BÁO cáo PHÂN lập và TINH CHẾ SAPONIN cây CAM THẢO

Định tính saponin trong cây cam thảo...25 a Định tính Saponin trong cây cam thảo dựa trên tính tạo bọt...25 b Định tính Saponin trong cây Cam Thảo bằng phản ứng màu Liebermann-Burchard..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BM CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÁO CÁO

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ SAPONIN CÂY CAM THẢO

Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Ngọc Lan

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

LỜI MỞ ĐẦU 3

I TỔNG QUAN VỀ SAPONIN 4

1 Khái niệm 4

2 Cấu trúc hóa học và phân loại 5

2.1 Saponin triterpenoid 6

2.2 Saponin steroid 13

2.3 Nhóm saponin steroid alkaloid 15

2.4 Các nhóm khác 17

3 Tính chất của Saponin 17

4 Tác dụng sinh học và ứng dụng Saponin 18

II TỔNG QUAN VỀ CÂY CAM THẢO 19

1 Sơ lược 19

2 Mô tả 20

3 Phân bố, sinh thái 20

4 Chế biến và bảo quản 21

5 Thành phần hóa học 22

6 Tác dụng dược lí 22

7 Tính vị, công năng 23

8 Công dụng 23

III SAPONIN TRONG CÂY CAM THẢO 23

IV ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TRONG CÂY CAM THẢO 25

1 Định tính saponin trong cây cam thảo 25

a) Định tính Saponin trong cây cam thảo dựa trên tính tạo bọt 25

b) Định tính Saponin trong cây Cam Thảo bằng phản ứng màu Liebermann-Burchard 26

V PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT SAPONIN TỪ CAM THẢO 28

1 Chiết dựa vào dung môi 28

2 Chiết saponin bằng cách tủa trong môi trường axit 29

3 Chiết xuất Saponin bằng sắc ký cột Diaion HP-20 31

VI TÀI LIỆU THAM KHẢO: 31

KẾT LUẬN 32

Định tính saponin trong cây cam thảo: dựa trên tính tạo bọt, bằng phản ứng màu Liebermann-Burchard, bằng sắc ký lớp mỏng Định lượng Saponin trong cây Cam Thảo: bằng phương pháp cân, bằng phương pháp đo quang, bằng sắc ký lỏng cao áp 32

Chiết xuất Saponin: dựa vào dung môi, bằng cách tủa trong môi trường axit, bằng sắc ký cột Diaion HP-20 32

2

LỜI MỞ ĐẦU

Trong xã hội hiện đại ngày nay, khi mà cuộc sống con người ngày một nâng cao, môi trườngngày một ô nhiễm thì các sản phẩm, hoạt chất có nguồn gốc sinh học, có lợi cho sức khỏe luôn được quan tâm và phát triển

Một trong số những hoạt chất sinh học được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong y học hiện nay là Saponin

Vậy Saponin là gì? Saponin có ở đâu?

Saponin là một thành phần có trong cây cam thảo được biết đến hiện nay

Hãy cùng nhóm chúng tôi tìm hiểu về đề tài “Phân lập và tinh chế saponin cây cam thảo” để được giải đáp những thắc mắc trên nhé

I TỔNG QUAN VỀ SAPONIN

1 Khái niệm

Saponin (saponosid) là một nhóm các glycosid có phần Genin có cấu trúc Triterpen hay Steroid 27 carbon gặp rộng rãi trong thực vật, một số động vật thân mềm ở biển như: Hải Sâm, Sao Biển

Hải Sâm Sao Biển

Theo truyền thống, saponin thường được định nghĩa dựa trên một số tính chất chungđặc trưng của nhóm hợp chất này là:

 Làm giảm sức căng bề mặt, tạo nhiều bọt khi tiếp xúc với nước

 Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất thấp

 Độc đối với cá, diệt các loại thân mềm như giun, sán, ốc sên

 Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt

 Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid khác.Tuy nhiên không phải tất cả các saponin đều thể hiện đầy đủ các tính chất trên Ngàynay saponin thường được định nghĩa trên cơ sở cấu trúc hóa học đó là các triterpenglycoside hay các 27-C steroid glycoside

