(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây lan hài đốm (Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor)

Ở THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2020

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor)

Ở THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Lan Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2020

Thái Nguyên - 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

T x y tr u t t ệ ƣ s

ƣ TS Vũ T ị L Mọ trí tr uậ vă ều rõ uồ

ố Cá số ệu, kết quả u tr uậ vă tru t v ƣ từ

bố tr ột tr k á

Thái Nguyên, ngày tháng 12 năm 2020

Tác giả

Trần Thị Thu Trang

ị k t uật v p t í ệm Khoa ã tạ ều kiệ úp ỡ tôi trong quá trình làm luậ vă t ạ sĩ

Tôi xin cảm ơ ình và bạn bè luôn bên cạnh ng hộ, khuyến khích, ộng viên tạ ộng l ể tôi hoàn thành luậ vă y

Trong quá trình làm luậ vă k trá k ỏi những sai sót, tôi mong nhậ ƣợc s ó óp quý báu từ phía thầy cô và bạ bè ể tôi hoàn thành bản luậ vă

Thái Nguyên, ngày tháng 12 năm 2020

Tác giả

Trần Thị Thu Trang

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấ ề 1

2 Mục tiêu nghiên c u 2

3 Nội dung nghiên c u 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Gi i thiệu về lan H v H Đốm 4

1.1.1 Phân loại lan Hài (Paphiopedilum) 4

1.1.2 N uồ ố 5

1.1.3 Đặ ể t á 6

1.1.4 Đ ều kiệ s t á 7

1.1.5 H ệ trạ y H V ệt N 8

1.1.6 Đặ ểm th c vật học c H Đốm 12

1.2 P ươ p áp ố v tí in vitro 14

1.2.1 Quy trình nhân giống in vitro [20] 14

1.2.2 Cá p ươ p áp ố v tí H Đốm 16

1.3 Tình hình nghiên c u lan Hài trên thế gi v tr ư c 17

1.3.1 Trên thế gi i 17

1.3.2 Tron ư c 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đố tượng và vật liệu nghiên c u 27

2.2 Đị ểm và thời gian nghiên c u 28

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên c u 28

2.3.1 Hóa chất 28

iv

2.3.2 Thiết bị 28

2.3.3 Dụng cụ 29

2.4 P ươ p áp u 29

2.4.1 P ươ pháp khử trùng chồi non 29

2.4.2 P ươ p áp k ử trùng quả Đốm 30

2.4.3 Nghiên c u ảnh ưởng c trường t i khả ă ảy mầm c a hạt lan H Đốm 30

2.4.4 P ươ p áp chồi in vitro 30

2.4.5 Nghiên c u ả ưởng c NAA ến khả ă r rễ c H Đốm 31

2.4.6 P ươ p áp ư cây ra ngoài t nhiên 31

2.4.7 P ươ p áp ă sóc H Đốm ở ư i 32

2.4.8 P ươ p áp p tí v xử lí số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên c u p ươ p áp k ử trùng m u 33

3.2 Nghiên c u ả ưởng c a tuổi quả v trường t i khả ă ảy mầm c a hạt l H Đốm 36

3.3 Nghiên c u ả ưởng c a một số chất ều s trưở ến khả ă nhân nhanh và s s trưởng c a chồ H Đốm 40

3.3.1 Ả ưởng c a BAP kết hợp v NAA ến khả ă v sinh trưởng c a chồ H Đốm non sau khi nảy mầm 40

3.3.2 Ả ưởng c a nồ ộ BAP ến khả ă ồi 44

3.4 Nghiên c u ả ưởng c NAA ến khả ă r rễ c H Đốm 49

3.5 Nghiên c u ư y in vitro r vườ ươ 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 67

vi

DANH MỤC BẢNG

Bả 1.1: Cá ó H V ệt N t t ạ bả tồ Tổ

Bả tồ T Quố tế IUCN 10 Bảng 2.1: Hóa chất nghiên c u 30 Bảng 2.2: Thiết bị nghiên c u 30 Bảng 3.1: Ả ưởng c a thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% ối v i chồi H Đốm sau 2 tuần 37 Bảng 3.2: Hiệu quả c a chế ộ khử trù ối v i quả lan Hài Đốm 38 Bảng 3.3: Ả ưởng c a tuổi quả v trường t i khả ă ảy mầm

