Nghiên cứu này giới thiệu một quy trình tách chiết DNA nhanh và hiệu quả từ phương pháp CTAB cải tiến, từ đó, áp dụng vào phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự matK của loài Limnocharis flava nhằm xác định vị trí phân loại của họ Limnocharitaceae. Kết quả cho thấy, trình tự của sản phẩm PCR được khuếch đại từ DNA tổng được tách chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến cho kết quả có độ tin cậy cao.
Trang 1XÁC ĐỊNH VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CỦA HỌ LIMNOCHARITACEAE
BẰNG DỮ LIỆU PHÂN TỬ DỰA TRÊN DNA TỔNG
TỪ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT NHANH Huỳnh Nữ Băng Thùy, Nguyễn Anh Đức, Trình Trung Hiếu,
Võ Tuấn Dũng, Văn Hồng Thiện*
Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM
*Tác giả liên lạc: vanhongthien@iuh.edu.vn
(Ngày nhận bài: 22/12/2017; Ngày duyệt đăng: 22/3/2018)
TÓM TẮT
Nghiên cứu này giới thiệu một quy trình tách chiết DNA nhanh và hiệu quả từ phương pháp CTAB cải tiến, từ đó, áp dụng vào phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự matK của loài Limnocharis flava nhằm xác định vị trí phân loại của họ Limnocharitaceae Kết quả cho thấy, trình tự của sản phẩm PCR được khuếch đại từ DNA tổng được tách chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến cho kết quả có độ tin cậy cao Ngoài ra, phân tích phả hệ cũng cho thấy, các loài thuộc họ Limnocharitaceae đều xếp gọn bên trong các loài thuộc họ Alismataceae, từ đó đã khẳng định lại vị trí phân loại của họ
Limnocharitaceae
Từ khóa: Tách chiết DNA, limnocharis flava, limnocharitaceae, alismataceae
TAXONOMIC IDENTITY OF LIMNOCHARITACEAE BASED ON
MOLECULAR DATA FROM A RAPID DNA EXTRACTION PROTOCOL
Huynh Nu Bang Thuy, Nguyen Anh Duc, Trinh Trung Hieu,
Vo Tuan Dung, Van Hong Thien*
Institute of Biotechnology and Food Technology – Industrial University of
Ho Chi Minh City
*Corresponding Author: vanhongthien@iuh.edu.vn
ABSTRACT
In this study, we used a rapid and effective DNA extraction protocol which are modified from CTAB method to amplify matK sequence of Limnocharis flava for determination
of taxonomic position of Limnocharitaceae family The data demonstrated that the matK sequence amplified by this protocol had high reliability Furthermore, phylogenetic analysis revealed that species of Limnocharitaceae nested in Alismataceae family, and thus taxonomic position of Limnocharitaceae family was re-classified
Keywords: DNA extraction, limnocharis flava, limnocharitaceae, alismataceae
TỔNG QUAN
Limnocharitaceae là một họ thực vật với
số lượng loài khá ít (Phạm Hoàng Hộ,
2000) Theo các bằng chứng về phôi, sinh
hóa và cả phân tử đã cho thấy, họ
Limnocharitaceae có mối quan hệ rất gần
với họ Alismataceae (Donald and
Nicholas, 2013) và hiện nay, trên hệ thống
thông tin về thực vật của Vườn thực vật
Limnocharitaceae vào họ Alismataceae (www.theplantlist.org) Tuy nhiên, ở Việt Nam, Phạm Hoàng Hộ (2000) cho rằng, Limnocharitaceae là một họ riêng biệt và
chỉ gồm 2 loài là Limnocharis flava và Tenagocharis latifolia Do đó, đề tài
