Tuy nhiên, đối với sâm Ngọc Linh, việc chọn giống bằng phương pháp lai tạo hầu như rất khó xảy ra do sự suy giảm diện tích vùng sâm tự nhiên cùng với việc sử dụng không kiểm soát đã dẫn
Trang 1Đ ánh giá di truyền cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng chỉ thị phân tử RAPD
Article · September 2015
CITATIONS
0
READS 770
3 authors:
Some of the authors of this publication are also working on these related projects:
The role of silver, cobalt and iron nanoparticles overcoming some abnormal phenomena and improving the plant quality of Gerbera jamesonii cultured in vitro View project
A participant of Nafosted project: Research on new techniques in micropropagation and Paphiopedilum spp - Code 106-NN.01-2015.02 View project
Tung Thanh Hoang
Tay Nguyen Institute for Scientific Research VAST
107PUBLICATIONS 146CITATIONS
SEE PROFILE
Bui Van The Vinh
Ho Chi Minh City University of Technology (HUTECH)
24PUBLICATIONS 126CITATIONS
SEE PROFILE
Nhut Duong Tan
Tay nguyen Institute for Scientific Research
178PUBLICATIONS 2,139CITATIONS
SEE PROFILE
All content following this page was uploaded by Tung Thanh Hoang on 17 September 2018.
Trang 2ĐÁNH GIÁ SỰ ỔN ĐỊNH DI TRUYỀN CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS
HA ET GRUSHV.) BẰNG CHỈ THỊ RAPD
Bùi Văn Thế Vinh 1 , Vũ Thị Thủy 2 , Hoàng Thanh Tùng 2 , Vũ Thị Hiền 2 , Trần Xuân Tình 2 , Đỗ Khắc Thịnh 3 , Dương Tấn Nhựt 2
Ngày nhận bài: 15.01.2015
Ngày nhận đăng: 30.3.2015
TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử RAPD để phân tích di truyền của cây sâm Ngọc
Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được di thực từ núi Ngọc Linh (thuộc địa phận 2 tỉnh Quảng Nam và
Kontum) đến khu vực Cổng trời thuộc vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà (tỉnh Lâm Đồng) so với cây bản địa Trong số 15 chỉ thị phân tử RAPD được sử dụng, có 1 chỉ thị (OPB-13) không cho sản phẩm khuếch đại, 14 chỉ thị còn lại tạo ra được 93 băng đồng hình và 5 băng đa hình (chiếm tỉ lệ 5,1%) Kết quả phân loại dựa theo
hệ số tương đồng di truyền đã chia 10 mẫu nghiên cứu thành 2 nhóm chính, trong đó nhóm 1 gồm 4 cây thu nhận từ Lâm Đồng và 2 cây thu nhận từ Quảng Nam có hệ số tương đồng 0,9820 và nhóm 2 gồm 2 cây thu nhận từ Kontum và 2 cây thu nhận từ Quảng Nam có hệ số tương đồng 0,9762 Hình ảnh phân tích điện di sản
phẩm RAPD với 12 mồi cho thấy 32 cây con sâm Ngọc Linh in vitro được đánh giá đều cho kết quả đồng hình
Các cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính này được chuyển ra vườn ươm và trồng thử nghiệm trên các loại giá thể khác nhau cho tỉ lệ sống sót cao (đạt trên 60%) Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp phát sinh phôi
vô tính có khả năng tạo ra số lượng lớn cây con sâm Ngọc Linh có sự ổn định di truyền cao
Từ khóa: tương đồng di truyền, sâm Ngọc Linh, Panax vietnamensis, phôi vô tính, chỉ thị RAPD
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâm Ngọc Linh hay còn gọi là sâm Khu 5, có
tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv.,
thuộc họ nhân Sâm (Araliaceae) Đây là loài cây
dược liệu quí đặc hữu của Việt Nam có thành phần
ginsenoside được đánh giá vào loại nhiều nhất so với
các loài khác của chi Panax trên thế giới và có nhiều
công dụng trong việc chữa bệnh cũng như chăm sóc
sức khỏe đối với con người (Dương Tấn Nhựt et al.,
2010) Chính nhờ những giá trị dược lý to lớn như