c a hạt lan Hài Đốm 40 Bảng 3.4: Kết quả nghiên c u ả ưởng c a BAP kết hợp v i NAA ến khả ă v s trưởng c a chồ H Đốm sau 50 ngày 46 Bảng 3.5: Ả ưởng c a nồ ộ BAP ến khả ă nhân chồi và sinh

trưởng c a chồi in vitro 49

Bảng 3.6: Kết quả nghiên c u ả ưởng c NAA ến khả ă r rễ c a

y H Đốm in vitro 55

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái lan Hài Đốm 13

Hình 2.1: Đố tượng và vật liệu nghiên c u 29

H 2.2: Sơ ồ thí nghiệm 31

Hình 3.1: Tái sinh l H Đốm bằng p ươ p áp ạt 42

Hình 3.2: Ả ưởng c a BAP kết hợp v NAA ế s trưởng c a chồi H Đốm non sau 50 ngày 47

Hình 3.3: Chồi lan Hài Đố s trưở tr trường bổ sung BAP ở các nồ ộ từ 1 – 4mg/l sau 4 tuần 50

Hình 3.4: Chồ H Đố s trưở tr trường bổ sung BAP ở các nồ ộ từ 1 – 4mg/l sau 8 tuần nuôi cấy 51

Hình 3.5: Ả ưởng c a NAA t i khả ă r rễ c H Đốm 56

Hình 3.6: Cây lan Hài Đố s trưởng và phát triển ở nhà ư i 57

Việt Nam là quố ược t ưu ã , ó ộ ạng sinh học cao, phong lan Việt N ạng về số loài, màu sắc và ch ng loại v i trên 140 ạ

ọ t uộ ố y hài Vệ Nữ Sabot de Venus v ườ A ù v ý

ĩ tươ t Lady's slippers [1] H ệ y, V ệt N ã t t ấy k ả 22

t uộ Paphiopedilum tr ó ó ều ặ ữu ó á trị ỉ xuất

ệ tạ V ệt N ư H Đỏ, H V , H Tí , H Trắ , Hài Vân, lan Hài Vân Duyên, lan Hài Đố , H L y H R u,…[1] Lan H Đố ột tr ữ H ượ t t ấy s ất ở

V ệt N Ngoài tên l H Đố ượ ọ l H Gấ y Vạ Đ ể Hài, chúng t ườ ọ ở ãy ú ó sươ ù b p ư Bắ Cạ , Bắ

học H ệ y, ố bằ k t uật u ấy in vitro p át tr ể ạ

ẽ ó t ể tạ r số ượ y , sạ bệ , ổ ị về ặt truyề trong ột t ờ ắ v áp ượ t ị trườ ượ ột ả pháp

ý tưở ể bả tồ H k ỏ uy ơ bị tuyệt [13] Những nghiên c u ng dụng các k thuật nuôi cấy mô tế b ể nhân nhanh các loài lan

H ặc hữu ở Việt Nam còn ít và kết quả t u ược còn rất hạn chế do gặp nhiều

k ó k ă tr k u v u c a quy trình nhân giống các loài này, kết quả thu ược m i chỉ t b ầu ở một vài giố ư H Hằng [2], Hài Hồng [3], Hài Bóng [4]

Xuất p át từ ữ vấ ề t t ễ ở tr ú t t ế ề t :

“Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây Lan Hài Đốm

(Paphiopedilum concolor) ở Thái Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nhân giống thành công cây lan H Đốm (Paphiopedilum concolor bằ

p ươ p áp ố in vitro óp p ầ bả tồ v u ấp y ố

sả xuất

15

bư : K ử trù bề ặt u vật v uẩn bị á trường nuôi cấy Cấy

u vật v ố ệ ặ b u ấy ó s trườ tạ

ạ y ạ ấy u in vitro Cá u nuôi cấy nếu không bị

nhiễm khuẩ , ấ , v rus sẽ ượ u tr p u i cấy v ều kiện nhiệt ộ á sá p ù ợp S u ột t ờ ất ị , từ u u ấy ã bắt ầu xuất ệ á ụ tế b ặ á ơ qu ặ á p v tí G