nghiên cứu này sẽ cung cấp thêm dữ liệu
phân tử (vùng trình tự matK của gen lục
lạp) nhằm góp phần xác định vị trí phân
Trang 2là loài L flava)
Hiện nay, việc ứng dụng các chỉ thị phân
tử trong nghiên cứu phân loại học ở thực
vật trở nên rất phổ biến trên thế giới
(Palmer et al., 2004) và Việt Nam (Văn
Hồng Thiện, 2017) Để thành công trong
các phản ứng PCR thì một phần công việc
hết sức quan trọng là tách chiết DNA tổng
số Hiện tại, hầu hết các nghiên cứu có liên
quan đến quá trình tách chiết DNA đều tập
trung vào 2 phương pháp: (1) sử dụng các
bộ kít chuyên dụng và (2) phương pháp
CTAB Phương pháp đầu tiên có ưu điểm
là cho kết quả nhanh, DNA khá tinh sạch,
tuy nhiên chi phí lại khá cao Ngược lại,
phương pháp CTAB ít tốn kém hơn nhưng
quy trình thực hiện phức tạp và thường mất
thời gian Do vậy, trong khuôn khổ bài báo
này, chúng tôi giới thiệu 1 quy trình tách
chiết DNA nhanh từ phương pháp CTAB
có cải tiến cũng như quy trình chuẩn dung
cho phản ứng PCR từ phương pháp này
Sản phẩm DNA tổng số sau khi được tách
chiết sẽ được đưa ngay vào thực hiện phản
ứng PCR mà không cần phải qua các bước
định tính hay định lượng
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu
Mẫu Limnocharis flava được thu tại huyện
Bến Lức, tỉnh Long An với 3 cá thể (ký
hiệu mẫu là L1, L2, L3)
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
(1) Khử mẫu lá với cồn 70% ; (2) Nghiền
200mg mẫu lá trong 1000 µl dung dịch
đệm tách chiết (NaCl 1.5M, Tris-HCl (pH
8,0) 100 mM; EDTA (pH 8,0) 20 mM,
CTAB 4%) (tăng hiệu quả thành công nếu
mẫu được chuyển thành dạng bột với Nitơ
lỏng), vortex mạnh và ủ 60ºC trong 15
phút (3 phút đảo đều); (3) Bổ sung 800 µl chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1), đảo đều; (4) Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút
ở 4ºC, thu dịch nổi trên cùng sang 1 eppendorf khác; (5) Thêm 800 µl isopropanol, đảo nhẹ, để ủ ở tủ -20ºC trong
30 phút; (6) Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút ở 4ºC, loại bỏ dịch nổi và thu tủa; (7) Thêm 800 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng trong 10 phút ở 4ºC thu tủa; (8) Để khô tủa 15-25 phút, thêm 50 µl dung dịch
TE và bảo quản ở -20ºC
Phương pháp PCR
Vùng trình tự matK của gen lục lạp được khuếch đại bằng cặp mồi theo Fazekas et
al (2012) Phản ứng PCR được thực hiện
trên máy Mastercycler (hãng Eppendorf, Đức) với các thành phần như sau: 12,5 µl
Go Taq Green Master Mix (hãng Promega, Mỹ), 1,25µl mỗi mồi xuôi và ngược (10 µM), 9 µl nước khử ion và 1 µl DNA mẫu Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR gồm: 5 phút ở 95°C; 35 chu kỳ gồm: biến tính (1 phút ở 94°C), bắt cặp (1 phút 30 giây ở
55oC) và kéo dài (1 phút 30 giây ở 72°C); kéo dài ở 72°C trong 10 phút
Sản phẩm PCR được tin sạch và giải trình
tự tại Công ty Nam Khoa, quận 7, TP.HCM
Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài
Kết quả giải trình tự 2 chiều được kiểm tra
độ chính xác bằng mắt với sự hỗ trợ của phần mềm FinchTV và Seaview Các trình
tự được sắp gióng bằng phần mềm