vậy mà nhu cầu đối với sâm Ngọc Linh ngày càng
gia tăng dẫn tới việc khai thác, mua bán, sử dụng mất
kiểm soát và gần như không còn tồn tại trong tự
nhiên Cây sâm Ngọc Linh được đưa vào trong sách
đỏ Việt Nam với mức độ đe dọa ở bậc E, là loài thực
vật có giá trị đặc biệt về khoa học và kinh tế, có số
lượng, trữ lượng rất ít đang có nguy cơ bị tuyệt
chủng, nghiêm cấm khai thác ngoài tự nhiên Trong
một nỗ lực nghiên cứu di thực cây sâm Ngọc Linh ra
khỏi vùng phát triển tự nhiên ở đỉnh núi Ngọc Linh
thuộc địa phận 2 tỉnh Quảng Nam và Kon tum,
chúng tôi đã tiến hành trồng thử nghiệm 200 cây ở khu vực Cổng trời thuộc vườn Quốc gia Bidoup Núi
Bà từ năm 2010
Với mục đích bảo tồn và phát triển nguồn gen quí hiếm của Quốc gia đồng thời phát triển những vùng trồng để cung cấp nguyên liệu cho ngành dược,
từ lâu công tác tạo nguồn giống sâm Ngọc Linh đã được đề cập đến với hai hình thức chủ yếu là nhân giống từ hạt và tạo giống từ đầu mầm (thân rễ ngầm) nhưng kết quả đạt được còn hạn chế Theo báo cáo quy hoạch bảo tồn và phát triển cây sâm Ngọc Linh giai đoạn 2014-2020 của Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Quảng Nam, cây sâm Ngọc Linh 4 – 5 năm tuổi mới bắt đầu ra hoa kết quả, bình quân một cây cho từ 10 đến 30 hạt, tỉ lệ nảy mầm khoảng gần 70%, cây mầm phải được chăm sóc cẩn thận trong vườn ươm 1 – 2 năm tuổi mới đem trồng Đối với phương pháp nhân giống bằng đầu mầm, khi thu hoạch sâm, cắt lại phần đầu mầm thân rễ dài khoảng 3 – 4 cm, rải trên giàn trong vườn ươm 1 tháng cho khô đất bên ngoài mới đem trồng với tỉ lệ sống và đâm chồi đạt 65% Tuy nhiên, hiện nay số
Trang 3lượng sâm giống tạo ra chưa đáp ứng được nhu cầu
trồng trọt hàng năm Thêm vào đó là sự chủ quan,
thiếu kinh nghiệm trong công tác tạo giống đã làm
cho bài toán về nhân giống sâm Ngọc Linh ngày
càng trở nên khó khăn và phức tạp
Lai tạo là phương pháp chọn giống phổ biến trên
các đối tượng cây trồng, cây cảnh và cây ăn quả Tuy
nhiên, đối với sâm Ngọc Linh, việc chọn giống bằng
phương pháp lai tạo hầu như rất khó xảy ra do sự suy
giảm diện tích vùng sâm tự nhiên cùng với việc sử
dụng không kiểm soát đã dẫn đến sự suy giảm đáng
kể đa dạng di truyền, làm giảm tiềm năng di truyền
của quần thể tự nhiên của loài đặc hữu quý hiếm này
Điều này có nghĩa là đối với sâm Ngọc Linh có rất ít
nguồn gene đã biết được sử dụng cho mục đích lai
tạo để tạo ra giống mới Do vậy, để đáp ứng được
nhu cầu nguồn cây giống đang ngày càng gia tăng
hiện nay, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm
nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh (Nguyễn Ngọc
Dung, 1995; Dương Tấn Nhựt et al., 2010) Gần đây,
chúng tôi đã phát triển phương pháp vi nhân giống
sâm Ngọc Linh thông qua con đường phát sinh phôi
vô tính từ mẫu cấy lá (Bùi Văn Thế Vinh et al.,
2014) Việc ứng dụng phương pháp phát sinh phôi
vô tính ở cây sâm Ngọc Linh hứa hẹn sẽ mang lại
nhiều ưu điểm vì có thể tạo ra một số lượng lớn cây
con có chất lượng tốt trong một thời gian ngắn, tỉ lệ
sống sót của cây con ngoài vườn ươm cao do cây
con phát triển từ phôi vô tính theo con đường tương
tự như phôi hữu tính
Trong những nghiên cứu nhân giống vô tính đối
với các loài cây dược liệu, có thể xác định mức độ
đồng nhất của quần thể cây con bằng phương pháp
phân tích định lượng các hợp chất biến dưỡng thứ
cấp Tuy nhiên, phương pháp phân tích này cần một
số lượng mẫu lớn cũng như cần thời gian phát triển
