Sử dụng kỹ thuật pcr khảo sát sự nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu

ii L ỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ kỹ thuật: “Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát sự nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu” là do tôi thực hiện với sự hướng dẫn củ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

ĐẶNG THỊ THANH HUYỀN

SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SỰ NHIỄM KHUẨN

TỤ CẦU VÀNG TRONG CHẾ PHẨM MÁU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: T.S NGUYỄN THỊ THANH MAI PGS.TS KHUẤT HỮU THANH

Hà Nội – 2013

i

L ỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo trong bộ môn công nghệ sinh học- Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cũng như sự giúp đỡ

của các cán bộ hiện đang công tác tại bệnh viện Nhi TW

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS TS Khuất Hữu Thanh, là những người thầy

cô tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến bạn bè và người thân của tôi

đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày 25 tháng 03 năm 2013

Sinh viên

Đặng Thị Thanh Huyền

ii

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ kỹ thuật: “Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát sự nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu” là do tôi thực hiện với sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS.TS Khuất Hữu Thanh Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này

Hà Nôi, ngày 25 tháng 03 năm 2013

Học viên

Đặng Thị Thanh Huyền

iii

M ỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN i

L ỜI CAM ĐOAN ii

M ỤC LỤC iii

DANH M ỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT v

M Ở ĐẦU 1

T ỔNG QUAN 3

I.1 Truy ền máu 3

I.1.1 Khái quát chung về truyền máu 3

I.1.2 Các chế phẩm máu 4

I.2 Nhi ễm khuẩn trong truyền máu 6

I.2.1 Yêu cầu về truyền máu 6

I.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn trong truyền máu 7

I.2.3 Nguyên nhân nhiễm khuẩn trong truyền máu và cách phòng tránh 9 I.3 Khái quát về Staphylococcus aerus 10

I.3.1 Lịch sử phát hiện tụ cầu vàng 10

I.3.2 Phân loại 11

I.3.3 Đặc điểm của tụ cầu vàng 12

I.4 M ột số kỹ thuật phát hiện tụ cầu vàng 17

I.4.1.Phương pháp chuẩn đoán vi sinh 18

I.4.2 Kỹ thuật phân tử 20

PH ẦN II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 30

II.1 Đối tượng nghiên cứu 30

II.2 Thi ết bị, hoá chất và sinh phẩm 30

II.2.1 Trang thiết bị 30

II.2.2 Hoá chất và sinh phẩm 30

II.3 Phương pháp nghiên cứu 31

iv

II.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 31

III.3.2 Phương pháp phân lập 33

III.3.3 Phương pháp PCR xác định gen 16S của tụ cầu vàng 34

PH ẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

III.1 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 39

III.2 Tách chi ết ADN tổng số: 40

III.3 Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S aureus 43

III.4 Tinh s ạch ADN 44

I II.4 Đọc trình tự và so sánh trên ngân hàng gen quốc tế 45

PH ẦN IV: KẾT LUẬN 48

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 49

PH Ụ LỤC 53

v

DANH M ỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

RNA Axit ribonucleic

dNTP Deoxyribonucleotide 5’- triphosphates EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid

EtBr Ethidium bromide

PCR Polymerase Chain Reaction

vi

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nhiễm khuẩn liên quan đến sinh vật, 2005 đến năm 2010 của FDA, Mỹ 8

Bảng 1.2 Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn S aureus 14

Bảng 1.3 Bảng phân biệt S aureus và S epidemidis, S saprophyticus 18

Bảng 2.1 Bảng lấy mẫu và kí hiệu mẫu 32

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR 35

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen 37

Bảng 3.1 Các mẫu nhiễm khuẩn khi phân lập 40

Bảng 3.2 Nồng độ ADN của các mẫu thu được tại bệnh viện Nhi TW 41

Bảng 3.3 Nồng độ ADN tinh sạch của các PCR từ mẫu tiểu cầu sau truyền ngày 1 và 5 44

vii

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh túi máu 3

Hình 1.2 Sơ đồ chế phẩm máu 4

Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus 11

Hình 1.4 Hình thể Staphylococcus aureus 12

Hình 1.5 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 15

Hình 1.6 Hình ảnh S aureus bắt màu Gram 19

Hình 1.7 Các bước thực hiện LAMP 26

Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn thuộc chi staphylococcus 46

1

M Ở ĐẦU

Ngày nay khoa học không ngừng phát triển nhưng chưa có chế phẩm nào thay thế được máu Nhu cầu sử dụng máu và chế phẩm máu ngày càng tăng trong điều trị nội khoa và ngoại khoa Do vậy truyền máu là một vấn đề được nhiều người quan tâm, đặc biệt là công tác sàng lọc và chống nhiễm khuẩn Một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn trong truyền máu là tụ cầu

vàng (Staphylococcus aureus)