ạ y p ụ t uộ v từ ố tượ ố , t t ườ k

từ 2 – 12 t á ặ ít ất 4 ầ ấy uyể [23]

1.2.1.3 Nhân nhanh chồi

Đ y ạ sả xuất y ố quyết ị ệu quả quá tr

u ấy , y ượ t u ầu ườ u ấy K u

ấy sạ ã ược tạ r , từ ó ậ ượ á ụ ồ v á p v tí s trưở tốt tr quá tr u ấy sẽ bư v ạ sả xuất N ườ t ầ

tạ r tố ộ ất tr ều k ệ u ấy T p ầ v ều kiệ trườ ầ tố ưu á ể tạ ượ ụ t u Đố v trườ ồ , ườ t sử ụ á ất kí t í s trưở t uộ ó

yt k BAP, k t v ồ ộ k á u tuỳ từ ố tượ y Quy

tr ấy uyể ể ồ t ườ tr k ả 1 – 2 t á tuỳ loài cây, tỷ lệ nhân nhanh khoả 2 – 8 ầ s u ột ầ ấy uyể N u

16

t ườ t t ế ạ t ếp t ư y r trườ t

v uyể r vườ ươ C y u ấy in vitro ượ s trưở v p át

tr ể tr ữ ều k ệ tố ưu về ệt ộ, ộ ẩ , pH, ưỡ V vậy trư k ư r trồ , ườ t ầ uấ uyệ y ể t í v ều k ệ

t Quá tr t í v ều k ệ b y ở ạ ầu

y u ầu ầ ượ ă só ặ b ệt V vậy y ượ uyể từ trườ từ

bã ơ ư s vườ ươ v ữ ều k ệ k ó k ă ơ vườ

ươ ầ p ả áp á y u ầu: y bằ v ó ệ t ố p u sươ u ấp ộ ẩ v át y, á t ể trồ y ó t ể ất ù , ặ

tá y ã trưở t r k ỏ y ẹ Tuy nhiên tỷ lệ hạt nảy mầm trong

t nhiên lại rất thấp vì hạt lan Hài quá nhỏ, không ch a chất d trữ và chỉ có một

p ư p ó k t ể phát triể t p ươ t b t ườ ược

ó á H rất hiếm dạng dại vì thế ệu quả ố t ấp

k áp u ầu t ị trườ [12] P ươ p áp u ấy in vitro

S ảy ầ v tr Paphiopedilum, t qu s kết ợp ữu s

v v s , ột p ươ p áp p ổ b ế v ệ u ấy in vitro (Zeng et al., 2013) Ở P p p u , ã ó 58 p ươ p áp ảy mầm in vitro ược mô

tả, hoặc 80,6% trong số tất cả các nghiên c u in vitro Tuy nhiên, việc xử lý hạt

giống và tỷ lệ nảy mầm c a nhiều loài/cây Paphiopedilum là rất thấp v t ườ

bị ả ưở bở ều yếu tố k xá ị Ar tt , 2008 P r k t ,

1988 S t quá tr v ố Paphiopedilum từ á u

ấy ex vitro t tươ ố ạ ế uồ uy ệu ế , ữ k ó

k ă qu ế s ễ bẩ v k uẩ v ấ u ấy v s p át

18

tr ể k á u ấy số sót ư ều k ệ in vitro (Huang, 1988;

Stewart & Button, 1975) [63]

Cá u ầu t về u ấy H ượ t ệ bở Bub k

ă 1973, ã t ế u ấy p s 3 ạ H v 8 loại

H M trường nuôi cấy ch yếu sử dụng MS (1962) hoặc môi trường

y ư ó ải biên [34] Nă 1975, St w rt v cộng s t ế ả

ồ b ể tạ r sẹ , k ó s t ột v y tr quá

tr u ấy Tuy á sẹ rất k ó tá s , s u ột t ờ u ấy

ữ sẹ y sẽ ết V ý y ầu ết á u về u ấy

mô Paphiopedilum ều sử ụ uồ vật ệu b ầu từ ạt [63]

