TỔNG QUAN
Tổng quan về hóa chất bảo vệ thực vật
1.1.1 Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật
Hóa chất bảo vệ thực vật, được chuyển ngữ từ thuật ngữ tiếng Anh "pesticide", ban đầu chỉ định nghĩa là thuốc diệt côn trùng gây hại Tuy nhiên, hiện nay khái niệm này đã được mở rộng để bao gồm nhiều loại hóa chất khác nhau được sử dụng trong nông nghiệp, bao gồm cả các loại thuốc điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá và thuốc trừ cỏ.
HCBVTV, theo định nghĩa của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên Hợp Quốc (FAO), là các hợp chất được sử dụng nhằm ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại cho cây trồng và vật nuôi Những tác nhân này bao gồm côn trùng, nấm, vi khuẩn và các sinh vật gây hại khác ảnh hưởng đến quá trình sản xuất, chế biến và bảo quản thực phẩm HCBVTV cũng có vai trò điều hòa sinh trưởng thực vật, giúp làm rụng lá, thưa quả hoặc ngăn chặn việc ra hoa sớm Ngoài ra, HCBVTV còn được áp dụng cho cây trồng trước và sau thu hoạch nhằm bảo vệ sản phẩm trong quá trình bảo quản và vận chuyển.
1.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật
Có nhi u cách phân lo i HCBVTV khác nhau ề ạ tùy theo ục đích m nghiên c u và s ứ ử d ng ụ
1.1.2.1 Phân loại theo độ độc
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) dựa trên các nghiên cứu về nguy hại, đặc biệt là độ độc cấp tính qua đường miệng và đường ngoài da khi thử nghiệm trên động vật Theo đó, HCBVTV được chia thành 5 nhóm khác nhau.
Theo cách phân loạ VTV đượ nhóm độc như sau:
Bảng 1.1 Phân loại HCBVTV theo độ độc:
Qua mi ng (mg/kg) ệ Qua da(mg/kg) Thể ắ r n Thể ỏ l ng Thể ắ r n Thể ỏ l ng
LD50 là chỉ số đánh giá độc tính của một chất qua đường miệng hoặc qua da Nó được xác định bằng miligam (mg) của hoạt chất cần thiết để gây tử vong cho 50% số sinh vật thí nghiệm, tính theo kg trọng lượng cơ thể Giá trị LD50 càng nhỏ, thì chất hóa học đó càng độc.
Có th nh n biể ậ ết tính độc c a thu c b o v ủ ố ả ệ thực v t theo d u hi u màu trên bao bì ậ ấ ệ thuốc như sau:
+ Vạch màu đỏ trên bao bì là thuốc độc nhóm I, thuộc loạ ấ ộc và đội r t đ c.
+ V ch màu vàng trên bao bì là thuạ ốc độc nhóm II, thu c lo i trung bình ộ ạ
+ V ch màu xanh trên bao bì da tr i là thuạ ờ ốc độc nhóm III, ít độc.
+ V ch màu xanh lá cây trên bao bì thuạ ộc nhóm độc thứ IV, độc nhẹ
1.1.2.2 Phân loại theo mục đích sử dụng
Có nhi u cách phân lo i TBVTVề ạ [40], trong đó có 4 cách phân loại ch y u sau ủ ế đây:
1.1.2.2.1 Phân loại theo mục đích sử dụng:
* Nhóm các chất trừ sâu, trừ nhện, trừ côn trùng gây hại:
+ Nhóm các chất trừ sâu có ch a Clo ứ ( organnochlorine):
HC BVTV Clo hữu cơ là các hợp chất hữu cơ được tạo ra khi các nguyên tử hydro trong phân tử hydrocacbon bị thay thế bằng các nguyên tử Clo Các hợp chất này thường được sử dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng khỏi sâu bệnh và cỏ dại Việc sử dụng HC BVTV Clo hữu cơ cần được thực hiện đúng cách để đảm bảo an toàn cho môi trường và sức khỏe con người.