Tụ cầu vàng có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như đề kháng kháng sinh của chúng rất mạnh Tụ cầu vàng thường gây những bệnh nhiễm trùng da Các ổ nhiễm trùng này có thể chỉ nhỏ hoặc to Tổn thương tại chố có

thể nhẹ nhàng nhưng nó cũng là một mối nguy cơ phát tán vi khuẩn đến

những cơ quan xa hơn

Trẻ sơ sinh và người mắc bệnh mạn tính là đối tượng dễ bị tụ cầu xâm nhập nhất Người cao tuổi, bị suy nhược, người lạm dụng thuốc kháng sinh,

bệnh nhân đái tháo đường, xơ túi mật…cũng có nguy cơ cao nhiễm loại vi khuẩn này

Hiểu được mối nguy hại mà tụ cầu vàng mang đến trong truyền máu

mà chúng tôi tiến hành đề tài: Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát sự nhiễm

khu ẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu Đề tài được thực hiện tại Bệnh viện

2

Đề tài được thực hiện theo sơ đồ sau:

Thu ththập mẫu Phân lập

3

T ỔNG QUAN I.1 Truy ền máu

I.1.1 Khái quát chung v ề truyền máu

Truyền máu là một khâu trọng yếu của hệ thống cấp cứu và điều trị thương bệnh binh, bệnh nhân và nạn nhân

Truyền máu lâm sàng là các hoạt động liên quan đến việc đưa máu và các thành phần máu vào mạch máu của người nhận với mục đích điều trị y học

Ngày nay khoa học không ngừng phát triển nhưng chưa có chế phẩm nào có thể thay thế được máu Nhu cầu sử dụng máu và chế phẩm máu ngày càng tăng trong điều trị nội khoa và ngoại khoa

Hình 1.1 Hình ảnh túi máu

Việc truyền máu và chế phẩm máu là nhằm mục đích chữa bệnh Vì vậy máu và chế phẩm máu phải được sử dụng cho đúng bệnh nhân và vào thời điểm thích hợp Tổ chức Y tế thế giới có khẩu hiệu là truyền đúng loại, cho đúng bệnh nhân cần, và đúng thời điểm Nếu không cần thiết phải truyền máu hay chế phẩm, nếu còn biện pháp khác để thay thế thì việc truyền máu và

chế phẩm là chống chỉ định

4

Tác dụng của truyền máu:

 Cung cấp các thành phần hữu hình: hồng cầu, tiểu cầu… có thể

cả bạch cầu với bệnh nhân tuyệt lạc bạch cầu

 Cung cấp các yếu tố đông máu

 Cung cấp protein tạo áp lực keo

Các nguy cơ do truyền máu:

 Lây bệnh truyền qua đường máu: các virus, vi khuẩn

 Các tai biến do truyền máu

 Khối hồng cầu

Khối hồng cầu là máu toàn phần đã loại bỏ phần lớn huyết tương, có hematocrit không vượt quá 75%

Huyết sắc tố không thấp hơn 10g/100ml

Khối hồng cầu còn có: khối hồng cầu rửa; khối hồng cầu nghèo bạch cầu,

tiểu cầu

Bảo quản ở +20C đến +60C trong tủ lạnh chuyên dùng cho ngân hàng máu với bảng nhiệt độ theo dõi và các thiết bị cảnh báo[28,30]

Hạn sử dụng không quá 42 ngày

 Khối tiểu cầu

Là chế phẩm tiểu cầu đậm đặc được điều chế từ nhiều đơn vị máu toàn

phần (khối tiểu cầu pool) hoặc tách chiết trực tiếp từ 1 người cho

Khối tiểu cầu pool: Được điều chế từ nhiều đơn vị máu toàn phần, máu để điều chế tiểu cầu cần phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 200C đến 240C và không quá 24 giờ sau khi lấy máu

+ Có số lượng tiểu cầu tối thiểu là 14 × 109 tiểu cầu tính theo điều chế từ 100ml máu toàn phần Thể tích là 50 – 60ml

+ Nếu được điều chế trong hệ thống kín, đựng trong túi dẻo chuyên dùng,

bảo quản ở nhiệt độ 200C đến 240C kèm theo lắc liên tục và hạn dùng không quá 5 ngày

+ Nếu điều chế trong hệ thống hở, bảo quan ở nhiệt độ 200C đến 240C kèm theo có lắc liên tục có hạn dùng không quá 24 giờ kể từ khi điều chế [30] Khối tiểu cầu gạn tách được điều chế từ 1 người cho: Được gạn tách từ

một người cho bằng hệ thống máy tự động

 Huyết tương

Huyết tương gồm có huyết tương tươi và huyết tương tươi đông lạnh

Huyết tương tưới là huyết tương được điều chế từ máu toàn phần tốt nhất trong 6 giờ và tối đa không quá 18 giờ kể từ sau khi lấy máu

Huyết tương tươi đông lạnh là huyết tương tươi được làm đông lạnh và được bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh thấp hơn – 180C Hạn dùng không quá 12 tháng khi bảo quản ở - 180 C đến – 250 C; không quá 24 tháng khi bảo quản ở -250C

hoặc thấp hơn

Ngoài các chế phẩm trên còn có một số chế phẩm khác như: tủa lạnh yếu tố VIII (là chế phẩm gồm phần tủa hình thành trong quá trình làm tan đông chậm huyết tương tươi đông lạnh ở nhiệt độ thấp); khối bạch cầu hạt [3,29]