ClustalX2.1 (Thompson et al., 1994), ghi
nhận khoảng cách di truyền và xây dựng cây phả phát sinh loài của mẫu nghiên cứu
và các trình tự từ Genbank (Bảng 1) bằng
phần mềm MEGA6 (Tamura et al., 2013)
theo phương pháp Neighbor Joning với
nhóm ngoại là loài Limnobium spongia
(Donald and Nicholas, 2013)
Bảng 1 Trình tự của các taxa từ dữ liệu GenBank được sử dụng trong nghiên cứu STT Tên loài Mã số
GenBank
STT Tên loài Mã số
GenBank
1 Albidella
nymphaeifolia
EF088125 14 Echinodorus
decumbens
EF088117
Trang 32 Alisma gramineum KX526478 15 Helanthium
bolivianum
KF632794
3 Alisma lanceolatum HM850585 16 Helanthium
zombiense
EF088120
4 Alisma nanum JF781066 17 Hydrocleys
nymphoides
AB002580
5 Baldellia
ranunculoides
HM850587 18 Limnocharis flava HQ456464
6 Butomopsis latifolia HQ456459 19 Limnophyton
angolense
JF781076
7 Burnatia enneandra JN547814 20 Luronium natans JN894192
8 Caldesia grandis JF781068 21 Ranalisma humile HQ456466
9 Caldesia oligococca KF632791 22 Ranalisma
rostratum
JF781078
10 Damasonium alisma JF781070 23 Sagittaria
graminea
JF781084
11 Damasonium minus JF781069 24 Sagittaria
guayanensis
JF781081
12 Echinodorus
berteroi
EF088134 25 Wiesneria
triandra
HQ535983
13 Echinodorus
cordifolius
KF632792 26 Limnobium
spongia
HQ456471
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả khuếch đại trình tự vùng matK
Kết quả thể hiện ở Hình 1 cho thấy, sản
phẩm PCR của 3 cá thể nghiên cứu đều
sáng rõ, kích thước nằm giữa vạch 800 và
900 bp so với thang chuẩn Kết quả này phù hợp với kích thước lý thuyết của cặp
mồi do Fazekas et al., (2012) thiết kế mà
chúng tôi sử dụng cho đề tài nghiên cứu này
Hình 1 Kết quả PCR của 3 cá thể loài L flava
Như vậy, 3 phản ứng PCR được thực hiện
dựa trên các mẫu DNA tổng số vừa được
thực hiện theo quy trình tách nhanh mà
chúng tôi cải tiến từ phương pháp CTAB
đã cho kết quả tốt Để khẳng định tính
chính xác của sản phẩm PCR cũng như cho các phân tích tiếp theo, chúng tôi cho ngẫu nhiên 1 sản phẩm để giải trình tự (mẫu L2) Trình tự DNA của mẫu nghiên cứu sau khi
Trang 4từ GenBank để xây dựng cây phát sinh loài
nhằm xác định mối tương quan giữa họ
Limnocharitaceae và Alismataceae
Kết quả xây dựng cây phả hệ
Kết quả phân tích đặc điểm trình tự của các
taxa nghiên cứu cho thấy, trình tự vùng
matK của các taxa dao động khoảng từ 750
đến 769 bp Các trình tự sau khi sắp gióng
có chiều dài 704 đến 742 bp Trình tự
matK của mẫu nghiên cứu (L2) có tỉ lệ A
+ T là 68%, có 9 vị trí thêm đoạn (insertion) so với nhóm ngoại ở các vị trí
từ 52 đến 60
Hình 2 Cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ di truyền giữa họ Limnocharitaceae
và Alismataceae dựa trên vùng trình tự matK được xây dựng dựa trên mẫu nghiên cứu
(L2) và các taxa từ dữ liệu GenBank bằng phần mềm MEGA6, phương pháp Neighbor
Joning, bootstrap 1.000 lần lặp lại Cây phát sinh loài thể hiện ở Hình 2 cho
thấy, mẫu nghiên cứu (L2) xếp chung
nhóm với loài Limnocharis flava (mã số
GenBanK là HQ456464) với bootstrap là
100% Ngoài ra, xét trên toàn bộ trình tự
vùng matK cũng cho thấy mẫu L2 và loài