kéo dài Do đó, các nhà khoa học thường sử dụng
các kỹ thuật phân tích di truyền như RAPD để xác
nhận mức độ ổn định về mặt di truyền của các cây
con được nhân giống vô tính (Rani et al., 1995; Goto
et al., 1998; Carvalho et al., 2004; Martins et al.,
2004) Phương pháp này cũng được sử dụng để đánh
giá sự khác biệt về mặt địa lý của các loại cây dược
liệu (Mizukami et al., 1993; Nakai et al., 1996), xác
định các cây thuộc chi Panax (Shaw và But, 1995)
và đánh giá quan hệ di truyền giữa các loài cây dược
liệu và các hợp chất biến dưỡng thứ cấp của chúng
(Yamazaki et al., 1994)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ
thuật RAPD để đánh giá sự ổn định di truyền của cây
sâm Ngọc Linh được tái sinh thông qua con đường
phát sinh phôi vô tính qua trung gian mô sẹo Kết quả nghiên cứu này sẽ giúp định hướng thiết lập quy trình nhân giống, giúp sản xuất cây sâm Ngọc Linh với số lượng lớn trong thời gian ngắn bằng kỹ thuật
vi nhân giống
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Nguồn mẫu ex vitro được sử dụng là các mẫu lá
của 4 cây sâm Ngọc Linh 4 năm tuổi được thu nhận
từ khu vực di thực sâm Ngọc Linh ở rừng Quốc gia Bidoup Núi Bà thuộc huyện Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng (ký hiệu LD1, LD2, LD3, LD4); 2 cây được thu nhận từ nông trường sâm Ngọc Linh ở xã Măng
Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum (ký hiệu KT5, KT6); 4 cây được thu nhận từ trại sâm Ngọc Linh ở xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam (ký hiệu QN7, QN8, QN9, QN10)
Nguồn mẫu in vitro được sử dụng là 32 cây con
được nhân giống thông qua con đường phát sinh phôi vô tính qua trung gian mô sẹo (Bùi Văn Thế
Vinh et al., 2014) tại Phòng Sinh học phân tử và
Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên
Phương pháp tách chiết DNA
Các mẫu lá và cây con sâm Ngọc Linh sau khi thu nhận được tách DNA tổng số theo quy trình của
bộ kit EZ-10 Spin Column Plant DNA MiniPreps (Biobasics) Nồng độ DNA tổng số được ước lượng bằng cách điện di trên gel agarose 1%, nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng Edithium bromide nồng độ 10 mg/ml trong 15 phút Quan sát
và phân tích các vệt băng bằng đèn UV Nếu kết quả tách chiết tốt, không làm đứt gãy DNA, vệt băng sẽ sáng rõ nét và ngược lại
Phân tích bằng chỉ thị RAPD
Sử dụng 15 mồi RAPD có trình tự được trình bày trong bảng 1 Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR Eppendorf với tổng thể tích phản ứng 25 µl gồm những thành phần sau: 1,0 µl DNA tổng số (100 ng/µl), 2,5 µl mồi RAPD (0,2 µM), 12,5 µl MyTaq
các thành phần của hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo chương trình đã được cài đặt sẵn: 1 chu kỳ 94°C trong 4 phút, theo sau là 40 chu kỳ (94°C trong 30 giây, 35°C trong 1 phút, 72°C trong 2 phút)
và cuối cùng là 1 chu kỳ 72°C trong 10 phút
Trang 4Bảng 1 Danh sách các mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu
Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có
mặt của chúng trên bản điện di của các mẫu nghiên
cứu theo DNA thang chuẩn (DNA marker) Nếu một
vệt băng DNA (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở
mẫu i nhưng không xuất hiện ở mẫu j hoặc đồng thời
xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các
mẫu khác thì vệt băng DNA đó được gọi là băng đa
hình Ngược lại, nếu vệt băng DNA nào xuất hiện ở
tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình
(Nguyễn Mạnh Hoa et al., 2014)