Kết quả nghiên c u c a Ding và cộng s (2004) về ả ưởng s chín c a hạt giố , trường nuôi cấy, nguồn carbon và các chất phụ gia hữu ơ ến s

nảy mầm, phát triển protocorm c a lan P.armeniacum ã t ấy khi sử dụng

hạt giố ạt 200 ngày tuổi tỷ lệ nảy mầm c a hạt ạt cao nhất trong khi tỷ lệ nảy mầm c a hạt sau thụ phấn 300 ngày là thấp nhất Đ ều này là do sau khi thụ phấn kéo dài thì hạt có hiệ tượng hình thành vỏ ượ qu sát ư i kính hiển

v v ó ã ă ản s hấp t u ưỡng c a hạt làm cho tỷ lệ nảy mầm giả á kể [40]

Theo Liu và cộng s (2006) thì loài lan Hài P.armeniacum có khoảng thời

gian từ khi hạt nảy mầ ến khi hình thành cây phải mất 4 ă [53] Những nỗ

l ể tạo ra các khối mô sẹo c a lan Hài từ á ạn gố , t ã k t công Tuy nhiên, một v H ã t tr v ệc tạo ra protocorm, mô sẹo, chồi, hạt Đ ều ó ch ng tỏ rằng lan Hài lai dễ ơ s

v i các loài bả ị D ó, việc nhân giống các loài lan Hài ch yếu ạt ược bằng cách tạo ra s cộng sinh c a hạt ể thuận lợi cho s nảy mầm c a hạt trong nuôi cấy mô [26], [32], [34]

Kết quả nghiên c u c a Lee (1998), Ding và cộng s (2004) cho thấy ảnh ưởng c a s trưởng thành hạt giố ến s nảy mầm phụ thuộc vào loài S nảy mầm c a hạt tươ ối thấp do nộ ũ k p át tr ển trong quá

19

trình phát triển c a hạt, ơ ữa vỏ hạt rất mỏng có thể k ể bảo vệ phôi từ s khô hạn S hình thành c a một l p biểu bì trên bề mặt phôi có thể

ảm bả uy tr ộ ẩm cho các tế b p ũ ư bảo vệ s tá ộng c a

ều kiện vật lý Tuy nhiên l p biểu bì làm giảm tỷ lệ nảy mầm c a hạt trong

ống nghiệm [48], [53] Theo Lee (1998) s nảy mầm c a loài P.delenatii tố ưu

tại thờ ểm 150 ngày sau thụ phấn (68%), tỷ lệ nảy mầm giảm mạnh khi hạt thu

ở 210 ngày sau thụ phấn do khi này hạt ã í ầy Ở 150 ngày sau thụ phấn, l p ut ượ t ầy và các tế b ã ã t k

b , ó p p s hấp t u ưỡng tốt nhất [47]

Chen và cộng s (2004a ã u s hình thành chồi tr c tiếp từ

mảnh lá c a các loài lan Hài lai Paphiopedilum phiIippinense (lai PH59 và

PH60) Mảnh cắt á ã tr c tiếp hình thành các chồi bất ịnh từ các vùng vết

t ươ tr v 1 t á , k u ấy tr trường MS bổ sung 2,4-D (0, 4,52 và 45,25 microM) và TDZ (0, 0,45, 4,54 và 22,71 M) Hai loại mảnh cắt (mảnh cắt lá nguyên vẹn dài 1,5 cm và mảnh cắt á 0,5 ược sử dụng Trong con lai PH59, khi bổ su 4,54 r M TDZ tă số ượng chồi trung bình từ các mảnh cắt lá Trong con lai PH60, 4,52 μM 2,4-D cộng v i 0,45 μM TDZ ã t ú ẩy s hình thành chồi tr c tiếp từ các mảnh cắt lá Cây con khỏe mạnh có 1-3 rễ nhậ ược sau khi chuyể trường không có hoóc môn trong 22 tháng Nhữ y y ược thích nghi trong nhà kính và phát triển tốt v i tỷ lệ sống 100% [35]

Các kết quả nghiên c u về thành phần mô trường nuôi cấy ến s nảy mầm

c a hạt lan Hài c a Lee và cộng s 2010 ã t ấy có mối quan hệ giữa ượng muố k á tươ ối thấp và nồ ộ N v ơ tr trường KC và