Trong các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là những hợp chất chứa vòng benzen hoặc dị vòng (như O, N, S), thường xuất hiện các dẫn xuất clo của các hợp chất như Diphenyletan, Cyclodien, benzen và hexan Những hợp chất này có đặc điểm quan trọng là độc tính cao, phổ tác động rộng nhưng kém chọn lọc và rất bền vững trong môi trường, với thời gian phân hủy dài Do đó, chúng ít bị đào thải và có khả năng tích lũy trong cơ thể sinh vật qua chuỗi thức ăn, dẫn đến sự tồn dư trong môi trường.
Pesticides containing chlorine, particularly organochlorine compounds, have been widely used in agriculture, leading to significant accumulation and toxicity in humans and animals Common organochlorine pesticides include Aldrin, BHC (alpha, beta, gamma, and delta), Chlorobenzilate, Dieldrin, DDT (including its metabolites o,p'-DDD, p,p'-DDD, p,p'-DDE, and p,p'-DDT), Endosulfan (alpha, beta, and sulfate forms), Endrin, Heptachlor (and its isomers), Dicofol, Phenobromorate, and Clodan.
Hình 1.1: Cấu tạo của Dicofol + Nhóm các chất trừ sâu có ch a Photpho ứ (organophosphorus):
HC BVTV nhóm lân hữu cơ chủ yếu là hợp chất của photpho hóa trị V, bao gồm các este của axit photphoric (H₃PO₄) và dẫn xuất Các hợp chất này có độc tính rất cao, dẫn đến hiệu lực diệt trừ sâu hại nhanh chóng, nhưng lại tác động rộng rãi và kém bền vững trong môi trường kiềm và axit Cơ chế hoạt động của nhóm này dựa trên nguyên tắc ức chế enzym Cholinesterase (ChE) do enzym ChE bị photphoryl hóa.
Nhiễm độc Lân hữu cơ gây ra tình trạng ứ đọng Acetylcholin, dẫn đến rối loạn hệ thống truyền dẫn cholinergic Theo nghiên cứu của Moschlein (1980), Nguyễn Văn Nguyên (1983), With (1985), và Kramer (1998), nhiễm độc này chủ yếu xảy ra do sự tích tụ Acetylcholin trong cơ thể Các hợp chất cơ photpho là những chất có khả năng gây ra tình trạng nhiễm độc này.
Sáu loại thuốc trừ sâu độc hại có khả năng tích lũy mạnh và gây độc cấp tính cho hệ thống kinh tế hiện nay đã bị cấm sử dụng tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới Những chất điển hình trong nhóm này bao gồm parathion, malathion, diclorvos, clorpyrifos, dimethoat, trichlorfon, và edifenphos.
+ Nhóm các h p ch Cợ ất abamat:
Hình 1.2: Cấu tạo của 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyl N-methylcarbamate
Nhóm hợp chất carbamat, thường là các este của axit carbamic (H2N-COOH), có độc tính cao và tác động hẹp hơn so với các hợp chất hữu cơ chứa clo và photpho Chúng có hiệu lực diệt sâu bọ cao nhưng kém bền do dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm và axit Cơ chế gây độc của nhóm này liên quan đến việc ức chế men cholinesterase trong hệ thần kinh Một số đại diện tiêu biểu cho nhóm carbamat bao gồm Bendiocarb, Benthiocarb, Carbaryl, Chloro IPC, Diethofencarb, Fenobucarb, Isoprocarb, Metolcarb, Pirimicarb, Propoxur, Swep, XMC, và Xylylcarb.
Nhóm thuốc trầm cảm sâu có nguồn gốc tự nhiên là sự kết hợp của các este khác nhau, được tách ra từ hoa cúc Những thành phần này tương tác và được sử dụng phổ biến Cơ chế hoạt động của nhóm thuốc này liên quan đến việc tăng cường kênh natri trong tế bào thần kinh, gây ảnh hưởng đến sự truyền dẫn các xung thần kinh.