I.2 Nhi ễm khuẩn trong truyền máu

I.2.1 Yêu c ầu về truyền máu

Truyền máu chỉ đạt hiệu quả khi truyền máu an toàn An toàn truyền máu

là một qui trình khép kín gồm nhiều giai đoạn từ khi tuyển chọn người hiến máu, khám lâm sàng, làm các xét nghiệm sàng lọc, thu thập máu, sản xuất các

chế phẩm máu, lưu trữ, phân phối máu đến chỉ định truyền máu và thực hiện truyền máu trên lâm sàng [21]

Các xét nghiệm sàng lọc gồm: sàng lọc virus HIV, virus viêm gan B, virus viêm gan C, giang mai, sốt rét và có thể có cytomegalovirus (CMV) Tất

cả các xét nghiệm trên phải âm tính thì mới thực hiện việc thu gom máu và sản

xuất các chế phẩm máu [1]

Các chế phẩm máu trước khi đem truyền cho bệnh nhân cần đảm bảo đúng hạn sử dụng, đúng về nhiệt độ bảo quản và phải được làm phản ứng hòa hợp âm tính

7

I.2.2 Tình hình nhi ễm khuẩn trong truyền máu

Thông thường máu trước khi được lấy đem vào sử dụng chỉ được làm thủ tục sàng lọc virus, còn vi khuẩn thì không được kiểm soát Trong khi đó những

ca tử vong liên quan đến nhiễm khuẩn chiếm tỉ lê trên 10% (Theo báo cáo của

Cục Quản lý dược phẩm Mỹ từ năm 1976 đến 1999) [20,22]

Trong khi nguy cơ lây truyền liên quan đến các bệnh do virus như virus suy giảm miễn dịch ở người HIV và viêm gan đã liên tục giảm trong 40 năm qua thì nguy cơ lây truyền vi khuẩn vẫn như nhau Vi khuẩn có thể dễ dàng sinh sôi

nảy nở ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường máu trong quá trình truyền máu và lưu trữ máu Một khi máu đã bị nhiễm khuẩn thì chỉ trong vài giờ chúng có thể đạt số lượng 106/1ml hoặc cao hơn Số lượng vi khuẩn như vậy mà truyền máu cho bệnh nhân chỉ trong một khoảng thời gian ngắn đã có thể gây ra nhiễm trùng mà có thể phát triển thành nhiễm trùng huyết và tử vong[11,36]

Nguyên nhân của nhiễm trùng máu phần lớn là do vi khuẩn gây ra

Staphylococcus aureus là nguyên nhân hàng đầu của nhiễm trùng máu, với mức

độ tử vong và biến chứng cao Tỷ lệ biến chứng gia tăng cùng với thời gian chậm phát hiện và điều trị nhiễm trùng

Một số vi khuẩn hay lây truyền trong truyền máu như: Serratia

marcescens, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas

sp, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Trong s ố những vi khuẩn này, S

aureus là vi khuẩn thưởng gây nhiễm khuẩn huyết nhất vì chúng gây nên nhiều

loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đó vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết Đây là một nhiễm trùng rất nặng Từ nhiễm khuẩn huyết tụ cầu vàng đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áo

xe (gan, phổi, não, tủy xương…) hoặc viêm nội tâm mạc [5,8]

Theo ghi nhận FDA của Mỹ có 76 trường hợp tử vong liên quan đến nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong truyền máu từ năm 2005 đến 2010[22,33]

8

Bảng 1.1 Nhiễm khuẩn liên quan đến sinh vật, 2005 đến năm 2010 của FDA, Mỹ

Organism FY05 FY05 FY06 FY06 FY07 FY07 FY08 FY08 FY09 FY09 FY10 FY10 Total Total

9

Nhìn vào bảng trên thì thấy từ năm 2005 đến năm 2010 S.aureus hầu

như năm nào cũng có mặt trong các ca tử vong có liên quan đến nhiễm khuẩn với tỉ lệ khá cao

Một ví dụ điển hình là tháng 7 năm 2000, một người đàn ông 60 tuổi bị

đa u tuỷ nhập viện St-Louis (Paris- Pháp) Lúc đầu nhập viện, số lượng bạch

cầu là 1100tế bào/mm3; tiểu cầu là 26000/mm3 Bệnh nhân đã được truyền tiểu cầu máy Apheris Sau 20 phút truyền, phát hiện thấy bệnh nhân ớn lạnh, tiêu chảy, nôn mửa, nhịp tim nhanh và bị trụy mạch Nuôi cấy máu tĩnh mạch của bệnh nhân và lượng tiểu cầu còn sót lại trong túi truyền rồi phân lập thì

thấy phát hiện ra mẫu tiểu cầu truyền cho bệnh nhân đã bị nhiễm S aureus

[31,36]

Ngày 25 tháng 11 năm 2011, tại Hà Nội, Hội Hồi sức cấp cứu và Chống độc Việt Nam phối hợp cùng Công ty Dược phẩm Astra Zeneca tổ

chức Hội thảo khoa học quản lý nhiễm khuẩn với chủ đề: “Cập nhật tình hình

tụ cầu vàng tại Việt Nam và giải pháp kháng sinh điều trị” Theo thống kê,

loại vi khuẩn gây các nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp, vi khuẩn Gram âm chiếm 60-80%, vi khuẩn Gram dương chiếm 20-40% Kết quả phân lập các vi khuẩn gây bệnh tại khoa ICU, bệnh viện Bạch Mai thì tụ cầu vàng được xếp

thứ 3 là nguyên nhân gây bệnh (chiếm 13,9%) Hậu quả của tình trạng này làm tỷ lệ tử vong tăng, thời gian điều trị kéo dài, chi phí điều trị tăng…Trong các loại vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp thì tụ cầu vàng thuộc nhóm đứng đầu [4,23]