L flava (HQ456464) không có sự khác
biệt và do đó, giữa chúng có khoảng cách
di truyền bằng 0 (Bảng 2) Như vậy, từ kết quả trên đây đã chứng minh rằng, mẫu nghiên cứu được PCR từ DNA tổng số là hoàn toàn chính xác
Trang 5Bảng 2 Khoảng cách di truyền giữa mẫu nghiên cứu (L2) và các taxa
thuộc họ Alismataceae
1 Albidella nymphaeifolia
2 Burnatia enneandra 0.052
3 Limnocharis flava
(HQ456464)
0.082 0.081
4 Limnocharis flava (L2) 0.082 0.081 0.000
5 Hydrocleys nymphoides 0.049 0.049 0.054 0.054
6 Butomopsis latifolia 0.071 0.077 0.074 0.074 0.049
7 Caldesia grandis 0.065 0.074 0.079 0.079 0.060 0.074
8 Limnophyton angolense 0.084 0.082 0.104 0.104 0.077 0.084 0.087
Ngoài ra, cây phát sinh loài (Hình 2) cũng
cho thấy, các loài thuộc họ
Limnocharitaceae gồm (L flava, H
nymphoides và B latifolia) xếp cùng nhau
và xếp gọn bên trong các loài thuộc họ
Alismataceae Theo đó, khoảng cách di
truyền giữa loài L flava, H nymphoides và
B latifolia so với các loài thuộc họ
Alismataceae còn thấp hơn khoảng cách
giữa các loài trong họ Alismataceae với
nhau, chẳng hạn, L flava, H nymphoides
và B latifolia có khoảng cách di truyền so
với loài Caldesia grandis lần lượt là 0,079
và 0,060 và 0.74 Trong khi đó, loài
Limnophyton angolense có khoảng cách di
truyền so với Caldesia grandis lên đến
0,087 (Bảng 2)
Kết quả trên đây phù hợp với các nghiên
cứu gần đây về chỉ thị phân tử trên họ
Alismataceae, các kết quả các nghiên cứu
cho thấy, loài L flava (họ
Limnocharitaceae) luôn có mối quan hệ rất
gần về mặt di truyền so với các taxa thuộc
họ Alismataceae Chẳng hạn, Donald and maryke (1997) xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng mã hóa (coding) của gen lục lạp cho các loài thủy sinh đã cho thấy rằng, các loài thuộc họ Limnocharitaceae (gồm
L flava và H nymphoides) có mối quan hệ
di truyền rất gần với họ Alismataceae Tương tự, Donald and Nicholas (2013) đã
kết hợp 2 vùng gen lục lạp (matK và rbcL)
và nhân (nrITS) cũng cho thấy, các loài thuộc họ Limnocharitaceae xếp gọn bên trong họ Alismataceae trên cây phát sinh loài
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã giới thiệu 1 quy trình tách chiết DNA nhanh và ít tốn chi phí so với các phương pháp hiện tại Ngoài
ra bằng dữ liệu phân tử, nghiên cứu này cũng góp phần xác định lại vị trí phân loại của họ Limnocharitaceae
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DONALD, H L., & MARYKE, A C (1997) Phylogenentic studies in Alismatideae, II: Evulution of Marine Angiosperms (Seagrasses) and Hydrophily Systematic
Botany, 22(3), 443-463
FAZEKAS, A J., KUZMINA, L., NEWMASTER, S G., & HOLLINGSWORTH, P
M (2012) DNA Barcoding methods for land plants In: W.J Kree, D.L Erickson (ed) DNA Barcodes: Method and Protocols Meth Mol Biol, 858, 223-252 PHẠM HOÀNG HỘ (2000) Cây cỏ Việt Nam, tập 3 NXB Trẻ
VĂN HỒNG THIỆN, NGUYỄN PHIA NGÀ, LƯU HỒNG TRƯỜNG (2015)
Homalomena cochinchinensis (họ Araceae): Thử nghiệm marker phân tử và phân tích một số thành phần hóa học Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(4A), 1329-1334