Các băng DNA được mã hóa dưới dạng nhị
phân, nếu xuất hiện băng DNA thì ký hiệu là 1 còn
nếu không có thì ký hiệu là 0 Các số liệu này sau đó
được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf,
2008) để tính ma trận tương đồng giữa các đôi theo
phương pháp UPGMA theo mức độ xa gần về mặt di
truyền và vẽ thành sơ đồ hình cây trong TREE
DISPLAY
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Đánh giá di truyền của cây sâm Ngọc Linh có
nguồn gốc địa lý khác nhau
Sau khi tách chiết DNA tổng số từ các nguồn vật
liệu và tiến hành điện di sản phẩm, kết quả được chỉ
ra trong hình 1 cho thấy DNA được tách chiết có băng vạch đậm, rõ nét và không tạo vệt dài, chứng tỏ DNA được tách với hàm lượng lớn, không bị đứt gãy, đạt tiêu chuẩn có thể dùng cho phản ứng PCR-RAPD
Kết quả quan sát cho thấy có 1 mồi không thể hiện khếch đại bất cứ băng hình nào (OPB-13), 14 mồi cho sản phẩm khếch đại trên tất cả các mẫu, trong đó có 2 mồi (OPA-05, OPB-14) chỉ cho duy nhất 1 băng đồng hình (Bảng 2) Kích thước các vệt băng trong khoảng từ 100 đến 2800 bp Kết quả thu được tổng số 98 vệt băng/15 mồi với giá trị trung bình 6,5 vệt băng/1 mồi
RAPD là chỉ thị nhân ngẫu nhiên các đoạn DNA trong genome trên cơ sở phương pháp PCR dùng một đoạn mồi Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở một vị trí bất kỳ mà tại đó có trình tự bổ sung với nó Chỉ thị RAPD phát hiện tính
đa dạng đáng tin (sự mất đoạn nhiễm sắc, sự thay đổi, thêm bớt nucleotide, xen đoạn,… đều làm thay đổi
kích thước đoạn khuếch đại) (Nguyễn Văn Giang et al., 2013) Tuy nhiên, phương pháp này rất nhạy cảm
với các yếu tố tham gia phản ứng như: thành phần
Trang 5phản ứng, điều kiện thí nghiệm, độ lặp lại, khoảng
cách thích hợp giữa 2 điểm bắt cặp mồi và đặc biệt là
nhiệt độ gắn mồi cần tuân thủ nghiêm ngặt quy trình
(Shim et al., 2003)
Kết quả được trình bày trong bảng 2 cho thấy tỉ
lệ băng đa hình đạt được tương đối thấp (5,1%) Đối
với mồi nhân OPB-01, 100% số mẫu đều cho sản
phẩm khuếch đại PCR Kết quả được chỉ ra trong
hình 2a cho thấy có 7 vạch băng được tạo ra với kích
thước dao động từ 300 đến 2800 bp, trong đó có 1 băng đa hình với kích thước 1800 bp xuất hiện ở cả 2 mẫu sâm được thu nhận từ Kontum (KT5, KT6) và 2 mẫu sâm được thu nhận từ Quảng Nam (QN8, QN10) Trong khi đó cả 4 mẫu sâm được di thực
Hình 1 Ảnh điện di sản phẩm tách chiết DNA của 10 mẫu lá sâm Ngọc Linh
Hình 2 Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 10 mẫu lá sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác nhau với mồi OPB-01 (a), OPO-08
(b), OPE-11 (c), OPD-20 (d), OPC-08 (e) và OPA-08 (f)
Trang 6đang trồng ở khu vực Cổng trời thuộc vườn Quốc
gia Bidoup Núi Bà (Lâm Đồng) không có sự xuất
hiện của vạch băng đa hình này Tương tự như
vậy, 4 mẫu KT5, KT6, QN8, QN10 cũng tạo 1
băng đa hình tại vị trí 1000 bp trong khi đó cả 10
mẫu phân tích đều cho 2 vạch băng đồng hình có
kích thước 400 và 600 bp khi thực hiện phản ứng
RAPD với mồi OPO-08 (Hình 2b) Sự khác nhau
về số lượng và vị trí của các băng có thể cho biết được sự khác nhau về trình tự DNA giữa các giống Bên cạnh đó, nhiều mẫu có cùng các vệt băng đa hình do chúng đều xuất phát từ cùng một giống chỉ khác nhau về mặt địa lý (Nguyễn Thị
Lang et al., 2007)
Bảng 2 Kết quả tổng hợp các băng DNA khi phân tích 10 mẫu sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác nhau bằng chỉ thị RAPD
với 15 mồi ngẫu nhiên.