VW (nồ ộ muối khoáng KC: 13,42 mM; WV: 16,3 mM; nồ ộ N v ơ KC: 12,25 mM; VW: 3,78 mM ) S nảy mầ ạt cao nhất tr trường

KC Hiệu quả kích thích s nảy mầm c a hạt tr trường KC do có một

ượ x tươ ối cao nồ ộ (4,23 mM) so v i VW (1,94 mM), và ¼

MS, ½MS (0,75 và 1,5 mM) Việc cung cấp canxi ản ưở ế tă trưởng

20

và s phân chia nhân c a th c vật Pr t r t u ược trên VW l ơ tr ½

MS, do nồ ộ p sp t tươ ối cao (4,74 mM) c a VW so v i ¼ MS và

½ MS 0,32 M v 0,62 M v KC 1,84 M P sp t ược hấp thu bởi

rễ ã kí t í tă trưởng protocorm [49]

Khi nghiên c u về ả ưởng c a nguồ rb k á u ến s nảy

mầm c a hạt lan Hài loài P.armeniacum và P.micranthun, Chen và cộng s

(2004b) ã ận thấy s nảy mầm c a hạt ạt cao nhất tr trường có bổ sung glucose và cao gấp 2 lần so v trường có saccarose [36]

Theo Ng CY và Saleh NM (2011), s nhân giống c a P Rothschildianum

ạt ược thông qua s hình thành in vitro c a các protocorm th cấp (PLB) từ

PLB sơ ấp phát triển từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân PLBs ược nuôi cấy trên trườ ½ MS ược bổ sung v i các nồ ộ khác nhau (1,0, 2,0, 3,0 và 4,0 μM) c BA v k t ể cảm ng PLB th cấp Số ượng PLB th cấp cao nhất

ượ t tr trườ ½ MS ược bổ sung kinetin 4,0 μM, v i trung bình 4,1 PLB trên mỗi m u sau 8 tuần nuôi cấy Các PLB th cấp tiếp tục sinh sôi nảy nở ơ ữa và hình thành 9,5–12,1 PLB m i trên mỗi PLB th cấp sau

k ược nuôi cấy tr trường ½ MS không có chất ều s trưởng

th c vật ược bổ sung dịch chiết chuối 60 g / L chuối (BH) Những PLB bậc ba

y ã ược nuôi cấy tr trường có ch a các chất phụ gia hữu ơ k á nhau, ch ng hạ ư BH, ư c dừ , k t y v u ể tái sinh cây con Trong số các chất phụ gia hữu ơ ược thử nghiệm, việc bổ sung 20% CW

v trườ ½ MS ã ến tỷ lệ tái sinh cây con trung bình tốt nhất từ PLBs, ạt 67,9% sau 8 tuần nuôi cấy [57]

Nă 2011, L v á ộ s ũ ã tá s ồ từ sẹ y

ỉ từ ụ P deperle v P armeni Tuy nhiên, ầ rất ều

t ờ ể y H r v vậy p ươ p áp y k ệu quả ơ

á p ươ p áp k á [51] Theo nghiên c u c a Luan VQ và cộng s (2012) cho thấy trườ 1 2 MS ược bổ sung TDZ 0,5 mg/l và NAA 0,1 mg/L là

phù hợp nhất cho s tă s ồi nụ c a P delenatii và P callosum [53]

Kết quả u Zeng v ộ s 2013 t ấy hân giống hài Hằng

từ hạt 180 ngày sau thụ phấn (DAP) là phù hợp Hạt nảy mầm (72,67%) trên

trường có ch a NAA 0,5 mg/ , ư c dừa 10%, than hoạt tính 1,0 g/l Môi

trườ ½ MS bổ su 2,4D 5,0 mg/ l và TDZ 1,0 mg/ l p ù ợp ất tạ

mô sẹ v b ệt ó tạ pr tocorm s u 60 ảy ầ M trườ ½ MS bổ su kinetin 5,0 mg/l, BA 2,0 ặ 1,0 mg/ p ù ợp tạ ồ từ pr t r