Imidacloprid, được giới thiệu lần đầu vào năm 1991, là tiền chất chính của nhóm Neonicotinoid - một loại thuốc trừ sâu liên quan đến nicotin Nhóm Neonicotinoid có độc tính thấp hơn so với nhóm carbamat và lân hữu cơ, đồng thời cũng ít độc hại hơn đối với con người.
Có bảy bằng chứng cho thấy nguy cơ gây ra hội chứng rối loạn sụt giảm bầy đàn đối với ong mật, dẫn đến việc một số quốc gia đã quyết định hạn chế sử dụng các loại thuốc thuộc nhóm này.
Một số chất tiêu biểu: imidachloprid, acetamiprid, thiamethoxam, dinotefuran.
Hình 1.3 : Cấu tạo của Acetamiprid
* Nhóm các chất (vô cơ) trừ ấm, trừ ệ n b nh, tr ừ vi sinh vật gây h ại:
+ Các h p chợ ất chứa đồng:
Các hợp chất đồng là loại thuốc trừ sâu vô cơ có tác động rộng rãi, không gây hại cho cây trồng và không tích lũy trong đất Ion đồng được hấp thụ và xâm nhập vào cây, nơi chúng kết hợp với các protein và phá hủy tính keo của nguyên sinh chất Đồng cũng ức chế hoạt động của các enzym, đặc biệt là enzym trao đổi carbohydrate và enzym hô hấp Một số sản phẩm tiêu biểu như Dupont Kocide 46.1 DF và COC 85WP (đồng hydroxide) được sử dụng để phòng bệnh sương mai trên cà chua, cháy lá vi khuẩn và thối nhũn trên cây bắp cải.
+ Các h p chợ ất chứa Lưu huỳnh:
Dùng để phun hoặc hun để ử x lý b nh n m ph n tr ng, r p h i nho, nhệ ấ ấ ắ ệ ạ ện đỏ trên bông ít độc với động v t máu nóng ậ
+ Các h p chợ ất chứa Th y ngân: ủ
Phương pháp QuEChERS phân tích đa dư lượng thuốc BVTV
Năm 2003, Anastassiades và c ng s [19, 20] gi i thi u mộ ự ớ ệ ột phương pháp mới để phân tích dư lượng HCBVTV, sau này được gọi là phương pháp QuEChERS (viế ắ ủt t t c a
Phương pháp QuEChERS là một kỹ thuật phân tích đa dư lượng hiệu quả, nhanh chóng, và tiết kiệm chi phí, cho phép xác định các chất hóa học trong mẫu thực phẩm với độ an toàn và ổn định cao Được giới thiệu lần đầu vào năm 2002 bởi Anastassisdes và Lehotay, phương pháp này đã chứng minh khả năng phân tích chính xác 207 chất trong 235 mẫu thực phẩm như rau xà lách, nho và cam Năm 2003, nghiên cứu của Lehotay cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của pH đến độ thu hồi của thuốc trừ sâu, dẫn đến việc điều chỉnh phương pháp bằng cách sử dụng đệm acetat pH 4,8-5,0 QuEChERS đã trở thành một tiêu chuẩn trong phân tích dư lượng thực phẩm nhờ vào tính hiệu quả và khả năng mang lại kết quả chính xác.
Năm 2007, 13 phòng thí nghiệm tại 7 quốc gia đã phối hợp nghiên cứu 30 thuốc trừ sâu trên nông sản và rau củ theo phương pháp chính thức của AOAC 2007.01 Cùng thời điểm đó, Anastassiades và cộng sự tại Stuttgart phát triển một phương pháp QuEChERS mới sử dụng đệm citrat ở pH 5 Phương pháp này đã được thẩm định liên phòng và chính thức trở thành phương pháp châu Âu EN 15662 vào năm 2008.