Trong tự nhiên, cây sâm Ngọc Linh phát triển chủ
yếu dưới tán rừng nguyên sinh ẩm, nhiều mùn, có
nhiệt độ thích hợp ban ngày từ 20°C - 25°C và ban
đêm từ 15°C - 18°C ở độ cao 1700 - 2000 m của núi
Ngọc Linh thuộc 2 huyện Đăk Tô, tỉnh Kontum và
huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam Từ năm 2010,
chúng tôi đã tiến hành di thực và trồng thử nghiệm
cây sâm Ngọc Linh ở khu vực Cổng trời thuộc vườn
Quốc gia Bidoup Núi Bà với hệ sinh thái rừng thuộc
kiểu rừng kín thường xanh, lá rụng, độ cao trung bình
từ 1700 - 1800 m, nhiệt độ 15 - 20°C, độ ẩm 80 -
90% Mặc dù có điều kiện tự nhiên, địa lý, khí hậu,
thổ nhưỡng tương đối giống nhau nhưng xét về mặt
hình thái, các cây sâm Ngọc Linh sau 4 năm phát triển
ở Lâm Đồng có các chỉ số phát triển (chiều cao cây,
số lá, bề rộng lá) đều thấp hơn so với cây cùng độ tuổi
được trồng ở núi Ngọc Linh Bên cạnh đó, màu sắc lá cũng phản ánh sự khác biệt giữa cây di thực (vàng) và cây bản địa (xanh) (dữ liệu chưa được công bố) Tuy
có sự khác nhau về mặt hình thái nhưng kết quả đánh giá di truyền cho thấy sự tương đồng lớn giữa 2 nhóm LD1, LD2, LD3, LD4, QN7, QN9 và KT5, KT6, QN8, QN10 (Hình 3)
Kết quả được chỉ ra trong bảng 3 cho thấy hệ
số di truyền tương đồng từng cặp rất cao (trên 92,8%) Hệ số tương đồng cao nhất (đạt 100%) là giữa 4 cây LD1, LD2, LD3, LD4 được thu nhận trong tổng số 200 cây được nhân giống vô tính và trồng ở vườn Quốc gia Bidoup Núi Bà từ năm
2010 Hệ số tương đồng thấp nhất là giữa cây QN8 và QN9 (đạt 92,86%)
Trang 7Xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 cũng thu
được kết quả phân loại các mẫu nghiên cứu theo cây
phân loại (Hình 3) Theo cây phân loại dựa theo hệ
số tương đồng di truyền đã chia 10 mẫu nghiên cứu
thành 2 nhóm chính, trong đó nhóm 1 gồm 6 cây LD1, LD2, LD3, LD4, QN7, QN9 có hệ số tương đồng 0,9820 và nhóm 2 gồm 4 cây KT5, KT6, QN8, QN10 có hệ số tương đồng 0,9762
Bảng 3 Bảng ma trận tương đồng của 10 cây sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác nhau
QN7 0.97959 0.97959 0.97959 0.97959 0.93878 0.95918 1.00000
QN8 0.94898 0.94898 0.94898 0.94898 0.96939 0.96939 0.94898 1.00000
QN9 0.97959 0.97959 0.97959 0.97959 0.93878 0.93878 0.97959 0.92857 1.00000
QN10 0.96939 0.96939 0.96939 0.96939 0.98980 0.96939 0.94898 0.97959 0.94898 1.00000
Artyukova và đồng tác giả (2000) khi phân tích
đa dạng di truyền của các quần thể sâm Hàn Quốc
(Panax ginseng) bằng kỹ thuật RAPD đã kết luận
rằng mức độ đa dạng di truyền của các quần thể
sâm tự nhiên (10,6%) cao hơn so với các quần thể
sâm trồng (7,6%) Trong một nghiên cứu khác, Li
và đồng tác giả (2011) đã tiến hành phân tích 282
cây thuộc 16 quần thể Nhân sâm khác nhau và kết luận mức độ đa dạng di truyền chỉ đạt 4,9% Đối
với sâm Mỹ (Panax quinquefolius), Erin và Marla
(2012) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể tự nhiên phát triển ở vùng Bắc Mỹ Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ
đa dạng di truyền đạt 11% Mức độ đa dạng di
Hình 3 Sơ đồ mối quan hệ di truyền của 10 cây sâm Ngọc Linh có nguồn gốc khác nhau
Trang 8truyền ở sâm Ngọc Linh nói riêng và ở các loài