Các cây có chứa saponin được sử dugj rất lâu đời bởi nhiều dân tộc trên thế giới trongcuộc sống hằng ngày Do khả năng tạo bọt nên saponin được sử dụng như là các chấttẩy rửa tự nhiên Chính do đặc tính này mà chúng được gọi là saponin Các dược liệuchứa saponin cũng được sử dụng rất phổ biến trong y hovj cổ truyền, đặc biệt là y họcphương đông Nhiều saponin và dược chất có thành phần dược chất là sapnin vẫn rất

có giá trị trong y học hiện đại như các sản phẩm điều trị hay nguyên liệu đầu để bán

4

tổng hợp các thuốc khác, đặc biệt là các thuốc steroid Các tác dụng trị liệu củasaponin vẫn đang được tiếp tục khám phá.

Saponin

Thành phần của một Saponin

2 Cấu trúc hóa học và phân loại

 Như mọi glycosid, cấu tạo của Saponin gồm:

 Phần không đường (aglycon): Saponin, có thể 30C hay 27C

 Phần đường (glycon)

 Dựa vào cấu trúc hóa học, người ta chia Saponin thành 2 loại chính: SaponinTriterpen và Saponin Steroid

2.1 Saponin triterpenoid

Cấu trúc phần genin của saponin triterpenoid có 30 carbon, cấu tạo bởi 6 đơn vịhemiterpene nối với nhau theo quy tắc đầu đuôi hay nới cách khác cấu tạo bơi 3 đơn vịterpen nên có thể gọi như tên gọi trên Các saponin này được chia làm 2 loại: saponinterpenoid 5 vòng với khung triterpen có cấu trúc gồm 5 vòng và saponin triterpen 4 vòngvới khung triterpen có 4 vòng Dung hợp giữa các vòng A/b, B/C, VÀ C/D của cáctriterpenoid là trans còn D/E của sapogenin triterpenioid 5 vòng là cis

2.1.1 Saponin triterpenoid 5 vòng

Có 30C, chứa 5 vòng và 8 nhóm metyl

Loại này chia ra các nhóm: Oleanan, Ursan, LuPan, Hopan

a Nhóm oleanan: khung cơ bản là oleanan

Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này Phầnaglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn chất của 3β-hydroxy olean-12-ene,tức là β-amyrin

6

Dưới đây là một vài aglycon với các nhóm thế R khác nhau trên khung amyrin:

β Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = β CH3, R3 = β COOH

- Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CH2OH , R3 = -COOH

β-amyrin.

Acid oleanolic

- Gypsogenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CHO , R3 = -COOH.

Trong các sapogenin có cấu trúc β- amyrin thì acid oleanolic là genin phổ biếnnhất khi tạo glycosid, mạch đường thường nối vào C3 theo dây nối axetat, có khi mạchđường nối vào C28 theo dây nối este Người ta đã phân lập được các saponin thuộcnhóm này có đến 11 đơn vị thường trên cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 8 đơn vịđường

Các sapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3β-hydroxyursan-12-ene,tức là α-amyrin Những saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm oleanan

Ví dụ: Cinchona glycosid A, Cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na, asiaticosid có

trong rau má là những saponin của nhóm này

α-amyrin

Ví dụ: Saponin có trong rễ cây Ô rô Acanthus iliciformis Linn.: arabinofuranosyl-(1-4)- β-D glucoropyranosid (1-3)]-3-β-hydroxy-lup-20(29)- ene (IIIa).Một số saponin có trong cây ngũ gia bì chân chim cũng thuộc nhóm này.

Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A có trong cỏ thảm Mollugo hirta L

Nhóm Dammaran thường gặp trong cây thuộc chiPanax (chi Sâm) Ngoài ra, còn gặp trong hạt Táo, Rau đắng biển, Cổ yếm (Giảo cổ lam)

Nhóm phụ cycloartan: có cấu trúc 9,19-cyclo-(9β)-lanostan Các sponin abrusosid A, B,

C, D có trong cam thảo dây abrus precatorius

Aglycon có cấu trúc Steroid với khung cơ bản là khung Cholestan gồm 27C

a Nhóm spirostan

Cấu tạo giống Cholestan nhưng mạch nhánh từ C20 đến C27 tạo thành 2 dị vòng có oxylfa vòng E (Hydrofuran) và F (Hydropyran), nối với nhau qua 1 cầu carbon chung ở C22, tạothành mạch nhánh spiroacetal

Các Saponin nhóm này dùng làm nguyên liệu tổng hợp thuốc Steroid Quan trọng nhất là:+ Diosgenin (từ loài Dioscorea (cây củ mài, Mìa dò…)

+Hecogenin (từ các loài Agave…)

Cholestan

b Nhóm Furostan

Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi

Trường hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm alcol bậc một ở C-26 được nối với đườngglucose Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzym hoặc bởi acid) thì xảy ra sự đóng vòng Fthành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan Ví dụ sarsaparillosid dướitác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành parillin

Trường hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy Ví dụ avenacosid

có trong Yến mạch (Avena L) Avenacosid cũng có 2 mạch đường khi thủy phân cắt đường

glucose ở C-26 thì cũng chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan

2.3 Nhóm saponin steroid alkaloid

- Saponin có chưa N trong phân tử.

- Gọi là pseudoalkaloid.

- Thường gặp trong họ Solanaceae (họ cà)

a.Nhóm aminofurostan

 Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid nói ở trên nhưng ở vị trí C-3

đính nhóm NH2 Ví dụ jurubin, là saponin có trong Solanum paniculatum

14

b Nhóm spirosolan

- Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay bằng NH

c Nhóm solanidan

Solanum paniculatum

 Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này Ở đây 2 vòng E và F cùngchung 1C và 1N.

2.4 Các nhóm khác

Ngoài ra, còn gặp Saponin Steroid có cấu trúc mạch nhánh kiểu khác nhưng vẫn có

đủ 8C trên nhánh Vd: Osladin, Poplypodosaponin

Riêng Spinasterol có mạch nhánh 10C

3 Tính chất của Saponin

- Saponin thường có vị đắng, mùi nồng, gây hắt hơi.

- Đa số Saponin ở dạng vô định hình, tan trong nước, khó kết tinh.

- Tan nhiều trong cồn loãng, dung môi phân cực, ít tan trong hexan, benzen, eter.

- Sapogenin và dẫn chất acetyl dễ kết tinh, có tính tan ngược lại.

- Saponin thường có KLPT lớn, khó bị thẩm tích qua màng bán thấm, đa số Saponin

có khả năng quay cực

16

- Điểm chảy thường cao (200-300 độ C), đôi khi kèm theo sự phân hủy.

- Bị hấp phụ bởi: kaolin, megnesium oxid, tinh bột, polyamid, than động vật.

- Bị thủy phân bằng acid tạo các sapogenin tương ứng.

- Có thể tạo artefact (genin giả) do acid mạnh, dùng điều kiện nhẹ như enzym hay

quang xúc tác

- Có tính hoạt động bề mặt => Tính tạo bọt

- Có khả năng làm vỡ hồng cầu => tính phá huyết

- Kích ứng niêm mjac, hắt hơi, đỏ mắt, nôn mửa.

- Độc với cá: làm tăng tính thấm của biểu mô hô hấp, làm cá mất điện giải.