[65] Deb CR và Jakha HY (2019), ã u nhân giống in vitro và nuôi

villosum var boxallii (Rchb F.) Pfitzer từ nguyên liệu là quả ó ộ tuổi từ 150

ế 300 DAP tr á trườ ưỡng khác nhau, có bổ sung các nguồn cacbon hữu ơ k á u, ư c dừa, than hoạt tính, NAA và BA ở các nồ ộ kết hợp khác nhau Hạt từ quả 240 DAP nảy mầm ạt 60% tr trường MS

có ch a sucrose 3%, NAA 2 μM v BA 6 μM Bổ su ư c dừa không hỗ trợ

s nảy mầm c a hạt ư ỗ trợ s phân hóa s t á ơ t ể giống protocorm (PLBs) Hạt nảy mầm chuyển thành PLBs và biệt hóa thành cây con

Cá PLB ã uyể ổi thành cây con có rễ mạ tr trườ MS ược

bổ su su r s 3% , NAA v BA tươ ng 2 v 6 μM tr ó ó t i 7 chồi / m u cấy cho mỗi chu kỳ nuôi cấy Cá y ã r rễ ược làm c ng bằng cách nuôi cấy tr trường MS 1/10 có ch a sucrose (1%) và chất nền

c ng (cát, chất hữu ơ thối rữa, mảnh gạch, than c i và phân bò khô theo tỷ lệ 1:

22

1: 1: 1: 1) Các cây c ược chuyển sang các bầu ch a giá thể hỗn hợp v i 65% cây cấy số sót tr ều kiện nhà kính [39]

1.3 Tron n ớc

Trư y do lan Paphiopedilum là giố ơ t ườ t t ường

ù p ươ p áp tá bụ ể nhân giố Đ y p ươ p áp ơ ản, dễ

th c hiện và cây con tách ra có tỷ lệ số ư k áp nhu cầu cây giố ười ta ít sử dụ p ươ p áp y [21]

ă L t uộ Paphiopedilum ở V ệt N P.villosum, P

tranlienianum, P.hangianum, P.malipoense, P.micranthum bằ ả ã v p

tíc t t truyề vù ITS-rDNA Kết quả p tí ố qu ệ ữ

các loài trong chi Paphiopedilum tr ơ sở p tí t t truyề ạ

ITS-rDNA 87 tr t t ấy á y t 7 ó ư tươ t ư u C x t 1997 T v ó, á tá ả t u

Khi nghiên c u ạng di truyề H Đốm (Paphiopedilum

concolor Pfitzer) bả ịa c a Việt Nam (2009), tác giả Khuất Hữu Trung và

cộng s ã ậ x t: L H Đốm (P concolor Pfitzer) bả ịa c a Việt

23

Nam rất ạng và phong phú Các m u giống thu thập tại các vùng sinh thái

k á u ều ó á ặ ể ặ trư r về hình thái Kết quả phân tích bằng k thuật RAPD – PCR chỉ ra hệ số tươ ồng di truyền c a các m u Hài

Đố ộng từ 0,56 ến 0,94; 16 m u H Đốm nghiên c u ược phân

t 6 ó k á u P ươ p áp tả á ặ ể t á v p ươ pháp á á truyền ở m ộ ADN có thể bổ sung và hỗ trợ l n

u ể công việc phân loạ ư i loài trở í xá ơ , p ục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng một cách có hiệu quả các nguồn gen lan Hài

bả ịa c a Việt Nam [30]

Dương Tấn Nh t và cộng s 2005, 2007 ã ố ược loài lan Hài

Hồng (Paphiopedilum delenatii) một ặc hữu c a Việt Nam bằng k

thuật gây vết t ươ ơ i, nuôi cấy lỏ v k ốt thân có ch a mắt ể tái sinh chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổ ược nuôi cấy trên môi trường Knudson C kết hợp v i việc gây vết t ươ v u ấy tr trường

lỏ ã t u ược 5,2 chồi/m u b ầu khi nuôi cấy tr trường MS có bổ

su TDZ 1,0 C á y s u k ượ k ạn thân bằng cách sử dụng ánh sáng trắng c è uỳ qu v á sá ỏ c è LED, ược cắt thành từ ốt rồi nuôi cấy tr trường MS có bổ sung các chất ều tiết

s trưởng khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ su BA 2 , tr trường có bổ sung Zeatin 1,5 mg/l hoặc TDZ 1,5 mg/l thì cho chất ượng chồi tốt nhất [22], [23], [60], [61]