thuộc chi sâm nói chung rất thấp, điều này làm
giảm tiềm năng di truyền của quần thể dẫn đến
những hạn chế trong việc lai tạo để tạo ra giống
mới
Đánh giá ổn định di truyền của cây sâm Ngọc
Linh in vitro có nguồn gốc từ phôi vô tính
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 12 mồi
ngẫu nhiên: OPA-08, OPB-01, OPB-05, OPB-08,
OPC-08, OPC-15, OPD-11, OPD-20, OPM-11,
OPO-08, OPE-11, OPF-05 để phân tích tính ổn định
di truyền của 32 cây con in vitro có nguồn gốc từ
phôi vô tính Kết quả nhận được cả 12 mồi đều cho
biểu hiện các băng đồng hình có kích thước 100 -
2800 bp (Hình 4)
Tính đồng nhất về mặt di truyền là yêu cầu tiên quyết trong kỹ thuật vi nhân giống đối với bất kỳ
loại cây trồng nào (Carvalho et al., 2004; Martins et al., 2004) Tuy nhiên, vấn đề đối với nuôi cấy in vitro là sự xuất hiện các biến dị soma giữa các dòng
vô tính có nguồn gốc từ một cây mẹ ban đầu (Larkin
và Scowcroft, 1981) Dạng biến dị này được công bố xảy ra trên một số loài thực vật và cung cấp thêm những nguồn tính trạng mới phục vụ cho công tác chọn tạo giống cây trồng tương tự như các dạng đột
biến hóa chất và vật lý (Skirvin et al., 1993; Jain, 1998; Moghaieb et al., 2010) Các biến dị soma
không thể dự đoán trước được và có thể di truyền hoặc không
Để phát hiện các biến dị soma xảy ra trong quá
trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật, nhiều kỹ thuật
phân tích di truyền đã được sử dụng nhưng thường
chỉ cho biết những thay đổi trên nhiễm sắc thể mà
không đánh giá được những biến đổi trên từng gene
riêng biệt (Reda et al., 2011) Các kỹ thuật như phân
tích isozyme là một phương pháp khá thuận lợi để
xác định những biến đổi về mặt sinh hóa mặc dù
phương pháp này thường bị giới hạn số lượng chỉ thị
ít (Brown et al., 1993) Một kỹ thuật có thể xác định
chính xác những thay đổi trong trình tự của một gene
chuyên biệt là RFLP Tuy nhiên, phương pháp này
rất đắt tiền và tốn thời gian trong khi kết quả chỉ giới
hạn đối với trình tự gene được sử dụng như là mẫu
dò (Brown et al., 1993) Nhiều nhà khoa học đã
khẳng định có thể sử dụng các kỹ thuật phân tử dựa vào PCR như RAPD, ISSR hay ALFP để đánh giá tính ổn định di truyền của các cây con được nuôi cấy
in vitro ở nhiều loài thực vật khác nhau như Prunus dulcis (Martins et al., 2004), Malus domestica (Modgil et al., 2005), Pinus thunbergii (Goto et al., 1998), Brassica oleracea (Leroy et al., 2001), Digitalis obscura (Gavida et al., 1996)
Kỹ thuật RAPD được sử dụng để xác nhận tính
ổn định di truyền trong vi nhân giống chồi cây
Pinus thunbergii (Goto et al., 1998), nhân chồi nách cây hạt dẻ (Carvalho et al., 2004) và cây hạnh nhân (Martins et al., 2004) Trong khi đó, các biến
dị di truyền cũng được báo cáo trong vi nhân giống
D
Hình 4 Ảnh điện di sản phẩm RAPD của cây sâm Ngọc Linh in vitro có nguồn gốc từ phôi vô tính với mồi OPB-01 (A),
OPO-08 (B) và OPB-05 (C, D)
C
Trang 9ở một số loài thực vật như Pinus tremuloides
(Rahman và Rajora, 2001) và Actinidia deliciosa
(Palombi và Damiano, 2002) nhờ sử dụng các chỉ
thị RAPD
Mặc dù trong nghiên cứu này không phát hiện
bất kỳ một khác biệt về mặt di truyền nào tuy nhiên
