng sâm

Về thành phần hóa học, trong rễ của Codonopsis đến nay đã tìm thấy sucrose,

glucose, fructose, galactose, arabinose, mannose, xylose, rhamnose, inulin, nhiều loại alcaloid, scutellarein glucoside, CP1 – 4, syringin, N-Hexyl b-D-glucopyranoside, ethyl a-D-fructofuranoide, tangshenoside I, choline

Codonopsis và các dịch chiết hoặc thành phần của chúng có các tác dụng dược lý như

sau: tác dụng tăng lực, tác dụng đối với hệ tiêu hóa, tác dụng đối với hệ tim mạch, tác dụng đối với máu và hệ thống tạo máu, đối với điều hòa huyết áp, đối với đáp ứng miễn dịch của

cơ thể, đối với hệ thần kinh trung ương, ngoài ra Codonopsis còn có tác dụng kháng khuẩn

Hiện nay ở Việt Nam, các loài thuộc chi Codonopsis được liệt vào Sách Đỏ Việt Nam

do bị khai thác thường xuyên, liên tục (gần như không có giới hạn), cùng với nạn tàn phá rừng làm nương rẫy (ở Tây Bắc, Tây Nguyên) cũng làm cho vùng phân bố tự nhiên của các loài này bị thu hẹp nhanh chóng

1.2 Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode)

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa) Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa

ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài

Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen

Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài Mã vạch được sử dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng của từng sản phẩm Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau :

(i) có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;

(ii) trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;

(iii) có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài

1.3 Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu

1.3.1 Mã vạch ADN ở động vật

Mã vạch ADN locut gen CO1 ở động vật thường được dùng rộng rãi do có các tiêu chí: đây là một gen đơn bội, được di truyền từ mẹ, gen này cho mức độ phân biệt cao Đó là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào Ở động vật, nó

có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ, hoặc thường xuyên lặp đi lặp lại đơn nucleotide Những đặc điểm này kết hợp với cặp mồi được thiết kế tốt, hiệu quả sử dụng gen CO1 để phân biệt nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất

sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài Nhiều nghiên cứu cho thấy CO1 giúp phân biệt được khoảng 98% các loài với nhau Trong phần còn lại, nó xác định hẹp đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các loài có mối quan hệ gần gũi, nói chung là các loài chỉ vừa mới tách ra hoặc các loài lai thường xuyên Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen ti thể Cytb (cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như ADN mã vạch trong nhận dạng

ở động vật

1.3.2 Mã vạch ADN ở thực vật

Nếu như các gen ti thể như CO1 và Cytb được dùng rộng rãi cho động vật và một số loài tảo, thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính bảo thủ

cao và vì vậy không phù hợp làm ADN mã vạch Thay vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như các vùng exon của các gen

rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng intron của các gen trnL và trnL-F) Một vùng trình tự

thông thường khác cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS nhân

(vùng đệm của tiểu đơn vị lớn ADN ribosome) Tính đến năm 2009, đã có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp

1.4 Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật

1.4.1 Ứng dụng ở thực vật nói chung

Nghiên cứu mã vạch ADN thực vật đã vượt xa nhiệm vụ so sánh các vùng ADN khác nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn Các ứng dụng này có thể được chia thành hai loại rộng Một là để cung cấp cái nhìn sâu hơn vào phân loại học ở cấp độ loài và đóng góp vào quá trình phân loại học: nhận diện và phân chia ranh giới giữa các loài Ứng dụng thứ hai, là hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật không nhận biết được hoặc chưa xác định được thuộc loài nào Mã vạch DNA thực vật có khả năng cung cấp cái nhìn sâu vào phân loại cấp

độ loài trong những nhóm có hình thái đơn giản, nhóm có phân bố rất rộng, nhóm có kích thước nhỏ, và / hoặc những nhóm đã được phân loại nhưng không đầy đủ, chưa tương xứng với đặc điểm đa dạng của chúng (ví dụ như một số trường hợp không thể dựa trên nguyên tắc phân loại hình thái học để đánh giá, phân loại, hoặc đã được phân loại nhưng chưa thực sự triệt để)

1.4.2 Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dƣợc liệu

Thực vật dùng làm thuốc thảo dược luôn cần được xác định ở cấp độ loài, vì vậy, xác định chính xác là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính của sự đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng như bảo vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng Cùng với sự phát triển của thị trường thảo dược, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu Các nguyên liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo Việc giả mạo các nguyên liệu thảo dược thường là do:

(i) vật liệu không phân biệt được bằng đăc điểm hình thái

(ii) những vật liệu có tên tương tự nhau, và

(iii) việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu khác

rẻ tiền hơn

Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một phần hoặc ở dạng bột Vì vậy, phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến hơn Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch ADN có thể bảo vệ người dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng Dưới đây trình bày một số

mã vạch ADN đã được nghiên cứu và ứng dụng trong các cây dược liệu

Vùng gen ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng xử lý tốt

nhất 6 mẫu của Hedyotis L có họ với Rubiaceae ITS đã được sử dụng thành công để phân biệt 14 lòai Hedyotis L, bao gồm cả loài chính thống trong phương thuốc điều trị khối u

“Baihuasheshecao” có nguồn gốc từ H diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H

corymbosa (L.) Lam

Maturase K trình tự này đã thành công trong việc xác định các loại thuốc thảo dược

"Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R tanguticum (Maxim ex Regel) Maxim ex Balf, R officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L với mức độ biến đổi

nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau

trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) và tỷ lệ sai khác là

83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbcL và matK Vì vậy, trnH - psbA