I.2.3 Nguyên nhân nhi ễm khuẩn trong truyền máu và cách phòng tránh

 Nguyên nhân nhi ễm khuẩn trong truyền máu

Nhiễm khuẩn trong truyền máu có rất nhiều nguyên nhân:

Do người hiến máu bị nhiễm khuẩn: Người hiến máu có thể không có triệu chứng gì của nhiễm khuẩn mà chỉ đang trong giai đoạn cửa sổ hoặc cũng

10

có thể người đó đang trong giai đoạn hồi phục do bị nhiễm khuẩn [13]

Nhiễm khuẩn trong suốt quá trình thu gom máu: Ô nhiễm tại thời điểm thu gom máu là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn Khi lấy máu không sát trùng cẩn thận là yếu tố gây nhiễm khuẩn Ngoài ra có thể vi khuẩn xâm nhập

chỉ qua viết kim chọc vào rất nhỏ Vật liệu sát trùng như bông, cồn bị nhiễm khuẩn

Túi thu thập máu bị nhiễm khuẩn: Có thể dây trong bộ túi thu thập bị rò

rỉ cũng là con đường xâm nhập của vi khuẩn

Quá trình khử khuẩn môi trường làm chế phẩm máu cũng như truyền máu là nguyên nhân rất lớn gây ra nhiễm khuẩn khi truyền máu

I.3 Khái quát về Staphylococcus aerus

I.3.1 L ịch sử phát hiện tụ cầu vàng

Ngày 9-4-1881 bác sĩ người ScotlADN AlexADNer Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) trình bày tương đối đầy

đủ vai trò của vi khuẩn này trong bệnh sinh lý mủ trong lâm sàng

S aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập từ

mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử vi sinh vật học [18,27]

11

Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus

Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện của hoạt động enzym coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuy nhiên mãi đến năm 1984, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi [18]

I.3.2 Phân lo ại

Phân loại Staphylococcus theo khoa học

Tên khoa học: Staphylococcus aureus

Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính : tụ cầu có enzym coagulase và tụ cầu không có enzym coagulase [8,27]

Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng [5,8]

I.3.3 Đặc điểm của tụ cầu vàng

I.3.3.1 Hình thái và tính ch ất nuôi cấy tụ cầu vàng

 Hình thái

Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0,8 µm – 1 µm, ở canh thang thường tập hợp thành từng cụm nhỏ như chùm nho, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian Trong bệnh phẩm vi khuẩn họp thành từng đôi hoặc đám nhỏ Vi khuẩn bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, thường không có vỏ [8,18]

Hình 1.4 Hình thể Staphylococcus aureus

 Đặc điểm nuôi cấy

S.aureus mọc dễ trên nhiều loại môi trường nuôi vấy vi khuẩn ở điều kiện

Trên môi trường Chapman agar S.aureus tạo khuẩn lạc vàng và môi

trường chuyển từ hồng sang vàng

Trên môi trường Baird Parker (BP) S.aureus tạo khuẩn lạc đen, quanh

khóm có vòng sáng

Trên môi trường thạch máu S.aureus phát triển nhanh gây dung huyết, tạo tan máu hoàn toàn, khuẩn lạc tròn nhẵn, đường kính 1-3mm, hình thành sắc tố trắng đến hơi vàng Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố (hemolysis) : α, β,

δ, ε, γ

Trên môi trường gelatin S.aureus gây tan chảy

Trên môi trường canh thang : tụ cầu vàng làm đục, để lâu nó có thể lắng

cặn[18,27]

I.3.3.2 Đặc tính và yếu tố độc lực

Staphylococcus aureus có enzym Coagulase Enzym này có bản chất là protein, gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hoá quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen Enzym này cùng với yếu tố kết cụm (clumping factor), một enzym vách vi khuẩn giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó Tính chất này là yếu tố sinh bện cực kỳ quan trọng và yếu tố đó cũng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán [5,8]

14

Bảng 1.2 Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn S aureus

Vi khuẩn Catalase

Đông huyết tương

Dung huyết Sinh sắc tố Manitol

S aureus dương tính dương tính nghi ngờ dương tính dương

tính

Coagulase tạo huyết cục trong tĩnh mạch và gây nhhiễm khuẩn huyết

Có hai loại cagulase:

- Coagulase cố định trên thân vi khuẩn, phát hiện bằng phản ứng đông huyết tương trên lam kính, nhưng cho kết quả âm tính 10-15%

- Coagulase tự do, phát hiện bằng phản ứng đông huyết tương trên ống nghiệm Trường hợp phản ứng đông huyết tương trên lam kính