Đặ Xuyế N ư v ộ s 2006 ã ố t loài lan hài quý: Hài Hằng ặc hữu Việt Nam) và Hài T Đả ặc hữu Đ Dươ bằng p ươ pháp gieo hạt trong ống nghiệm [8] và k thuật gây vết

t ươ tr y tr ống nghiệm Hai loài lan này nhân giống rất khó vì hạt nhỏ, dài chừng 1 – 2 mm, rộng chừng 1mm, ch a rất ít và hầu ư k có chất

ưỡ ể tạ ều kiện cho hạt nảy mầ D ó ếu gieo hạt trong môi trườ ất hạt rất dễ bị mất mát và khó nảy mầm Từ những kết quả ạt ược, nhóm nghiên c u ã x y ược qui trình nhân giống hai loài lan Hài quý

24

trên bằ p ươ p áp ieo hạt trong ống nghiệ Đồng thời họ ũ t r

p ươ p áp tá ầ ư ột biện pháp bổ su ể nhân giống Hài Hằng và

H T Đảo Không dừng tạ ó, á k ọ ã u thành công việc nuôi trồng nhữ y ó tr tr vườ ươ [21]

Trong nghiên c u c Vũ Quốc Luận và cộng s (2014) về lan Hài Hồng cho thấy các chồi non lan Hài Hồ ó 4 á ược cấy v trường SH có bổ sung BA 0,5 mg/l; NAA 0,5 mg/l; sucrose 30 g/l; agar 9,0 g/l; than hoạt tính 1,0 v ượ u tr ều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài

á ốt t , s u ó ượ ư r ều kiện chiếu sá t 2 t á ể lá tổng hợp diệp lục tố v á ă ượng cần thiết cho cây Kết quả cho thấy các chồi ược kéo dài trung bình 10,5 cm, v i số lá m i hình thành trung bình 5 lá/chồ , tươ ng v 5 ốt/chồ t u ượ s u 120 y u tr ều kiện tối

S u ó á ồ ượ ư s ều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá m i tuy nhiên không nhận thấy có s p ốt Sau 180 ngày nuôi cấy các chồ ược cắt t 5 ốt riêng biệt v i 1 lá và 1 rễ, riêng phầ ỉnh chồ ược giữ nguyên v i 3 lá và 2 rễ Cuố ù á ốt t ược trồng trên giá thể d Đ L t u ược kết quả cao nhất ở vị trí ốt thân số 1 v i tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng [15]

Hoàng Thị Giang và cộ s 2010 u ố in vitro và nuôi trồ ố H P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) Kết quả u

cho thấy, trường nhân nhanh protocorm và tạo chồ trường RE có bổ

su ư ừ 150 v uố í 100 ệ số ất (4,3 lần)

Bổ sung NAA 0,4 mg/l – 0,6 v trường cho khả ă r rễ tốt ất

Cá kết quả thí nghiệ vườ ươ t ấy, y ạt tiêu chuẩ r vườn

ươ 3 – 4 cm, có từ 3 – 4 lá, 4 – 5 rễ [5]

Ở Việt Nam, nhóm tác giả Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp (2004) ã ó ững nghiên về mặt th c vật họ ối v i lan Hài Việt Nam thông qua những chuyến khảo sát th c tế Trong cuố sá “L

25

Hài Việt N ” ó tá ả ã i thiệu k á ầy và chi tiết các loài lan Hài

có ở Việt N ù á á á về th c trạng c a các loài này [1]

T u N uyễ T ị Sơ v ộ s 2012 , k u ấy ạt

từ quả n Dendrobium fimbriatum Hook 3 thá tuổ t ấy trườ t í

ợp ảy ầ v p át s pr t r ạt trườ MS bổ su

ư ừ 100 ml/l, sucrose10 g/l, agar 6,0 ít; M trườ proto r tốt ất trườ KC 100 ND, 10 sucrose, 60g khoai tây, 6,0g agar ít trườ ; M trườ t í ợp ất ồ v tr

là MS bổ su ư ừ 100ml/l, sucrose 20g/l, uố í 60g/l, agar 6,0g/l; Môi trườ tạ y ỉ RE bổ su su r s 10g/l, THT1g/l, agar 6,0g/l [25]