1.4.1 Phương pháp QuEChERS EN15662 Đầu tiên Michelangelo Anastassiades [32] đề xu t quy trình QuEChERS như sau: ấ
Giai đoạn xử lý mẫu ban đầu trong nghiên cứu nông sản bao gồm việc loại bỏ các tạp chất như đất và sỏi không liên quan Mẫu sau đó được nghiền nhuyễn, lý tưởng là ở trạng thái đông lạnh, nhằm tối đa hóa sự đồng nhất và tăng cường khả năng tiếp xúc cho quá trình chiết xuất Đối với các mẫu thô như hoa quả, chúng cần được cắt nhỏ với kích thước dưới 3x3 cm trước khi đồng nhất Sau khi đồng nhất, mẫu sẽ được cân một lượng phù hợp để phân tích ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ dưới -20 độ C.
Cân 10-15 gam mẫu vào ống ly tâm loại 50ml có nắp kín Đối với mẫu có hàm lượng nước thấp như chè, gạo, ngũ cốc, cần thêm nước vào để hàm lượng nước đạt trên 75% và để trong 2 giờ.
- Thêm 10 ml axetonitril (ACN) rung l c m nh kho ng 2 ắ ạ ả – 3 phút Sau đó thêm MgSO4, NaCI, h n h p muỗ ợ ối đệm xitrat Na3C6H5O7và Na2C6H6O7 sao cho pH mẫu đạt 5 -5,5 [32]
Rung lắc mẫu trong 2-3 phút và ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút để phân tách pha hữu cơ Sau đó, thu hồi pha hữu cơ và thêm các chất hấp phụ amin như PSA và than hoạt tính (GCB) để làm sạch mẫu Tiến hành ly tâm lần nữa, thu hồi pha hữu cơ và thổi khô bằng khí N2 Tùy thuộc vào thiết bị phân tích như GC-MS/FPD hoặc HPLC-MS/MS, định mức bằng dung môi phù hợp.
Hiện nay, để tối ưu hóa quy trình tách chiết, người ta thường sử dụng các bộ kit đóng gói sẵn như muối đệm, chất làm sạch (PSA, GCB) cho các hoạt động phân tích Tùy thuộc vào loại nông sản và hoạt động xử lý pesticide mà thành phần của bộ kit sẽ khác nhau Sự đa dạng trong các hoạt động và loại nông sản đã dẫn đến việc phát triển nhiều quy trình tách chiết khác nhau hiện nay.
THỰC NGHIỆM
Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên c u là 7 hóa ch t b o v th c v t g m: Acetamiprid, Acephate, ứ ấ ả ệ ự ậ ồ Buprofezin, Chlorothalonil, Fipronil , Hexaconazole và Profenofos trong m u chè khô ẫ
2.1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời 7 hợp chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) trong nông sản bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp kết hợp với khối phổ (LC/MS/MS) Đề tài hướng đến hai mục tiêu cụ thể để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc phát hiện các hợp chất này.