- Tạo phức với Cholesterol

- Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm,

ức chế virus

- Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm

- Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể)

- Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid

- Digitonin dùng để định lượng cholesterol

- Một số nguyên liệu chứa saponin dùng để pha nước gội đầu, giặt len dạ, tơ lụa

II TỔNG QUAN VỀ CÂY CAM THẢO

1 Sơ lược

Cam thảo là rễ và thân phơi hay sấy khô của cây cam thảo nguồn gốc vùng Uranhay cây cam thảo châu Âu, còn có tên là bắc cam thảo, sinh cam thảo, diêm camthảo, phấn cam thảo, quốc lão

Gọi là cam thảo vì cam là ngọt, thảo là cỏ, tức là cỏ có vị ngọt

Hình 1: Cây cam thảo

Tên khoa học: Glycyrrhiza uralensis Fisch (Tên gọi đối với cây cam thảo có

nguồn gốc từ vùng Uran) hay Glycyrrhiza glabla L (hay G glandulifera Waldst

et Kit -Đối với cây Cam Thảo có nguồn gốc châu Âu)

Tên thông thường: cam thảo, Licorice, Alcacuz, Alcazuz, Bois Doux, Bois

Sucré, Can Cao, Chinese Licorice, Deglycyrrhized Licorice, Gan Cao, Gan Zao, Gla

Cây thuộc họ Đậu – Fabaceae

Chữ Glycyrrhiza được giải thích là: trong chữ Hy lạp glykos là ngọt và riza là

rễ, tức là rễ có vị ngọt Uralensis là có nguồn gốc ở vùng núi Uran, dãy núi nằm

giữa châu Á và châu Âu.bra, Glycyrrhiza

18

2 Mô tả

Cam thảo là cây thảo, sống lâu năm, cao 0.3- 1m Rễ dài có màu vàng nhạt Thân có long mềm, ngắn Lá kép long chim lẻ, mọc so le, gồm 9- 17 lá chét hình trứng, mép nguyên

Hình 2: Tổng quan cây cam thảo

Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành bông, hoa màu tím nhạt hình cánh bướm

Quả như quả đậu, cong hình lưỡi liềm, rộng khoảng 6- 8mm, màu nâu đen, có

Hình 3: Cành lá và hoa cây cam thảo

3 Phân bố, sinh thái

Cây cam thảo trước đây không có ở nước ta, cây mọc hoang nhiều ở Liên Xô

cũ, Trung Quốc, nhiều nước cây mọc như một loại cỏ hoang khó diệt

Những nơi cam thảo mọc hoang là nơi có đất khô, đất có canxi, đất cát, Những nơi có đất đen cứng chắc, kiềm tính và ẩm thấp thì chất lượng cam thảo kém hơn

Đến năm 1958, cây được trồng thử ở một số nơi tại Việt Nam (Văn Điên, Tam Đảo, Sa Pa, Hải Dương), cây mọc khỏe vào mùa xuân hạ và thu, đến mùa đông thì lụi đi và kém phát triển, sang năm cây lại mọc tốt trở lại

4 Chế biến và bảo quản

 Bộ phận dùng: Thân và rễ cây của cây cam thảo được thu hái và sử dụng làmdược liệu

Hình 4: Cam thảo thái phiến

 Chế biến: Rửa sạch nhanh và xắt mỏng thành lát khoảng 2mm Sau đó đem sấy và phơi khô Một số dạng chế biến khác của cam thảo, bao gồm:

 Chế biến chích cam thảo: Dùng cam thảo sấy khô tẩm mật ong (trung bình 1kg cam thảo dùng 200mg mật ong + 200ml nước đun sôi) Sao vàng cho khô, đợi khi cam thảo dậy mùi thơm là được

 Chế biến bột cam thảo: Cạo bỏ lớp vỏ bên ngoài, sau đó xắt thành miếng, sấy khô và tán thành bột.Phấn cam thảo: Cạo sạch lớp vỏ bên

20

ngoài và tiến hành ngâm rượu trong khoảng 1 giờ Tiếp tục ủ trong 12giờ đồng hồ và cắt mỏng, sau đó đem phơi khô.