N uyễ T ị Cúc v á ộ s (2014) ã u ả ưở b

ó ợp ất ữu ơ k á u: ó uố , k t y, ư ừ ; ó

p pt , tr pt , bột ấ v ó tả sp ru quá tr s h

trưở v p át tr ể H Hồ Paphiopedilum delenatii) in vitro Kết

quả t ấy, ả b ó ợp ất ữu ơ ều ó tá ụ tă số ượ

Nguyễn Thị Tình và cộng s (2018) ã u ả ưởng c a môi trường nuôi cấy ơ bản, chất ều s trưởng th c vật v AC ến khả ă

vi nhân giống c a lan P vietnamense Đã xá ịnh rằng HgCl2 0,2% có thể ược

sử dụ tr v 5 ế 10 p út ể khử trùng chồi nách c a P vietnamense,

t u ược 65,55% m u sạch, trường 1/2 MS bổ sung BA 2,0 mg/l và NAA

26

1,0 mg/l, cho khoảng 2,85 chồi/m u, trường thích hợp nhất ể tái sinh và nhân chồi Ngoài ra, kết quả ũ ỉ ra rằng NAA 0,5 mg/l và THT 1,0 g/l cho khả ă tạo rễ tốt nhất (88,89%) [28]

N uyễn Phúc Huy v ộ s (2019) ã u ả bộ lan Hài

P villosum từ á ồ in vitro Cá ồ 1,5 ó uồ ố từ á

ốt ầu t tr trườ bổ su TDZ 0,5 ượ tr u ị

ở á ồ ộ v t ờ ượ k á u v s u ó ượ uyể s trườ r rễ Tỷ ệ ả bộ ạt 19,88% k xử í 50 μM

27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Đố tượng nghiên c u: Giống lan Hài Đốm khoẻ mạnh, sạch bệ , ược

ưu ữ tạ vườn bảo tồn lan c a Khoa Công nghệ sinh học, Trườ Đại học Khoa học Thái Nguyên

- Vật liệu nghiên c u: Vật liệu cho nhân giống in vitro gồm hai loại là: (1)

Chồi non khoảng 2 tháng tuổi m i tái sinh từ rễ cây lan Hài Đốm; (2) Quả lan

H Đố ược thu thập từ các cây lan H Đốm nuôi trồng tạ vườn bảo tồn lan Hài c trườ Đại học Khoa học Thái Nguyên

28

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đị ểm: Thí nghiệ ược tiến hành tại phòng Nuôi cấy mô tế bào th c vật, Khoa Công nghệ sinh học, Trườ Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên

- Thời gian nghiên c u: Từ 01/2019 ến 11/2020

2.3 Hóa chất và thi t bị nghiên cứu

2.3.1 óa chất

Bảng 2.1: Hó ất u

29

2.3.3 Dụn cụ

P , , k , t , ĩ p ptr , ố , ố , è ồn, giấy thấm, bình nuôi cấy, túi nilon

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Cá bư c nghiên c u ược tóm tắt t sơ ồ sau:

Hình 2.2: Sơ ồ thí nghiệm

2.4.1 Ph n ph p khử trùn ch i non

M u là các chồi non thu về rửa sạ ất át ư v ư c chảy, s u ó rửa bằng xà phòng loãng, tiếp theo rửa sạch xà phòng, mang vào box cấy ể khử trùng M u ược ngâm trong dung dịch cồn 70% trong 30 giây, tráng lại bằng

ư c cất khử trùng 3 lần, tiếp t ược khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian 10 phút, 12 phút và 15 phút có bổ sung vài giọt Tween 20, sau mỗi lần khử trùng rửa lại m u bằ ư c cất khử trùng nhiều lần Sau khi khử trùng, m u ược cấy trườ ã uẩn bị trường MS hoặc MS bổ