- Khảo sát các điều ki n phân tích ệ
- Thẩm định phương pháp đã xây dựng
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1 Chuẩn bị dung môi pha động và dung dịch chuẩn
- Chuẩn b ị dung môi pha động
Dung d ch kênh Aị : ACN/H2O 2+8 (v/v) + 5mM CH 3COONH4: Cân 0,385g
CH3COONH4vào bình định mức 1L, thêm 200ml ACN, định m c t i v ch bứ ớ ạ ằng nước cất
2 l n kh ion, l c k , siêu âm 15 min.L c dung d ch qua màng l c 0,45 ầ ử ắ ỹ ọ ị ọ m trước khi đưa vào h ệ thống HPLC-MS/MS
Dung d ch kênh Bị : ACN/H2O 9+1 (v/v) + 5mM CH 3COONH4: Cân 0,385g
CH3COONH4vào bình định mức 1L, thêm 900ml ACN, định m c t i v ch bứ ớ ạ ằng nước cất
2 l n kh ion, l c k , siêu âm 15 min L c dung d ch qua màng l c 0,45 ầ ử ắ ỹ ọ ị ọ m trước khi đưa vào hệ ố th ng HPLC-MS/MS
+ Dung dịch chu n gốc – 1000 g/mlẩ à
Cân kho ng 0,01g các ch t chu n chính xác tả ấ ẩ ới 0,00001g vào bình định m c 10 ml, ứ hoà tan và định m c t i v ch bứ ớ ạ ằng axetonitril được dung d ch chu n g c ị ẩ ố
Chú ý: Do ch t chu n b o qu n - 20ấ ẩ ả ả ở o C nên phải đưa về nhiệt độ phòng trước khi cân Dung dịch chu n sau khi pha b o qu n 0 -5 ẩ ả ả ở o C
+ Dung d ch chu n làm vi c ị ẩ ệ
B ng cách pha loãng liên tằ ục và định m c b ng h n hứ ằ ồ ợp dung môi pha động và ACN được các m c nứ ồng độ chu n làm vi c 4, 10, 20, 40, 100 ng/ml ẩ ệ
Các lo i hóa chạ ất dùng trong phương pháp phân tích đều thu c lo i hóa ch t tinh ộ ạ ấ khi t phân tích (P.A.) g m : ế ồ
- Chất chu n Acetamiprid, Acephate, Buprofezin, ẩ Imi aclopd rid, Chlorothalonil, Fipronil và Profenofos
- Magie sulphat heptahydrate MgSO4 7H2O (nung 550 o C trong 8 giờ, để ngu i, cho ộ vào bình đậy kín, b o qu n trong binh hút m) ả ả ẩ
- Tri natri citrate dehydrate (C6H5Na3O7.2H2O)
- Primary secondary amine (PSA) kớch thước hạt 40-60 àm
- Bình định m c dung tích 10ml±0,04 ; 20ml±0,04 ; 50ml±0,06 ứ
- Ống đong dung tích 1000ml
- ng ly tâm, có n p xoáy dung tích 15ml, 50 ml Ố ắ
- Pipet lo 1 ±0,01; 2 ±0,01; 10 ±0,05 ại ml ml ml
- Máy s c kí l ng kh i ph ắ ỏ ố ổ LC-MS/MS 6410MS (Agilent) - C t Zorbax SB18 ộ 150mm x 4,6mm, 5àm
- Mỏy sắc ký lỏng HPLC 1100 (Agilent) - Cột Zorbax SB C18 250mm x 4,6mm, 5àm
- Cân phân tích có độ chính xác đến 0,00001 g
- Cân k thuỹ ật có độ chính xác đến 0,1 g
- Máy nghi n m u Panasonic MX AC400WRA ề ẫ –
- Máy ly tâm Rotina 38R bu ng l nh 5 40ồ ạ – o C, tốc độ ly tâm 1000 15000 – vòng/phút
- Máy Vortex Genie 2 TM điều ch nh t c đ l c ỉ ố ộ ắ
- Máy đo pH: pH Meter 744
- Máy siêu âm Sonorex Super RK514BH k t h p gia nhi t b siêu âm, th i gian ế ợ ệ ể ờ siêu âm tùy biến (1-15 phú t)
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu
M u è khô ẫ ch được ửx lý theo quy trìnhQuEChERS đã nghiên cứu:
- Cân 10 gam/m u ẫ đã được c nh ắt ỏ và đồng nh t vào ng tuyp ly tâm lo i 50ml có ấ ố ạ n p kín ắ Th m 10 ml nướê c c t và ngâấ m trong vòng 2 gi ờ
- Thêm 10 ml acetonitril (ACN) rung l c m nh kho ng 2 ắ ạ ả – 3 phút Sau đó thêm 4 MgSO4, 1 g NaCI, h n h p muỗ ợ ối đệm citrat 1 g Na3C6H5O7 và 0,5 g Na2C6H6O7 , đo pH mẫu đạt 5 -5,5.