một số dạng biến dị có thể xảy ra mà không được
phát hiện như các đột biến điểm xảy ra ngoài vị trí
bắt cặp của mồi ngẫu nhiên được sử dụng Các đột
biến này có thể được tạo ra do các thành phần dinh
dưỡng trong môi trường nuôi cấy, do nồng độ và tỉ lệ
auxin-cytokinin, do thời gian nuôi cấy kéo dài, do
các điều kiện không tự nhiên trong môi trường nuôi
cấy gây ra stress in vitro, do nhịp ngày đêm bị thay
đổi (Modgil et al., 2005) Các mô thực vật nuôi cấy
phải chịu stress oxi hóa ở nhiều mức độ khác nhau
do các gốc oxi tự do được tạo ra bên trong tế bào, các gốc oxi tự do này là nguyên nhân gây ra sự tổn
thương DNA (Jackson et al., 1998)
Trong nghiên cứu này, không có sự khác biệt giữa các băng hình được tạo ra bởi 12 mồi ngẫu
nhiên trên 32 cây con in vitro được nhân giống thông
qua con đường phát sinh phôi vô tính Bên cạnh đó, kết quả phân tích mức độ tương đồng di truyền giữa
32 cây con in vitro có nguồn gốc từ phôi vô tính đạt
trên 99% (Hình 5) Do đó, phương pháp này có thể được sử dụng để nhân giống cây sâm Ngọc Linh với
số lượng lớn với độ ổn định di truyền cao Cây con
in vitro được chuyển ra vườn ươm và trồng trên 2
loại giá thể khác nhau (đất mùn và đất sạch Dasi) đạt
tỉ lệ sống sót tương ứng 62% và 57% sau 4 tháng trồng (Hình 6)
Hình 5 Sơ đồ mối quan hệ di truyền của 32 cây con sâm Ngọc Linh in vitro có nguồn gốc từ phôi vô tính
Hình 6 Cây con sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ phôi vô tính được trồng trên giá thể đất mùn (a) và đất sạch Dasi (b)
Trang 10KẾT LUẬN
Khi sử dụng chỉ thị RAPD đánh giá mối quan hệ
di truyền của 10 cây sâm Ngọc Linh có nguồn gốc
khác nhau cho thấy mức độ tương đồng cao (trên
92,86%) Đối với cây con sâm Ngọc Linh in vitro có
nguồn gốc từ phôi vô tính, mức độ ổn định di truyền
đạt được trên 99%
Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Dự
án sản xuất thử nghiệm “Ứng dụng hệ thống chiếu
sáng đơn sắc (LED) trong nghiên cứu nhân nhanh
cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) với số lượng lớn phục vụ nhu cầu nhân
giống của tỉnh Quảng Nam.)” (Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam) đã hỗ trợ kinh phí cho
nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Artyukova EV, Kozyrenko MM, Koren OG, Muzarok TI,
Reunova GD, Zhuravlev YN (2000) RAPD Analysis of
the genome variability of planted Ginseng, Panax ginseng
Mol Biol, 34: 297-302
Brown PTH, Lang FD, Kranz E, Lorz H (1993) Analysis
of single protoplasts and regenerated plants by PCR and
RAPD technology Mol Genet Genomics, 237: 311-317
Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Thái Thương Hiền,
Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy,
Trịnh Thị Hương, Vũ Thị Hiền, Lê Kim Cương, Đỗ
Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014) Nghiên cứu một
số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi vô
tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) in vitro Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12(1):
73-84
Carvalho LC, Goulao L; Oliveira C; Goncalves JC,
Amancio S (2004) RAPD assessment for identification of