âm tính phải làm lại trên ống nghiệm

Enzym chuyển hóa đường manit : S aureus có khả năng chuyển hóa đường manit, phát hiện trên môi trường schapman (môi trường gồm có đường manit, natriclorua nồng độ 6,5%, chỉ thị màu đỏ phenol), vi khuẩn lên enzym đường làm chuyển màu môi trường từ đỏ da cam sang màu vàng) [18,27]

Catalase phân hủy hydrogen peroxide tạo bởi quá trình thực bào (H2O2→ H2O + O2) Tính chất này giúp phân biệt tụ cầu vàng với các cầu khuẩn Gram dương khác Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch Nhỏ một giọt dung dịch H2O23 % Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau vài giây Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt [7,19]

Hyaluronidase : enzym này có khả năng phá huỷ chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức

Hemolysine và leukocidine : phá huỷ hồng cầu (gây tan máu) và gây chết

15

các tế bào hạt cũng như đại thực bào[ 8,27]

Exfoliatine : là các enzym phá huỷ lớp thượng bì Enzym này gây tổn thương da tạo các bọng nước Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu

Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có liên quan đến cấu

tạo của vách vi khuẩn:

- Vỏ polysaccharide : một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào

- Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với thành mảnh Fc của các globuline miễn dịch Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch

có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hoá : chúng là các receptor cho các đại thực bào Quá trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi đại thực bào [5]

Hình 1.5 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus

- Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt Các độc

tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm

beta-I.3.3.3 Khả năng đề kháng và sự kháng kháng sinh của tụ cầu vàng

 Cơ chế gây bệnh

S.aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptid Sau đó nó khởi động các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ S aureus sẽ tiếp tục xâm nhập vào sâu trong cơ thể vật chủ để tiếp tục quá trình xâm nhập S aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một

số enzym: hyaluronidase, hemolysine, leukocidin, exfoliatine…, phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ

Tụ cầu vàng gây 2 hội chứng là nhiễm trùng và nhiễm độc:

- Hội chứng nhiễm độc: Do tác dụng của một hay nhiều độc tố vi khuẩn

mà đôi khi không cần sự hiện diện của vi khuẩn Các biểu hiện nhiễm độc bao gồm hội chứng sốc do độc tố (TSST: Toxic Shock Syndrome Toxin) Các quá trình nhiễm độc do tụ cầu trải qua 4 bước: sự xâm nhập chủng vi khuẩn sinh độc tố, sản xuất độc tố, hấp thu độc tố và gây nhiễm độc

- Hội chứng nhiễm trùng: Do vi khuẩn tăng sinh xâm nhập hay phá hủy các mô của ký chủ, gây ra đáp ứng viêm tại chỗ hoặc toàn thân trong

hầu hết các trường hợp Khả năng nhiễm trùng của tụ cầu là nhờ vào việc chúng sản xuất ra các yếu tố độc lực giúp vi khuẩn có thể tồn tại

và phát triển trong cơ thể ký chủ

17

 Khả năng đề kháng

Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hoá chất cao hơn các vi khuẩn không có bào tử khác Nó bị diệt ở 800C trong một giờ (các vi khuẩn khác thường bị chết ở 600C trong 30 phút) Khả năng đề kháng với nhiệt độ thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450C) mà vi khuẩn

có thể phát triển Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường [8]

 Sự kháng kháng sinh

Sự kháng lại kháng sinh của tụ cầu vàng là một đặc điểm rất đáng lưu

ý Đa số tụ cầu kháng lại penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được enzym penicillinase nhờ gen R-plasmid Một số còn kháng lại được methicillin gọi là

tụ cầu kháng methicillin (Methicillin resistance S aureus, viết tắt là MRSA),

do nó tạo được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh Hiện nay,

một số rất ít tụ cầu còn đề kháng được với Cephalosporin các thế hệ Kháng sinh được dùng trong các trường hợp này là vancomycin [5,8]

I.4 M ột số kỹ thuật phát hiện tụ cầu vàng

 Chuẩn đoán xác định : Các tính chất để xác định tụ cầu vàng là :

- Khuẩn lạc dạng S có màu vàng nhẹ

- Cầu khuẩn Gram dương xếp thành từng đám khi nhuộm Gram

- Có enzyme coagulase (enzyme này làm đông huyết tương) : đây là đặc điểm quan trọng thường được dùng trong thực hành

- Lên men đường manitol

18

tụ cầu khác có ý nghĩa trong y học là S epidemidis (tụ cầu da) và

S.saprophyticus dựa vào các tính chất như sau [7] :

Bảng 1.3 Bảng phân biệt S aureus và S epidemidis, S saprophyticus Tính chất coagul

ase

Tan máu

β

Lên men đường manitol

Deoxiribonuclease

novobiocin

Protein

A trên vách

I.4 1.Phương pháp chuẩn đoán vi sinh

I.4.1.1 Nuôi c ấy, phân lập tụ cầu vàng

 Nhuộm Gram, nuôi cấy

Phần cặn thu được đem lắng nhuộm Gram : Nếu thấy cầu khuẩn tụ lại như chùm nho đó là vi khuẩn Gram dương

Tiến hành cấy ria vi khuẩn trên môi trường thạch rồi để vào tủ ấm quan sát sau 24h

Nếu cấy trên môi trường thạch máu thấy xuất hiện khuẩn lạc, nếu là tụ cầu vàng thì thấy tan máu beta