Rung lắc mạnh trong 2-3 phút và ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút để phân tách pha hữu cơ Hút 4 ml pha hữu cơ, thêm 1g MgSO₄ và các chất hấp phụ PSA, lắc trong khoảng 30 giây Tiến hành ly tâm lần nữa, thu lấy pha hữu cơ, sau đó thêm 5% axit formic vào 2ml dịch chiết và tiến hành phân tích bằng LC-MS/MS.
Hình 2.1: Quy trình phân tích mẫu
2.3.2.1 Điều kiện phân tách trên hệ thống HPLC
Cột phân tích : ZORBAX SB RPC18 150mm x 4,6 mm, 5 m
M u (>1kgẫ ) được ắc t nh ỏ ra, lấy kho ng 200g mả ẫu đại diệ và đồn ng nhất bằng thiết bị đồ ng nhất mẫu
Chuyển 10g m u ẫ đã đồng nh t vào ng ly tâm 50ml Thêm 10 ml ấ ố n c c t và ngâm trong 2 giướ ấ ờ
Thêm 10ml ACN +1g Na3C6H5O7 1,5 H2O + 1 g NaCl + 0,5 g
Lắc mạnh trong kho ng 2-3 ả phút, sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng /phút và trong 5 phút
Chuyển 4ml vào ng ly tâm 15ml ố trong đó đã có 100mg MgSO4+30 mg PSA/ml d ch chi t và lị ế ắc trong khoảng 30 giây
Ly tâm 3000 vòng/phút trong kho ng 5 phútả
Chuyển 2 dml ch chi t vào vial 2 ml và thêm 5% acid formic và l c ị ế ắ đều
Phân tích b ng thiằ ết bị LC/MS/MS
Chương trình dung môi như sau: tỷ ệ l kênh %A: %B = 65: 35, trong th i gian 12 phút/ ờ m u ẫ
2.3.2.2 Điều kiện phân tích trên hệ thống khối phổ ESI - MS/MS :
Nguồn ion hóa (ESI) áp d ng các thông s ụ ố như bảng 2.1
Bảng 2 : Các thông số1 của chế độ ion hóa ESI Nguồn ion hóa: ESI/ posetive/MRM Nhiệ ột đ khí N2: 300 o C
Lưu lượng khí N2: 7 L/phút Áp suấ ầt đ u phun: 20 psi Điện áp mao qu n: ả 4000 V
Chế độ quét MS/MS:MRM (SIM to SIM) v i các thông s ớ ố như bảng 2.2
Bảng 2 : Các thông số chế độ quét MS/MS2
Hoạt chất Thời gian lưu (phút)
Chu kỳ quét (ms) Điện áp phân m nh ả (V)
2.3.3 Thẩm định xác định giá trị sử dụng của phương pháp
2.3.3.1 Tính chọn lọc, đặc hiệu
Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như tiền chất, chất chuyển hóa và các chất tương tự Trong phân tích định tính, cần chứng minh kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích và âm tính khi không có, đồng thời kết quả cũng phải âm tính khi có mặt các cấu trúc khác gần giống chất phân tích Đối với phân tích định lượng, tính đặc hiệu thể hiện qua khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu, bất chấp ảnh hưởng của các yếu tố khác, nhằm đạt được kết quả chính xác Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích duy nhất.
Tính chọn lọc là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một chất trong nhiều chất khác trong một quy trình Nếu chất cần xác định phân biệt rõ ràng với các chất khác, thì phương pháp phân tích được coi là có tính chọn lọc Tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu, do đó, khái niệm này thường mang tính khai quát hơn trong các phương pháp phân tích, vì chúng thường có nhiều chất cùng xuất hiện.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng thiết bị phát hiện MS để xác định tính đặc hiệu và tính chọn lọc của các mẫu Chúng tôi so sánh hiệu quả phân tích trên ba loại mẫu: mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn và mẫu trống Mẫu trống không cho tín hiệu chất phân tích, trong khi mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn.
2.3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ lệch chuẩn của phương pháp đo Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu mà có thể phát hiện được, nhưng chưa thể định lượng chính xác.
Có nhiều cách xác định LOD, bao gồm dựa trên độ chuẩn, dựa trên sự đường chuẩn và dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N), với phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp, cho thấy khả năng phát hiện rất nhạy.
35 tín hi u c a ch t phân tích ệ ủ ấ Xác định t l tín hi u chia cho nhi u (S/N = Signal to noise ỷ ệ ệ ễ ratio) trong đó: S là chi u cao tín hi u cề ệ ủa chất phân tích
LOD được ch p nh n t i nấ ậ ạ ồng độ mà tại đó tín hiệ ớu l n g p 3 l n nhi u (S/N = 3) ấ ầ ễ
: là n t i thi u c a m t ch t có trong m u th
Giớ ạn định lượi h ng LOQ ồng độ ố ể ủ ộ ấ ẫ ử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho k t qu ế ả có độ ch m mong mu n ụ ố
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định LOQ (Limit of Quantification) bằng cách dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu đạt được gấp nhiều lần so với nhiễu nền.
2.3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích Để xác định khoảng tuyến tính, chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó, chúng tôi vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được và nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính.
Sau khi xác định kho ng tuy n tính c a các chả ế ủ ất, chúng tôi đã xây dựng đường chu n trên n n m u th c có s d ng n i chu n, nh m loại tr ừ ảnh hưởng c a n n mủ ề ẫu đến k t qu phân tích N i chuế ả ộ ẩn được thêm vào dung d ch chuị ẩn để đo máy, v i nớ ồng độ phù h p và gi ng nhau V ợ ố ẽ đường cong ph thu c gi a t l tín hiụ ộ ữ ỷ ệ ệu chất ngo i chu n và chia cho n i chu n ph thu c vào nạ ẩ ộ ẩ ụ ụ ộ ồng độ ngo i chu n ạ ẩ.
2.3.3.4 Độ lặp lại (độ chụm) và độ thu hồi (độ đúng).
Hiện nay có nhi u cách khác nhau v thu t ng ề ề ậ ữ độ chính xác Theo quan điểm m i ớ nh t c a tiêu chu n qu c t (ISO 5725 1- 6:1994) và tiêu chu n qu c gia (TCVN 6910 1-ấ ủ ẩ ố ế ẩ ố
Độ chính xác và độ chụm của phương pháp phân tích được thể hiện qua các chỉ số thống kê quan trọng Độ chụm, hay còn gọi là độ lặp lại, phản ánh mức độ gần gũi giữa các giá trị đo lường lặp lại Đây là một khái niệm định tính, nhưng có thể được biểu diễn định lượng thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc hệ số biến thiên (CV%).
Trong đó: xi : Nồng độ tính được của lần th nghiử ệm thứ i x : Nồng độ trung bình tính được của N lần th nghiử ệm.
Độ đúng là mức độ gần gũi giữa giá trị phân tích và giá trị thực tế, phản ánh khả năng chấp nhận của các giá trị này Khái niệm này mang tính định tính nhưng có thể được biểu diễn định lượng thông qua độ ướt chệch (Bias) hoặc hiệu suất thu hồi (Recovery).
C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/ml)
Để xác định độ chính xác và độ đúng của phương pháp phân tích nồng độ chu n, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nồng độ khác nhau (mỗi mức lặp lại 10 lần) Kết quả được tính toán theo công thức đã đề ra.