clonal identity and genetic stability of in vitro propagated
chestnut hybrids Plant Cell Tiss Org Cult, 77(1): 23-27
Dương Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực,
Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn
Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Cửu
Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái
Thương Hiền, Nguyễn Thành Hải (2010) Nhân giống vô
tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3B): 1211-1219
Erin MS, Marla SM (2012) RAPD-based assessment of
genetic relationships among and within American ginseng
(Panax quinquefolius L.) populations and their
implications for a future conservation strategy Genet
Resour Crop Evol, 59: 1553–1568
Gavida I, Agudo LC, Pérezbermúdez P (1996) Selection
and long-term cultures of high-yielding Digitalis obscura
plants: RAPD markers for analysis of genetic stability
Plant Sci, 121(2): 197-205
Goto S, Thakur RC, Ishii K (1998) Determination of genetic stability in long-term micropropagated shoots of
Pinus thunbergii Parl using RAPD markers Plant Cell Rep, 18(3-4): 193-197
Jackson AL, Chen RU, Lawrence LA (1998) Induction of
Microsatellite instability by oxidative DNA damage Proc National Academy Sci Uni States America, 95 (21):
12468-12473
Jain SM (1998) Plant biotechnology and mutagenesis for
sustainable crop improvement Crop Improvement for Stress Tolerance (Eds Behl et al.) CCSHAU, New Delhi,
India: 218-232
Larkin PJ, Scowcroft WR (1981) Somaclonal variation – a novel source of variability from cell cultures for plant
improvement Theor Appl Genet, 60: 197-214
Leroy XJ, Leon K, Hily JM, Chaumeil P, Branchard M
(2001) Detection of in vitro culture induced instability through inter-simple sequence repeat analysis Theo App Gen, 102(6-7): 885-891
Li S, Li J, Yang XL, Cheng Z, Zhang WJ (2011) Genetic
diversity and differentiation of cultivated ginseng (Panax ginseng C A Meyer) populations in North-east China
revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers
Genet Resour Crop Evol, 58: 815-824
Martins M, Sarmento D, Oliveira MM (2004) Genetic stability of micropropagated almond plantlets as assessed by
RAPD and ISSR markers Plant Cell Rep, 23(7): 492-496
Mizukami H, Ohbayashi K, Umetsu K, Hiraoka N (1993) Restriction fragment length polymorphisms of medicinal
plants and crude drugs II Analysis of Glehnia littoralis of different geographical origin Biol Pharm Bull, 16:
611-612
Modgil M, Mahajan K, Chakrabarti SK, Sharma DR, Sobti
RC (2005) Molecular analysis of genetic stability in
micropropagated apple rootstock MM106 Sci Hort,
104(2): 151-160
Moghaieb REA, Abdel-Hadi AA, Ahmed MRA, Hassan AGM (2010) Genetic diversity and sex determination in
date palms (Phoenix dactylifera L.) based on DNA markers Arab J Biotechnol, 13(2): 143-156
Nakai R, Shoyama Y, Shiraishi S (1996) Genetic
characterization of Epimedium species using random
amplified polymorhic DNA (RAPD) and PCR-restriction
fragment length polymorphism (RFLP) diagnosis Biol Pharm Bull, 19(1): 67-70
Nguyễn Mạnh Hoa, Bùi Thị Thu Hương, Hồ Mạnh Tường,
Lê Văn Sơn (2014) Đánh giá đa dạng di truyền một số