Nếu cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng sẽ cho khuẩn lạc màu vàng

19

 Chọn khuẩn lạc làm thử nghiệm

Lấy khuẩn lạc làm thử nghiệm catalase :nhỏ một giọt oxy già lên lam kính sau đó lấy que cấy nghiền khuẩn lạc vào nếu thấy sủi bọt thì phản ứng là dương tính Phản ứng catalase dương thì khẳng định đó là tụ cầu nhưng chưa

chắc là tụ cầu vàng

Làm thử nghiệm lên men đường manitol

I.4.1.2 Kiểm tra hình thái vi khuẩn

Làm tiêu bản: Nhỏ một giọt nước sinh lý lên phiến kính sạch Lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch hòa đều vào giọt nước dinh lý Nếu làm tiêu bản từ canh trùng thì lấy 1 vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn dàn mỏng trên phiến kính Tiêu bản được để khô, cố định trên ngọn lửa đèn cồn và nhuộm

Gram [7,8]

Vi khuẩn S aureus bắt màu tím (Gram dương), hình tròn, tập trung thành

từng đám như chùm nho

Hình 1.6 Hình ảnh S aureus bắt màu Gram

I.4.1.3 Chu ẩn đoán huyết thanh

Phương pháp này cho kết quả chậm, không phục vụ kịp thời cho chẩn đoán bệnh nên thường không làm, trừ một số bệnh tụ cầu mạn tính ở các tổ

chức xương

Các xét nghiệm nhanh tương tự xét nghiệm PCR cũng được áp dụng trong lâm sàng tại một số bệnh viện để phát hiện tụ cầu vàng kháng methicilin

20

(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus – MRSA)

Ở S aureus, phản ứng huyết thanh không có giá trị chuẩn đoán vi

khuẩn, người ta định tuyp tụ cầu bằng phage, đây là phương pháp có giá trị cao về mặt dịch tễ học, nhờ những phage đặc hiệu, người ta xếp tụ cầu vào

một trong bốn nhóm chính: I, II, III, IV Tụ cầu thuộc nhóm nào thì bị ly giải

bởi phage thuộc nhóm đó[12]

Tại trường đại học ETH ở Lausanne, Thụy sỹ các nhà khoa học vừa sáng chế ra một loại chip sinh học có thể xác định nhanh chóng các loại vi trùng trong cơ thể người Với một giọt máu của người bệnh, bác sĩ chỉ cần 6 đến 8 tiếng là có thể xác định được 80% loại vi trùng [12,26]

Tại Âu Mỹ, để tiết kiệm thì giờ chờ vi trùng mọc để xác định, các nhà sản xuất đã sáng chế những bộ Kit để thử nhanh những loại vi trùng hay gặp, trong đó có bộ Kit tìm tụ cầu vàng đề kháng methicillin Tên bộ Kit này là Xpert MRAS/SA Blood culture Assay, của công ty Cepheid ở Sunnyvale California Công ty phải thu hồi tất cả bộ Kit sản xuất từ tháng 10 năm 2008 đến tháng 6 năm 2010, do đã không tìm ra được vi trùng MRSA/SA ở một số bệnh nhân, khiến điều trị kháng sinh sai lạc[12]

I.4.2 K ỹ thuật phân tử

I.4.2.1 K ỹ thuật PCR

 Khái quát chung

PCR là phương pháp khuếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzyme ADN chịu nhiệt, hai mồi

tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước[6,9]:

- Bước 1: Biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép

- Bước 2: Bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn

21

- Bước 3: Kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’ -3’ với quá trình trùng hợp

gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc

bổ sung

Tính đặc hiệu của phản ứng được qui định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên

bản sợi khuôn trong vài giờ

Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym ADN polymerase để nhân bản một đoạn ADN nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid (primers) tương hợp với hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn AND

Sau khi phân lập bệnh phẩm trên môi trường đặc hiệu, các khuẩn lạc nghi ngờ sẽ được tiến hành ADN làm khuôn mẫu cho PCR để tìm gen [6,10]

Phương pháp này có những ưu điểm là độ đặc hiệu cao, khắc phục được nhược điểm của các thử nghiệm khác Tuy nhiên đây là một phương pháp đòi hỏi phải có máy móc, trang thiết bị và sinh phẩm đắt tiền nên không

phải ở đâu cũng có khả năng thực hiện[9,10]

Nghiên cứu mới đây được thực hiện bởi Harbarth và cộng sự thực hiện cho thấy so với kỹ thuật nuôi cấy thường quy, phương pháp PCR giúp làm giảm thời gian phát hiện các chủng tụ cầu vàng kháng Methicillin ở các bệnh nhân được điều trị tại các đơn vị chăm sóc tích cực nội khoa từ 106 giờ xuống

23 giờ và giảm từ 87 giờ xuống 21 giờ ở các bệnh nhân được điều trị tại các đơn vị chăm sóc tích cực ngoại khoa [34]

 Các thông số kỹ thuật

Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi khuôn Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩn nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng Đôi khi chuẩn bị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của

22

EDTA (acide ethylene- diamine- tetraacetique) hoặc đệm phosphat vì kết quả

sẽ làm giảm Mg++ do EDTA tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao Phản ứng PCR có thể nhân được đoạn gene dài 10Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân các đoạn có kích thước ngắn hơn (<2Kb)

Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ Điều chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau Trình tự đầu

3’ của các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc Nói chung, ngày nay người ta có thể tối

ưu hóa nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính

Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu, điều này thường xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn Các thành phần như nhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzyme có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu

Sự có mặt của nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất phản ứng

 Ưu điểm của phản ứng PCR

Thử nghiệm PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh có độ nhạy cực cao

mà không có một thử nghiệm nào trước đây có thể so sánh được Sở dĩ được như vậy vì chỉ cần dưới 1 vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là có thể hiện diện acid nucleic đích và được PCR khuếch đại [9,10]

Trong các thử nghiệm huyết thanh hay miễn dịch học, chìa khóa chính của

thử nghiệm là có được trong tay các kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu

Nếu không muốn mua sản phẩm thương mại, nhà miễn dịch học phải tự chế

và đây là một công việc rất công phu và tốn thời gian Trong khi đó với PCR, chìa khóa chính của thử nghiệm là vấn đề tìm cho được các đoạn mồi đặc hiệu.Với cơ sở dữ liệu về thư viện ADN của các vi sinh vật mà các nhà

23

nghiên cứu đã nghiên cứu được và với một phần mềm chuyên dùng, một nhà

vi sinh vật học hay sinh học phân tử có thể tự chọn những cặp mồi theo đúng trình tự đã chọn Sau khi tổng hợp xong, làm đông khô có thể giữ rất bền trong điều kiện bình thường Công việc của nhà nghiên cứu lúc này là thử nghiệm xem các đoạn mồi được chọn có nhạy cảm và đặc hiệu như mong

muốn hay không, nếu không thì lại chọn một cặp mồi khác [9,10]

Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn là PCR chẳng những có thể phát hiện được tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có thể phân loại type di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy được vi khuẩn Đây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng

Ngoài ra PCR còn có thể phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh, một chìa khóa chủ yếu để bác sỹ điều trị có thể sử dụng phác đồ điều trị đúng cho bệnh nhân

 Một số khó khăn với phản ứng PCR

PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưng cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh virus hay vi khuẩn Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào

sống đều cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR Hiện tượng dương tính giả chủ yếu là do mẫu thử bị nhiễm bởi các sản phẩm PCR trước đó Chỉ cần mẫu thử bị nhiễm một hoặc vài mảnh sản phẩm PCR thì các mảnh này sẽ được khuếch đại và mẫu cho kết quả dương tính nhưng là dương tính giả Để

có thể tránh được kết quả dương tính giả, PCR chẩn đoán phải được thực hiện trong một phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ, các giai đoạn thí nghiệm phải được thực hiện tại những khu vực riêng, với các đồ dùng thí nghiệm riêng, sử dụng nhiều vật liệu chỉ dùng một lần (đầu pipette, ống nghiệm phản

24

ứng,…).Ngoài ra còn phải áp dụng nhiều biện pháp để loại trừ ngoại nhiễm như: trộn sẵn trong ống nghiệm làm phản ứng men Uracil N Glycosylase (UNG) là men có khả năng phá hủy các sản phẩm PCR ngoại nhiễm trước khi phản ứng PCR xảy ra Chính nhờ vệc sử dụng UNG mà các thử nghiệm chẩn đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh có thể thực hiện được tại bất cứ phòng thí nghiệm nào, không cần phải tại một phòng thí nghiệm được thiết kế đặc biệt cho PCR chẩn đoán [9,10]

 M ột số kỹ thuật PCR khác

Một số kỹ thuật phát triển trên cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan

trọng cho định danh và định typ vi sinh vật

 Kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR)

Nested PCR là kỹ thuật thực hiện 2 lần PCR chuẩn kế tiếpthuật PCR lồng (Nested PCR) Nó có thể làm tăng thêm độ nhạy của thử nghiệm một khi acid nucleic đích hiện diện khá ít trong mẫu thử

Nested PCR là kỹ thuật thực hiện 2 lần PCR chuẩn kế tiếp nhau Trong đó, lần PCR thứ nhất sử dụng cặp mồi không mấy đặc hiệu để khuếch đại nucleic đích đến một số lượng nào đó đủ để vào giai đoạn kế, khuếch đại đoạn acid nucleic đích bằng cặp mồi đặc hiệu cao có vị trí bắt cặp nằm bên trong các đoạn acid nucleic được khuếch đại trong giai đoạn đầu PCR lồng được sử dụng phổ biến trong phân loại phân tử, cho phép khuếch đại các đoạn ADN đặc trưng cho các đơn vị dưới loài, phân biệt sự khác nhau giữa các giống

25

động thực vật, các chủng vi sinh vật [6]

 Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR)