được coi như 1 trình tự hữu ích để phân biệt các loài thảo mộc với loài giả mạo nó Nó được

dùng để phân biệt loài giả mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.)Lindl ex Hook.f (Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw với tỷ lệ sai khác trong trình tự là từ

2% đến 3,1%

Tiểu đơn vị lớn của ribulose-bisphosphate carboxylase-rbcL trình tự này có chất

lượng cao khi làm thử nghiệm trên 7 locus Tuy mức độ biến đổi thấp giữa các loài khác nhau

nhưng rbcL vẫn cho phép nhận biết được nguyên liệu thảo dược với loại giả mạo nó (Ví dụ, thảo dược dương xỉ "Mianmaguanzhong" có nguồn gốc từ Dryopteris crassirhizoma Nakai (Dryopteridaceae) có 19 nucleotide là đa hình trong trình tự rbcL khi đối chiếu với loài giả

mạo)

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Các mẫu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu do Khoa Tài nguyên Dược liệu (Viện Dược Liệu, Bộ Y tế) cung cấp

Bảng 1 Địa điểm thu mẫu và thông tin mẫu sử dụng trong nghiên cứu

Chi thực vật Nhóm mẫu Địa điểm thu mẫu Kí hiệu mẫu

Codonopsis

Codonopsis sp C2

Codonopsis sp Thị trấn Sa Pa, Lào Cai C4 Đảng Sâm vỏ trắng Thôn I, xã Hòa Bình, TP Kontum C11; C12

Codonopsis sp Lô trồng T, Đa Sal, Lạc Dương,

Lâm Đồng

C13; C14;

C15

Codonopsis sp Mọc hoang, Đa Sal, Lạc Dương,

Lâm Đồng

C16; C17;

C18

Đảng Sâm Xã Long Hẹ, Huyện Thuận Châu,

Sơn La

C20; C21

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt từ các hãng uy tín đảm bảo về chất lượng và độ tin cậy như Qiagen, Fermentas, Sigma…

2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Một số thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu này gồm: cân điện tử Satorius

XB 200A (Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy đo ph, máy li tâm, máy PCR

2.1.4 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Hai cặp mồi được sử dụng để nhân bản đoạn hai gen đích là gen ITS và gen matK,

trình tự và thông tin về hai cặp mồi được thể hiện ở Bảng 5

Bảng 2 Các cặp mồi sử dựng trong nghiên cứu Gen

đích Tên mồi Trình tự mồi

Nhiệt độ gắn mồi

Kích thước

P1f 5’-ATT GAA TGG TCC GGT GAA GTG

ITS P2r 5’-AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG

TTA C-3’

matK

matK-390f 5’-CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT

matK-1326r 5’- TCT AGC ACA CGA AAG TCG

AAG T-3’

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số

Các mẫu thực vật được tách chiết lấy ADN tổng số bằng quy trình mini-CTAB và kit DNeasy® Plant Mini Kit của hãng Qiagen

2.2.2 Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết

ADN tổng số của các mẫu thực vật sau khi tách chiết sẽ được điện di trên gel agarose 1%, trong đệm TBE 1X, ở hiệu điện thế 90V với marker 1kb

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tổng số được kiểm tra qua phương pháp đo mật độ quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 và 280nm Pha loãng dịch chiết 100 lần (5µl mẫu + 450µl DDW), mỗi mẫu đo ba lần và giá trị trung bình của ba lần đo được lấy làm kết quả cuối cùng Độ tinh sạch của mẫu thể hiện qua thông số A260/280, thông thường A260/280=1,6-2.0 được coi là mẫu tinh sạch, nồng độ ADN của mẫu được tính thông qua giá trị 1,0A260=50µg/µl

2.2.3 Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR

Thể tích mỗi phản ứng PCR của mỗi mẫu là 25µl, được thực hiện trên máy PCR 9700

Quy trình nhiệt để nhân bản các đoạn gen được tóm tắt ở Bảng 6 Thể tích cụ thể của các thành phần trong một phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 7 và Bảng 8

Bảng 3 Thành phần của phản ứng PCR

Bảng 4 Chu trình nhiệt cho gen ITS

Bước Nhiệt

độ(o

C)

Thời gian Chu

kỳ Khởi

động

Biến tính 94 40s

35

Bảng 5 Chu trình nhiệt cho gen matK

Bước Nhiệt

độ(o

C)

Thời gian Chu

kỳ Khởi

động

Biến tính 94 30s

35 Gắn mồi 52 20s

Kéo dài 72 50s

2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gửi đi giải trình tự tại hãng Bioneer tại Hàn Quốc

2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu

Các chuỗi DNA được so sánh và liên kết với nhau bằng chương trình BioEdit trình

(phiên bản 4.1.4) Cây phát sinh được xây dựng dựa trên trình tự ADN của vùng gen ITS và gen matK bằng phương pháp tiết kiệm tối đa (MP) và Bayesian trên phần mềm PAUP

(version 4.0 beta 10)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết ADN tổng số

Chúng tôi đã tách chiết thành công 12 mẫu Codonopsis (xem Bảng 9)

Hình 5 Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%,

marker 1kb Bảng 6 Kết quả đo OD một số mẫu nghiên cứu

C12 1,61 121,5

3.2 Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR

Kết quả PCR thu được như sau: chúng tôi đã nhân thành công 11/12 mẫu Codonopsis

với gen ITS (Hình 6), 10/12 mẫu Codonopsis với gen matK (Hình 7)

Hình 6 Ảnh điện di một số sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu

Codonopsis trên gel agarose 1%, M: marker 100bp

Hình 7 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis trên gel

agarose 1%, M: marker 100bp

3.3 Phân tích kết quả

3.3.1 Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu