Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất quan trọng và nhiều ứng dụng trong y học. Bài viết tiến hành xây dựng một phương pháp luận dựa trên sinh học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh các mẫu nấm kí sinh côn trùng tại Langbian nói chung và Việt Nam nói riêng.
Trang 1BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LUẬN HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM CORDYCEPS VÀ CÁC CHI LÂN CẬN BẰNG PHÁT SINH CHỦNG LOÀI PHÂN
TỬ ĐA GEN
(ON THE FIRST STEPS TOWARDS A METHODOLOGY TO ASSIST IN THE IDENTIFICATION OF CORDYCEPS AND RELATED FUNGI BY MULTIGENE
PHYLOGENETICS)
Trịnh Văn Hạnh, Ngô Thị Diệp, Nguyễn Thị Bích Thảo, Nguyễn Thị Thu Thảo, Lao Đức Thuận*
Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh
SUMMARY
A methodology was created to assist in the identification process of entomopathogenic fungi (Cordyceps, Clavicipitaceae), a genus with a diverse species content and therapeutic applications The method was formed from creating a reference dataset to assist in the identification process of several samples (1) The dataset includes database of nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1, Tub and Atp6 for related fungi; (2) Gene sequences obtained from fungal samples
of Lang Bian, Lam Dong through DNA extraction by phenol/chloroform method with the assist
of β-mercaptoethanol and CTAB; (3) Molecular phylogenies were analyzed on single gene and multigene trees by MEGA 6.0 software with different tree construction methods (Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Maximum Likelihood (ML) Boostrapping was included to support tree branches The molecular method with the combination of molecular biology and bioinformatics was completely in agreement with morphological-based methods
As a result, DL0038A and DL0038B were reconfirmed as Cordyceps takaomontana (Anamorphic form: Isaria tenuipes), DL004 was reconfirmed asCordyceps neovolkiana.DL0067 was in a very close relationship or is Isaria tenuipes, DL0075 was in a very close relationship or is Cordyceps staphylinicola DL0069 and DL0077 were in a very close relationship with Simplicillium lamellicola or Simplicillium lanosoniveum
Keywords: Molecular phylogenetics, Cordyceps, Clavicipitaceae, Entomopathogenic
fungi
MỞ ĐẦU
Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ
Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps
sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất
quan trọng và nhiều ứng dụng trong y học[3]
Hiện nay, nghiên cứu không chỉ tập trung vào
loài Cordyceps sinensis mà còn mở rộng
nghiên cứu đến nhiều loài thuộc họ
Clavicipitaceae, các loài này được cho rằng có
các hoạt tính y dược quý như C sinensis[4]
Tuy nhiên, việc định danh các loại nấm thuộc
chi này đều dựa trên phân tích hình thái của
Kobayashi(1982)(được xem là tiêu chuẩn
vàng trong định danh) gặp nhiều khó khăn đối
với chi nấm này do (1) sự đa dạng về đặc điểm, cấu trúc của các loài nấm thuộc họ Clavicipitaceae, (2) hệ thống định danh nhóm nấm tồn tại thể lưỡng danh là hữu tính (teleomorph) và vô tính (anamorph) gây phức tạp hóa quá trình định danh[3] Vì vậy, việc xây dựng một phương pháp luận dựa trên việc phân tích cây phát sinh loài phân tử nhằm hỗ trợ cho công tác định danh nấm này đã được chúng tôi tiến hành
Phương pháp luận được xây dựng dựa trên sinh học phân tử kết hợp với tin sinh học ứng dụng trong việc xây dựng cây phát sinh sinh
Trang 2loài đơn gen hay đa gen Nền tảng của phương
pháp luận là (1) sinh học phân tử (gồm chủ
yếu là PCR và điện di giải trình tự) và (2) tin
sinh học (gồm xây dựng cơ sở dự liệu (CSDL),
xây dựng cây phát sinh loài phân tử).Trên thế
giới, việc nghiên cứu phát sinh loài ứng dụng
trong hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng
đã được nghiên cứu trước đây, chẳng hạn
Sung et al (2007) đã sử dụng dữ liệu 5 – 7 gen
bao gồm nrSSU, nrLSU, rpb1, rpb2, Atp6, tub
và tef1 để tiến hành phân tích, nghiên cứu sâu
về quan hệ giữa các chi thuộc họ
Clavicipitaceae, kết quả của nghiên cứu này
đã tái sắp xếp lại các chi liên quan Bộ dữ liệu
công bố của Sung et al (2007) là dẫn liệu đối
chứng chính trong cây phát sinh loài mà chúng
tôi xây dựng Thông tin trên cho thấy sự kết
hợp đa gen góp phần hỗ trợ làm tăng mức độ
tin cậy của cây phát sinh loài và quá trình định danh nấm ký sinh côn trùng (Sung et al., 2007)
Trong nghiên cứu này, Chúng tôi tiến hành xây dựng một phương pháp luận dựa trên sinh học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh các mẫu nấm kí sinh côn trùng tại Langbian nói chung và Việt Nam nói riêng Đồng thời phương pháp luận được kiểm định bởi các mẫu nấm kí sinh côn trùng đã được định danh hình thái gồm: DL004: Cordyceps nevolkiana, DL0038A: Cordyceps takaomontana, DL0038B: Cordyceps takaomontana, DL0067: Isaria sp., DL0069: Simplicillium sp., DL0075: Cordyceps sp., DL0077: Simphicillium sp (Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, 2015)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Kế thừa kết quả nghiên cứu trước của nhóm
TS Trương Bình Nguyên và TS Đinh Minh
Hiệp (2005), trong công bố này chúng tôi sử
dụng 7 mẫu nấm được phân thành 2 nhóm
chính gồm (1) DL004, DL0038A, DL0038B
là nhóm được định danh hình thái đến mức
loài, được xem là nhóm đối chứng để kiểm tra
phương pháp luận mà nhóm xây dựng; đặc
biệt trong nhóm này: hai mẫu nấm DL0038A
và DL0038B là hai mẫu tuy được định danh
đến mức loài bằng hình thái, nhưng hỗ trợ từ
phân tích trình tự ITS chưa đạt kết quả mong
muốn (2) DL0067, DL0069, DL0075 và
DL0077 mới được định danh hình thái đến
mức chi, nhóm này được sử dụng với mục
đích từ kết quả định danh phân tử có thể hỗ trợ
thêm thông tin cho định danh hình thái
Tách chiết DNA, phản ứng PCR khuếch
đại các gen mục tiêu
Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm
được thực hiện bằng phương pháp
Phenol/Chloroform, phỏng theo Chomczynski
và Sacchi (1987) có biến đổi cho phù hợp với
mục tiêu thu nhận DNA (thay đổi chỉ số pH
của phenol từ 4 thành 8) và bổ sung thêm chất
bổ trợ là β-mercaptoethanol và CTAB
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương trình nhiệt bao gồm 95 ºC trong 5 phút (1 chu kỳ), 40 chu kỳ lặp lại với 95 ºC - 30 giây, X
ºC - 30 giây, 72 ºC - 2 phút và 72 ºC - 5 phút (1 chu kỳ) (X là nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho mỗi gen nrLSU: 55oC, nrSSU: 42,5oC, Tef1: 55oC, Rpb1: 46,3oC, Tub: 58,5oC, Atp6: 43oC) Thể tích mỗi phản ứng là 25 µl bao gồm: 12,5 µl buffer PCR, 0,5 µl mồi xuôi và ngược, 7 µl ddH2O và 5 µl DNA Sản phẩm PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 2
% và được tiến hành giải trình tự tại công ty Nam Khoa Mồi sử dụng cho phản ứng giải trình tự cũng chính là các mồi được sử dụng cho phản ứng PCR, được cung cấp bởi IDT (Intergrated DNA Technologies, Mỹ)
Hiệu chỉnh trình tự, xây dựng cây phát sinh loài
Sản phẩm PCR sau khi được giải trình
tự 2 chiều sẽ được kiểm tra bằng phần mềm Chromas Lite phiên bản 2.1.1 cả hai chiều và được hiệu chỉnh hết sức cẩn thận thông qua các phần mềm Seaview, BioEdit, BLAST, … Các trình tự sau khi hiệu chỉnh được sắp gióng cột và đồng bộ hóa với bộ dữ liệu tham chiếu thu nhận từ công trình của tác giả Sung et al
Trang 3(2007) Cuối cùng, bộ dữ liệu được tiến hành
dò tìm mô hình tiến hóa phù hợp nhất theo
chuẩn Bayesian Information Criterion (BIC)
bằng phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al.,
2013)
Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần
mềm MEGA phiên bản 6.0 (Tamura et al.,
2013) Các phương pháp được sử dụng để xây
dựng cây phát sinh loài bao gồm: Neighbor
joining (NJ), Maximum parsimony (MP) và Maximum likelihood (ML) và mô hình tiến hóa phù hợp nhất từ kết quả dò tìm bằng phần mềm MEGA 6.0; Cây phát sinh loài được đánh giá bằng phương pháp bootstrap lặp lại
1000 lần với mức đạt ý nghĩa khi giá trị ủng
hộ lớn hơn 50 và so sánh về mặt địa hình học (Topology) với cây phát sinh loài tham chiếu của Sung et al (2007)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tách chiết DNA, PCR các gen mục tiêu
Xây dựng thành công quy trình tác chiết
DNA tổng số từ hệ sợi nấm bằng phương pháp
phenol/Chloroform có bổ sung
β-mercaptoethanol và CTAB cho kết quả tối ưu,
nồng độ DNA cao hơn (kết quả không trình bày) Chúng tôi đã tiến hành tối ưu hóa thành công quy trình PCR cũng như các nhiệt độ bắt cặp cho từng gene đại diện như trong hình 1
Hình 1 Điện di sản phẩm PCR gen nrLSU, nrSSU, Rpb1, Tef1
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel
agarose 2% cho kết một băng sản phẩm duy
nhất trùng khớp với kết quả khảo sát in silico
và tham khảo từ công trình nghiên cứu của
Sung et al (2007) cụ thể kích thước 950, 1102,
803 và 1040 nucleotides, tương ứng lần lượt
với các gen nrLSU, nrSSU,rpb1 và tef1 (Sung
et al., 2007)
Xây dựng cây phát sinh loài
Các gen sau khi hiệu chỉnh được tiến
hành đồng bộ hóa với cơ sở dữ liệu tham chiếu
của từng gen nrLSU, nrSSU, rpb1 và tef1,
Atp6, Tub được xây dựng dựa trên công trình
nghiên cứu của Sung et al (2007) Các cây
phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm
MEGA 6.0 gồm cây NJ, MP, ML dựa trên bộ
dữ liệu tham chiếu đơn gen của các mẫu nấm
trên cho kết quả về mặt địa hình học (Topology) đều tương ứng với nhau (dữ liệu không trình bày) Tuy nhiên nhằm tăng hiệu quả phân tích, việc ghép các gen với nhau làm tăng chiều dài trình tự giúp tăng độ chính xác, thông qua các thông số về phát sinh chủng loài như giá trị ràng buộc (bootstrap), đơn vị đo khoảng cách biến đổi (substitution) và đồng quan điểm với nhiều công trình nghiên cứu khác trên thế giới, chẳng hạn như nghiên cứu của Sung et al (2007), Johnson et al (2009), Chan et al (2011)
Phương pháp luận hỗ trợ định danh được tái kiểm tra với kết quả định danh hình thái với các mẫu đã được định danh đến mức loài Cụ thể là các mẫu DL004, DL0038A, DL0038B
Trang 4Hình 2 Một phần của cây phả hệ phân tử mẫu DL004 xây dựng bằng phương pháp MP (Các
con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần)
Hình 3 Một phần của cây phả hệ phân tử mẫu DL0038A, DL0038B xây dựng bằng phương
pháp MP (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Dựa trên cây phát sinh loài cho mẫu DL004
(Hình: 3), cho thấy địa hình học của cây NJ,
MP, ML đều tương tự như nhau và mẫu
DL004 phân nhóm với trình tự tham chiếu
Ophiocordyceps neovolkiana (HQ215593,
HM852531) với giái trị bootstrap đạt lần lượt
là 100/100/94 lần lượt trên cây NJ/MP/ML
Giá trị bootstrap > 70% tương ứng với giá trị
xác xuất > 95% thì giá trị phân nhóm được ủng
hộ mạnh mẽ[2] Dựa trên hình thái mẫu
DL004 được định danh là Cordyceps
neovolkiana (Lê et al., 2010) Như vậy, Kết
quả phân tích phân tử đối với mẫu DL004 đều
trùng khớp với kết quả định danh hình thái,
mẫu DL004 được kết luận là Cordyceps
neovolkiana
Mẫu DL0038A, DL0038B khi được xây
dựng cây phát sinh loài đa gen luôn phân
nhóm với Isaria tenuipes (thể vô tính của
Cordyceps takaomontana)[6] với giá trị
bootstrap ủng hộ mạnh mẽ cho sự phân nhóm
trên lần lượt là 98/99/95 đối với 3 cây NJ, MP,
ML Về hình thái, mẫu DL0038A, DL0038B
được định danh là Cordyceps takaomontana
(Lê et al., 2010) Kết quả định danh phân tử
của 2 mẫu trên tương đồng và phù hợp với
định danh hình thái, mẫu DL0038A và
DL0038 được kết luận là Cordyceps takaomontana (thể vô tính là Isaria tenuipes)
Từ những kết quả trên, phương pháp luận mà chúng tôi xây dựng một lần nữa được tái kiểm tra cho thấy kết quả định danh phân
tử hoàn toàn ủng hộ kết quả định danh hình thái Kết quả kiểm định trên giúp cung cấp thêm cơ sở khoa học cho phương pháp luận chúng tôi xây dựng hướng đến ứng dụng định danh đối với các mẫu nấm khác, đặc biệt là đối với các chi nấm Cordyceps và các chi lân cận Đối với mẫu DL0067, DL0069, DL0075, DL0077 đã được định danh hình thái đến mức chi Cụ thể, mẫu DL0067 khi xây dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen đều luôn phân nhóm với trình tự tham chiếu là Isaria tenuipes giá trị bootstrap ủng hộ cao cho
sự phân nhóm này Khi xây dựng cây phát sinh loài đa gen thì mẫu DL0067 lại phân nhóm với DL0038A với giá trị bootstrap trên cả 3 cây NJ/MP/ML lần lượt là 100/100/100 và 2 mẫu nấm này đều phân nhóm với Isaria tenuipes thuộc ngân hàng giống OSC111005 với giá trị bootstrap là 98/99/95 lần lượt trên 3 cây NJ/MP/ML Kết quả cây phát sinh loài đơn và
đa gen thì mẫu DL0067 được định danh phân
tử là Isaria tenuipes (thể vô tính của
Trang 5Cordyceps takaomontana) Hiện mẫu DL0067
đang được tiếp tục nuôi cấy trong phòng thí
nghiệm với mong muốn thu nhận được quả thể
để có thêm thông tin định danh dựa trên hình
thái Kết hợp với định danh hình thái mẫu
DL0067 là Isaria sp (Lê et al., 2010) thì định
danh phân tử cho kết quả đến mức loài là Isaria tenuipes giúp cung cấp thêm thông tin
để hỗ trợ nhóm nghiên cứu định danh sau này Như vậy, chúng tôi kết luận mẫu DL0067 là Isaria sp và có quan hệ rất gần hoặc chính là loài Isaria tenuipes
Hình 4 Một phần của cây phả hệ phân tử mẫu DL0069, DL0077 xây dựng bằng phương pháp
MP (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần)
Về hình thái, tương tự mẫu DL0067 thì hai
mẫu DL0069, DL0077 cũng chỉ mới được
định danh đến mức chi Simplicillium (Lê et
al., 2010) Mẫu DL0069, DL0077 khi được
xây dựng cây phát sinh loài đơn gen luôn phân
nhóm với Simplicillium lamellicola (CBS
116.25) và Simplicillium lanosoniveum (CBS
101267) của chi Simplicillium với giá trị
bootstrap đều ủng hộ cho sự phân nhóm này ở
mức ý nghĩa (kết quả không trình bày) Kết
hợp với cây phát sinh loài đa gen của 4 gen nrLSU, nrSSU, rpb1, Tef1 cũng phân cùng nhóm Simplicillium với các thông số bootstrap của 3 cây NJ/MP/ML lần lượt là 100/90/99.Như vậy, chúng tôi kết luận mẫu DL0069, DL0077 là loài thuộc chi Simplicillium sp và có quan hệ rất gần với loài Simplicillium lamellicola hay Simplicillium lanosoniveum
Hình 5 Một phần của cây phả hệ phân tử mẫu DL0069, DL0077 xây dựng bằng phương pháp
MP (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Trường hợp mẫu DL0075 khi được tiến hành
xây dựng cây đơn gen và đa gen luôn phân
nhóm với trình tự tham chiếu là Cordyceps
staphylinidicola với giá trị bootstrap ủng hộ
cao cho sự phân nhóm của cây đa gen ở 3 cây
NJ/MP/ML lần lượt là 100/100/100 Về mặt
hình thái mẫu DL0075 mới định danh được tới mức chi là Cordyceps sp.Vì vậy, chúng tôi kết luận mẫu DL0075 là loài thuộc Cordyceps sp
và có quan hệ rất gần hoặc chính là loài Cordyceps staphylinidicola
Trang 6KẾT LUẬN
Phương pháp luận dựa trên việc áp dụng kỹ
thuật sinh học phân tử - kết hợp với tin sinh
học được xây dựng thành công hỗ trợ định
danh các loài nấm ký sinh côn trùng Phương
pháp này được chúng tôi khẳng định và tái
kiểm tra trên các mẫu DL004, DL0038A,
DL0038B Kết quả định danh phân tử hoàn
toàn trùng khớp với kết quả định danh hình
thái, các mẫu này được kết luận lần lượt là
DL0038, DL0038B chính là Cordyceps
takaomontana - thể hữu tính và Isaria tenuipes
- thể vô tính DL004 chính là là Cordyceps
neovolkiana Đối với các mẫu nấm chưa thể
định danh đến mức loài dựa trên hình thái, kết
quả định danh dựa trên phân tử cho thấy: mẫu DL0067 được định danh là loài thuộc Isaria
sp và có quan hệ rất gần hoặc chính là loài Isaria tenuipes DL0075 được nhận định là loài thuộc Cordyceps sp và có quan hệ rất gần hoặc chính là loài Cordyceps staphylinidicola Mẫu DL0069, DL0075 được nhận định là loài thuộc Simplicillium sp và có quan hệ rất gần với loài Simplicillium lamellicola hay Simplicillium lanosoniveum Kết quả định danh này cung cấp cho chúng tôi thêm nhiều thông tin cơ sở khoa học cho công tác định danh dựa trên hình thái sau này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Andreas, D, B, Ouellette, B, F, Bioinfomatics A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Methods of Biochemical Analysis, Vol 43, pp 323-359
2 Capote, N., Pastrana, A, M, Aguado, A, and Torres, P, S, 2012.Molecular Tools for Detection of Plant Pathogenic Fungi and Fungicide Resistance, Plant Pathology, InTech
3 Chan, W, H, Ling, K, H, Chiu, S, W, et al (2011), Molecular Analyses of Cordyceps gunnii in China, J Food & Drug Anal 19: 18-25
4 Cummings; John, N, 2009 Entomopathogenic fungi in New Zealand native forests : the genera Beauveria and Isaria, Biological Sciences, 10
5 Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, 2015.Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps ở Tây Nguyên và khảo sát tiềm năng ứng dụng của chúng trong y dược,Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài Sở Khoa Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh
6 Kobayasi, Y, 1982.Keys to taxa of genera Cordyceps and Torrubiella, Transactions of the mycological society of Japan; Vol 23, 329-364
7 Sung, G, H,; Jones, N, L, H; Jae, M, S,; Luangsaard, J, J,; Shrestha, B,; Spatafora, J, W,
2007 Phylogenetic classification of Cordycepsand the clavicipitaceous fungi, Studies
in Mycology; Vol 57; pp.5-59
8 Sung, G, H, Sung, J, M, Hywel-Jones, N, L, Spatafor, J, W, 2007.A multi-gene phylogeny
of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi):Identification of localized incongruence using
a combinational bootstrap approach, Molecular Phylogenetics and Evolution