Kỹ thuật PCR đảo là phương pháp PCR để nhân một đoạn ADN chưa biết trên phân tử ADN, nằm trước hoặc sau một đoạn ADN đã biết một trình tự Ngoài ra còn có kỹ thuật PCR dạng neo (Achored PCR), kỹ thuật PCR

phức (Multiplex PCR), kỹ thuật PCR tại chỗ

I.4.2.2 Kỹ thuật Lamp

LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) là phương pháp khuếch đại nucleic acid đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm Sử dụng 4 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đoạn riêng biệt trên gen đích và quá trình phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cố định dùng phản ứng thay thế mạch Khuếch đại và phát hiện gen có thể được hoàn thành chỉ trong 1 bước Bằng cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, ADN polymerase có hoạt tính thay thế mạch và

chất nền ở nhiệt độ cố định (khoảng 650C) Phương pháp này cho hiệu quả khuếch đại cao với lượng ADN được khuếch đại đến 109-1010 lần trong vòng 15-60 phút Bởi vì tính đặc hiệu cao, sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại có thể chứng tỏ sự có mặt của đoạn gen quan tâm [34,35]

26

Hình 1.7 Các bước thực hiện LAMP

 Đặc điểm

- Không cần bước làm tách mạch đôi thành dạng mạch đơn

- Cả phản ứng khuếch đại xảy ra liên tục dưới điều kiện đẳng nhiệt

- Hiệu quả khuếch đại rất cao

- Thiết kế 4 primers nhận ra 6 đoạn riêng biệt, phương pháp LAMP có thể khuếch đại đặc hiệu đoạn gen cần quan tâm

- Tổng giá thành có thể được giảm giá vì LAMP không đòi hỏi hóa chất đặc biệt và thiết bị phức tạp

 Nguyên tắc phản ứng

Khi đoạn gene quan tâm và hoá chất được ủ ở nhiệt độ cố định khoảng 65°C trong vòng 45-60 phút và kết thúc phản ứng bằng cách ủ ở nhiệt độ 80

60-độ trong 2-10 phút [35]

 Ưu điểm và nhược điểm của LAMP

Phương pháp LAMP không đòi hỏi điều kiện phòng thí nghiệm hiện đại, nhân lực trình độ cao, phản ứng xảy ra đặc hiệu, thực hiện nhanh chóng, rất

I.4.2.3 K ỹ thuật lai phân tử

Các phân tử ADN sợi kép có một tính chất đặc biệt là khả năng biến tính (phân tách thành hai mạch đơn) và hồi tính (hai mạch đơn có trình tự bổ trợ có xu hướng liên kết trở lại khi vắng mặt các tác nhân gây biến tính) Khả năng liên kết bổ trợ giữa các bazơ nitơ cũng cho phép hai mạch ADN có nguồn gốc khác nhau nhưng có trình tự bổ trợ liên kết với nhau trong điều

kiện phù hợp (về nhiệt độ, độ pH, ion hoá p) để tạo nên một phân tử ADN

mới [6]

Hiện tượng liên kết như vậy cũng có thể xảy ra giữa hai mạch ADN với nhau, hoặc giữa hai mạch RNA hoặc giữa ADN và RNA Phân tử axit nucleic

28

sợi kép mới hình thành gọi là phân tử lai và quá trình kết cặp giữa các bazơ thuộc hai mạch đơn axit nucleic có nguồn gốc khác nhau theo nguyên tắc bổ trợ như vậy được gọi là quá trình lai phân tử [6]

I.4.2.4 Chip sinh h ọc

Một trong những kỹ thuật hàng đầu trong các công nghệ sinh học phải

kể đến là kỹ thuật Chip sinh học (còn gọi là Gen-Chip, ADN-Chip, Bio-Chip) Nhiều chuyên gia cho rằng, chip sinh học sẽ thay đổi toàn bộ các phương pháp nghiên cứu hiện nay trong lĩnh vực tìm kiếm các loại thuốc trị bệnh Với Chip sinh học các công ty có thể giảm thời gian nghiên cứu và phát triển

từ hai đến ba năm và như vậy chi phí sẽ giảm đi hằng trăm triệu Euro

Chip sinh học là một miếng vuông nhỏ bằng thuỷ tinh hay bằng nhựa nhân tạo Trên đó được chia thành nhiều ô cực nhỏ giống như một bàn cờ và mỗi một ô của chip sinh học chứa một đoạn ADN đã biết Để đưa một đoạn ADN vào các khung nhỏ người ta dùng phương pháp quang học hoặc cơ học

với kỹ thuật phun

Trung bình mỗi ô chip sinh học chứa khoảng 10 triệu phân tử nucleotid Đầu năm 2000 người ta chế tạo được một chip sinh học với 64000 nucleotid khác nhau, trên một diện tích 1,28cm x 1,28 cm

Để xác định sự hoạt động của gen các nhà nghiên cứu dựa vào hai yếu

tố: loại và số lượng của phân tử mRNA xuất hiện trong tế bào Phân tử mRNA là bản sao của ADN Trong quá trình thể hiện tính trạng của một gen (một hay nhiều đoạn ADN), mRNA có nhiệm vụ mang thông tin của ADN trong nhân tế bào đưa đến, “nhà máy” sản xuất protein là ribosom để tổng hợp các protein tương ứng Vì vậy, việc xuất hiện của mRNA là một bằng chứng

về sự hoạt động của gen Tuy nhiên trên thực tế phân tử mRNA khó sử dụng nên các nhà khoa học thường dùng bản sao của mRNA là phân tử cADN

Tuỳ theo loại chip và mục đích của nó, các mẫu thí nghiệm có thể là