 Bảo quản: Bảo quản cam thảo ở nơi khô thoáng và kín gió

Hình 5: Tác dụng dược lí cây cam thảo

 Tác dụng giải độc: Giải độc rất mạnh với tác dụng của bạch hầu, chất

độc của cá lợn, của rắn, hiện tượng choáng, độc tố uốn ván… tác dụng này được cho là của glycyrrhizin

 Tác dụng trên hô hấp: Giúp giảm ho, long đườm, hay được dùng phối

hợp trong các bài thuốc trị ho

 Tác dụng trên đường tiêu hóa: Tác dụng giải co thắt cơ trơn ống tiêu

hoá (ứng dụng trong điều trị hội chứng ruột kích thích); chữa loét dạ dày,

ức chết tác dụng gây tang tiết dịch vị của histamine; chữa táo bón; trị các vết loét trong bộ máy tiêu hóa tương tự cortisol

 Tác dụng với gan: Bảo vệ gan trong viêm gan mạn tính và tang bài tiết

mật Chống viêm gan và chống dị ứng

 Tác dụng với thận: Giúp lợi tiểu.

 Dùng điều trị bệnh Addison (còn được gọi là suy tuyến thượng thận

nguyên phát hoặc suy thượng thận, bệnh phát sinh từ các vấn đề với tuyến thượng thận do không đủ hormone steroid cortisol): Cam thảo có

7 Tính vị, công năng

Cam thảo có vị ngọt, tính bình, quy vào

12 kinh trong cơ thể Có tác dụng bổ tỷ,

vi, nhuận phế, thanh nhiệt giải độc, điều

hòa các vị thuốc

8 Công dụng

 Cam thảo sống được dùng chữa cảm,

ho mất tiếng, viêm họng, mụn nhọt,đau dạ dày, ỉa chảy, ngộ độc

 Cam thảo chích có tác dụng bổ, chữa

tỳ vị hư nhược, ỉa lỏng, than thể mệtmỏi, kém ăn

Hình 6: Cam thảo dùng để chữa

cảm, ho

III SAPONIN TRONG CÂY CAM THẢO

Glycyrrhizin là một saponin thuộc nhóm olean, hàm lượng từ 10-14% trong dược liệu khô, chỉ có trong bộ phận ở dưới mặt đất, có vị rất ngọt (gấp 60 lần đường saccharose) Đây là saponin quan trọng nhất của rễ cam thảo Glycyrrhizin được Robiquet phân lập năm 1809 dưới dạng mảnh màu vàng Glycyrrhizin tinh khiết ở dạng bột kết tinh trắng dễ tan trong nước nóng, cồn loãng, không tan trong ether và chloroform Glycyrrhizin ở trong cây dưới dạng muối Mg và Ca của acid glycyrrhizic (còn gọi là acid glycyrrhizinic)

Dưới tác dụng của acid vô cơ, acid glycyrrhizic bị đẩy ra khỏi muối của nó Khi thủy phân bằng acid thì cho phần aglycon là acid glycyrrhetic (còn gọi là acid glycyrrhetinic) và 2phân tử acid glucuronic Acid glycyrrhetic có một OH ở C-3 (2 phân tử acid glucuronic nối vào đó), một nhóm carbonyl ở C-11, một nối đôi ở C-12-13 và ở C-30 là nhóm carboxyl

22

Glycyrrhizin trên thị trường là muối ammoni glycyrrhizat thu được bằng cách chiết bột cam thảo với nước rồi acid hoá để kết tủa, rửa tủa rồi lại hoà tan trong ammoniac, bốc hơi trong các khay mặt bằng sẽ thu được những vẩy màu đen nhạt, bóng, tan trong nước và rất ngọt.

Hình 7: Cấu trúc hóa học Glycyrrhizin

Trong cam thảo còn có các dẫn chất triterpenoid khác như: acid liquiritic (acid này khác acidglycyrrhetic bởi nhóm carboxyl ở C-29), acid 18-a-hydroxy-glycyrrhetic, acid 24-

hydroxyglycycrrhetic, glabrolid, desoxyglabrolid, isoglabrolid, 24-a-hydroxyisoglabrolid, acid liquiridiolic, acid 11-desoxoglycyrrhetic, acid 24-hydroxy 11-desoxoglycyrrhetic